直接荧光定量法检测肺癌患者血浆游离DNA含量临床意义初探--《2014年浙江省检验医学学术年会论文汇编》2014年
直接荧光定量法检测肺癌患者血浆游离DNA含量临床意义初探
【摘要】：目的探讨血浆游离DNA含量检测在肺癌患者诊断和预后判断中的意义。方法收集肺癌患者和健康体检者新鲜血浆,用picogreen荧光染料直接染色法对血浆游离DNA进行染色,与标准曲线对比得出其含量。结果血浆DNA水平:肺癌组高于正常对照组(P0.05);小细胞肺癌组高于非小细胞肺癌组(P0.05);小细胞肺癌伴转移组高于非转移组(P0.05)。结论肺癌患者血浆游离DNA水平与疾病的发生、发展和预后密切相关,血浆DNA水平检测有助于肺癌的诊断和预后判断。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R734.2;R730.43【正文快照】：
直接荧光定量法检测肺癌患者血浆游离DNA含量临床意义初探@陈洁$宁波大学医学院附属医院检验医学中心
@毛雄英$宁波市医学科学研究所分子诊断中心
@王卫华$宁波大学医学院附属医院检验医学中心
@崔红$宁波大学医学院附属医院检验医学中心
@卢帅军$宁波大学医学院附属
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京公网安备75号DNA血液测试，孕妇产检的新选择 | 科学人 | 果壳网 科技有意思
DNA血液测试，孕妇产检的新选择
羊水穿刺 羊膜腔穿刺 高龄产妇 排畸检查
本文作者:Nell Greenfieldboyce
编者按：如今，高龄产妇越来越多，而她们不得不面临的一个问题就是产前的排畸检测。一直以来，这种产前排畸检测主要采用羊膜腔穿刺等侵入性检测手段，而如今美国有一种新的检测手段大有取代这种检测方法的趋势，对此一些专家发表了自己的看法。
超声波往往被用于产前筛查。怀孕妇女可以选择的几种产前筛查中，这只是其中一种。图片来源：npr.org
（/译）去年怀上第二个孩子的时候，艾米o塞茨（Amy Seitz）心里明白，自己35岁的高龄意味着出现唐氏综合征等染色体异常的可能性增大。她想要做一下筛查，而且她也清楚自己想要的是哪一种筛查——一种非常新颖，与原来的羊水穿刺检测不同的筛查。
这种检测叫做胎儿游离DNA（cell free fetal DNA）检测，是利用怀孕女性的血样分析渗入其血流的胎儿DNA片段。这种技术直到2011年10月才进入市场，而且不受食品和药物管理局（FDA）的监管——FDA不监管这种类型的基因检测服务。好几家公司现在能够提供这种检测服务，包括Sequenom和Illumina。保险是否涵盖因险种而异，医生往往只向那些因高龄等因素而风险较高的女性提供这项测试。
“我记得当初是从家人和朋友那里听说的。”塞茨说，“他们的医生都向他们提供过这种方案。”
对她来说，这种测试听上去很棒。她并不想要羊膜腔穿刺或者绒膜绒毛取样之类的侵入式操作。它们被认为是产前基因检测的黄金标准，但是医生必须把一根针刺入子宫来采集含有胎儿DNA的细胞，这就意味着些许流产的风险。
在羊膜腔穿刺术中，一根针通过孕妇的腹部刺入羊膜腔。羊水样本被抽取出来，用于筛查唐氏综合症之类的基因异常。图片来源：npr.org
“因为会带来风险，我对接受羊膜腔穿刺这样的事情并无兴趣。”她解释道，“因此当我听说了这一种检测，这也成了我对它很感兴趣的原因之一。”
在塞茨曾经生活过的华盛顿市，这种新的胎儿DNA检测方法似乎已经相当普遍了。但是她最近搬到了阿拉巴马州，那里的诊所对其并不熟悉——不过她和医生交谈的时候，了解到一家公司的销售代表刚刚拜访过这家诊所。
“我觉得当时对他们来说这种测试还相当新颖，但是她有兴趣研究一下，看需要做些什么。”塞茨说。
塞茨在去年7月接受了抽血，成为几十万选择了这项新的检测方法而非传统侵入式方法的怀孕妇女之一。医生们说这种方法已经带来了巨大的影响。
“我们这些做羊膜腔穿刺或者绒膜绒毛取样等诊断程序的业内人士已经觉察到这些操作被执行的次数有了大幅下降。”加利福尼亚大学旧金山分校的母胎医疗及遗传学专家玛丽o诺顿博士（Dr. Mary Norton）说，“有些地方报告称这些操作的次数比以前减了半。”
然而她指出，事情发展得太快，医生和患者可能难以了解他们是在应付什么。“它还相当新颖，而且与之前的基因检测方法相当不一样。”诺顿说，“你可以说它是另外一种模式。”
羊膜腔穿刺或者绒膜绒毛取样这样的侵入式检测令医生能够得到染色体的完整信息，并得出可靠的诊断结论。在这项新的检测技术出现之前，唯一侵入性低一些的选项是怀孕母亲接受超声波检查和针对一些特定蛋白质的血检。这种方法能够查出某些异常出现的风险有没有升高，但是它非常不准确，会产生很多误报。
研究证明这种新的胎儿DNA检测方法更加准确，诺顿说。它们把正常妊娠标记为高风险的可能性比较低。“它们比目前的筛查检测精确得多，但它们并不是羊膜腔穿刺那种意义上的诊断检测。”诺顿说，“所以我觉得这造成了一些困惑。”
尽管新的血液测试方法也检查胎儿DNA，但是它无法像羊膜腔穿刺那样给出一个确定的答案，因为它分析的是母亲血液中的胎儿DNA片段，这些片段与母亲自身的DNA混在了一起。
诺顿说，当接受了新型测试而且结果令人担忧的女性被转送到她的中心时，她们往往不理解医生为什么会安排后续的羊水诊断，“因为她们的印象是新的检测和羊水诊断一样准确。”
她担心有些人可能并未经过足以得出确定性结论的检测便终止妊娠，并且举出了去年的一项研究，该研究发现已经有少数妇女那么做了。“至少有部分证据表明这种现象之严重已经超出了我认为我们很多人能够接受的程度。”她说。
这种检测正在得到越来越广泛的应用。一些人担心公司的网站和营销材料并没有把局限交待得足够清楚。
但是李o舒尔曼博士（Dr. Lee Shulman）并不这么看。他是芝加哥西北大学的产科医师和遗传学家，曾为数家检测机构提供咨询。“患者需要了解，尽管这是一种更佳的检测手段，但它并非诊断检测，而且我认为各个公司已经很有效地传达了这一信息。”他说，“不过门诊医师有没有采纳并在意这一信息，并且应用到对患者的咨询服务中，就是另外一回事了。”
