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胸腺五肽可以给糖尿病的人服用的吗？有没效果的
病情描述：
我是17年的糖尿病最近发现肺有阴影医生说暂时按结核治疗我可以用胸腺五肽吗
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医生建议：是可以吃的。胸腺五肽注射液的功效为：(1)用于18岁以上的慢性乙型肝炎患者。因18岁以后胸腺开始萎缩细胞免疫功能减退。(2)各种原发性或继发性T细胞缺陷病(如儿童先天性)。(3)某些自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)。(4)各种细胞免疫功能低下的疾病。(5)肿瘤的辅助治疗。饮食上要少吃生冷辛辣油腻食物。
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（综述）糖尿病的基因治疗
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这个帖子发布于11年零208天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
糖尿病的基因治疗作者：sovietreds关键词：糖尿病；基因治疗系本人根据研究过程中所读文献写成，并随时更新。糖尿病的基因治疗
胰岛素的表达及分泌
目前糖尿病的治疗方法
胰岛素替代治疗
胰腺或胰岛移植
I型糖尿病的基因治疗
目前实验研究治疗糖尿病的转基因方法
转基因治疗糖尿病的生理和病理突破点
阻断Beta细胞的免疫损害
62.1.1.1.1
通过自身抗原诱导beta细胞特异性T淋巴细胞的免疫耐受
72.1.1.1.1.1
胰岛素及其前体胰岛素原是唯一的beta细胞特异性自身抗原。
72.1.1.1.1.2
82.1.1.1.2
抑制beta细胞的免疫损害
82.1.1.1.2.1
通过Th2细胞因子抑制Th1细胞因子的产生
82.1.1.1.2.1.1
INF-gama单抗、IL-4、IL-10、IL-12P40
82.1.1.1.2.1.2
92.1.1.1.2.1.3
降钙素基因相关肽（CGRP）
92.1.1.1.2.2
改变抗原提呈细胞（APC）功能及活性
92.1.1.1.2.2.1
102.1.1.1.2.3
干扰协同刺激信号
102.1.1.1.2.4
调节细胞凋亡
102.1.1.1.2.4.1
102.1.1.1.2.4.2
其他干扰凋亡级联的分子
102.1.1.1.2.5
抗T细胞单克隆抗体
112.1.1.1.2.6
beta细胞抗体的耐受
112.1.1.1.3
转基因表达胰岛素
112.1.1.2.1
将胰岛素基因通过载体直接导入体内
122.1.1.2.1.1
逆转录病毒载体PLNCX
122.1.1.2.1.2
122.1.1.2.2
建立功能性胰岛素分泌细胞
122.1.1.2.2.1
表达具有活性的胰岛素
122.1.1.2.2.1.1
胰岛素原的加工问题
122.1.1.2.2.1.2
胰岛素单链类似物
132.1.1.2.2.2
胰岛素的分泌调节
142.1.1.2.2.2.1
胰岛素基因的结构
142.1.1.2.2.2.2
beta细胞的分泌途径
152.1.1.2.2.2.3
葡萄糖是控制胰岛素合成分泌的最重要因素
152.1.1.2.2.2.4
GluT2、GK/HK的比值是影响胰岛素分泌调节的关键因素
152.1.1.2.2.2.5
肝细胞是很有前途的靶细胞
162.1.1.2.2.2.6
162.1.1.2.2.2.7
人工可诱导表达系统
逆转代谢紊乱及并发症
162.1.1.3.1
葡萄糖磷酸化功能障碍与转基因表达GK
162.1.1.3.2
心血管并发症
172.1.1.3.2.1
血管内皮生长因子
172.1.1.3.2.2
172.1.1.3.2.3
视网膜病变
172.1.1.3.2.4
172.1.1.3.3
调节基因治疗
干细胞工程
转基因治疗糖尿病的方法学
基因转染的策略
202.1.2.1.1
体细胞介导的基因治疗
202.1.2.1.1.1
靶细胞的选择
202.1.2.1.1.1.1
beta细胞系工程
212.1.2.1.1.1.1.1
RIN细胞系及其改进
212.1.2.1.1.1.1.2
INS-1细胞系
222.1.2.1.1.1.1.3
利用SV40 Tag产生转化的beta细胞系
222.1.2.1.1.1.2
非beta细胞系工程
222.1.2.1.1.1.2.1
垂体前叶ACTH瘤细胞
232.1.2.1.1.1.2.2
成纤维细胞
232.1.2.1.1.1.2.3
242.1.2.1.1.1.2.4
252.1.2.1.1.1.2.5
252.1.2.1.1.1.2.6
252.1.2.1.1.2
基因转移的途径
262.1.2.1.1.2.1
物理和化学方法
262.1.2.1.1.2.2
生物学方法
262.1.2.1.1.3
胰岛素的表达调控
262.1.2.1.1.3.1
有效的生理性调控序列
262.1.2.1.1.3.1.1
PEPCK启动子
272.1.2.1.1.3.1.2
L-PK启动子
272.1.2.1.1.3.1.3
G6Pase启动子
272.1.2.1.1.3.1.4
S14血糖调控元件
272.1.2.1.1.3.1.5
272.1.2.1.1.3.2
通过控制内质网（ER）中的凝聚过程来调控胰岛素的储存和分泌
282.1.2.1.1.3.3
其他真核细胞可诱导性表达系统
282.1.2.1.1.3.4
原核调控元件
292.1.2.1.1.3.5
“自杀”基因
302.1.2.1.1.3.6
302.1.2.1.2
体内直接转基因治疗
302.1.2.1.2.1
体内直接转基因治疗糖尿病的策略
312.1.2.1.2.1.1
非胰岛素降血糖类基因的转移
312.1.2.1.2.1.2
葡萄糖反应性胰岛素基因的转移
312.1.2.1.2.1.3
针对肝脏内诱导beta细胞再生的基因治疗
322.1.2.1.2.1.4
322.1.2.1.2.2
332.1.2.1.2.3
脂质体包被
332.1.2.1.2.4
332.1.2.1.3
基因免疫治疗
表达载体的选择
332.1.2.2.1
腺病毒载体
342.1.2.2.1.1
第一代E1缺乏腺病毒载体
342.1.2.2.1.2
裸腺病毒载体
352.1.2.2.2
逆转录病毒载体
352.1.2.2.3
腺相关病毒载体（AAV）
362.1.2.2.3.1
362.1.2.2.4
362.1.2.2.5
近年来载体的发展
II型糖尿病的基因治疗
381 总论糖尿病，是一种由于胰岛素相对或者绝对缺乏所引起的、具有多种表现形式的疾病1。Ⅰ型糖尿病,或称胰岛素依赖性糖尿病( IDD) 属于自身免疫性疾病。机体对自身胰腺β细胞进行持续攻击,造成β细胞大量破坏，胰岛素分泌严重匮乏。Ⅱ型糖尿病的发病大多在成年，常常与肥胖有关，是由于