他说这项技术太新了，很多医生对其毫无经验，消费者们应当了解到这一点。“如果患者或者说准父母没有得到答案，没有得到令他们满意的信息，他们应当求助于可能更有经验的产前诊断中心、母胎专家、临床遗传学家。”舒尔曼说。
比如说，有一件事情可能会比准父母们预料的复杂一点。除了普通染色体异常的筛查，这些公司还为父母们提供了一个了解孩子性别的机会——时间要比能在超声波图上看出来早好多个星期。
“很多女性对于血检还能让她们准确得知孩子的性别而感到兴奋。”塔夫茨大学医学院的产前诊断专家戴安娜o比安奇博士（Dr. Diana Bianchi）说。
她们或许没有意识到，她说，检测还能够确定性染色体有没有异常。
“大约每700例妊娠中，会有一例出现多一条X染色体或者Y染色体的情况。”她说，同时指出这些都属于较轻微的疾病，通常不会被检测出来，除非孕妇接受羊水诊断之类的侵入式检测。一些身患此症的孩子直到成年都不知道自己的情况，除非出现不育之类的症状。
居住在阿拉巴马州的塞茨认为孩子的性别算是新型血液检测带给她的一项额外好处。不过她事实上并没有得到这项好处，原因是一项文案上的差错。
“在程序中的某一步，性别选项没有被打上勾，所以我们没能在这项检测中得知孩子的性别。”塞茨说。她后来通过超声波检测得知怀的是女儿。胎儿DNA检测确实印证了这个结果。（编辑：粉条er）
文章题图：
npr.org,DNA Blood Test Gives Women A New Option For Prenatal Screening
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也就是说dna血液测试并不能完全替代羊膜腔穿刺检测？
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引用 的话：二代半才是王道……三代就是冰激凌制取设备附加功能而已……四代……太耀眼了……不敢看啊……第四代我打算买来当玩具的，23331、2代太贵（手工一代不算，根本就没设备要求）我是屌丝，舍不得买来当玩具。但是技术成熟，目前2代市场占有率还是最高的。买3代还不如直接4代。
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筛选试验就是筛选试验。。。能取代的也就是筛选试验。。。确诊试验总归是最后一步。。。
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引用 的话：筛选试验就是筛选试验。。。能取代的也就是筛选试验。。。确诊试验总归是最后一步。。。+1
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引用文章内容：“很多女性对于血检还能让她们准确得知孩子的性别而感到兴奋。”塔夫茨大学医学院的产前诊断专家戴安娜o比安奇博士（Dr. Diana Bianchi）说。这个在亚洲国家好像不应该推行吧，至少这个功能不能推。
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作为筛查检测它很实用，因为假阴性低、无创并且不是很贵。跟诊断检测相比，显然准确性有些许差距。但是筛查阳性再去诊断是更理性的选择这个东西现在很多家都能做，不过技术上的一些小细节对假阴性和假阳性还是有影响的，毕竟微量技术玩起来其实都很麻烦，所以最好还是看看服务提供方的技术实力再挑PS：没有医院自己做这个业务的，需要独立实验室而且样本量不上规模成本控制不下来，都是外包出去……
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引用 的话：国内也有公司已经在做了，今年年初被叫停了一次，然后就去办证了，里面大量内幕，咳咳。花大？
引用 的话：花大？嘘……
引用 的话：花大？不要乱猜，圈子小。
引用 的话：不要乱猜，圈子小。(⊙o⊙)
引用 的话：(⊙o⊙)反正我的水表早就查烂了，我今年过了小半年没水的生活你信吗？233
引用 的话：反正我的水表早就查烂了，我今年过了小半年没水的生活你信吗？233好吧，我信了，好可怕~~
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(C)2015果壳网&京ICP备号-2&京公网安备血液中如何提取细菌DNA 急。。。(细菌,血液,上清,低浓度) - DNA技术 - 生物秀
标题: 血液中如何提取细菌DNA 急。。。(细菌,血液,上清,低浓度)
摘要: [血液中如何提取细菌DNA 急。。。(细菌,血液,上清,低浓度)] 本人在做在血液中提取低浓度细菌DNA 遇见了很多问题我现在用的方法是1
在270ul的全血中加入以知浓度的细菌液30vul（如配成10的4次方每ml个细菌）2
4000转 2min离心 取上清3
12000转 2min离心 弃上清4
在沉淀中50ulvchelex－100和150ul水煮液（在TE中加入0 5％的NP40）5
55度水浴30分种
100度 关键词:[细菌 血液 上清 低浓度 假阴性 假阳性 血中]……
本人在做在血液中提取低浓度细菌DNA 遇见了很多问题我现在用的方法是1
在270ul的全血中加入以知浓度的细菌液30vul（如配成10的4次方每ml个细菌）2
4000转 2min离心 取上清3
12000转 2min离心 弃上清4
在沉淀中50ulvchelex－100和150ul水煮液（在TE中加入0.5％的NP40）5
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100度水煮10min7
12000转 2min离心 取上清PCR各位大虾谁知道这种方法是否可行?
还有其它的方法没? 谢谢我用这种方法做出来的结果很不稳定PCR结果在从高到低的浓度中会随机出现假阴性和假阳性 怎么才能解决这个问题？现今在血液中提取细菌DNA最低提取到几次方？？？
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3秒自动关闭窗口人血提取基因组1.基本原理是什么?2.步骤及试剂是什么?
血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA.因此,从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一,破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞；第二,白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三,除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中；第四,在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出.取材 取外周血5ml,EDTA抗凝1.新鲜抗凝血,离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液）,轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟,离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分,加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞,用于后续实验；提取DNA,最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验.
原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏.一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0).2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl.3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml.4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．白细胞处理⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀,加入0.5ml TE⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中.⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混匀.⑷ 60°C水浴1-3hr.2．培养细胞处理：⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次.⑵ 离心4000g×5min,去除上清液.⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液.⑷ 50-55°C水浴1-2hr.（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min.2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中.3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次.5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀.7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液.8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液.9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜.(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：
DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000.
DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度.若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在.OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在.2.电泳检测：
取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同.电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带.三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶.2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制.3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性.4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的.如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化.
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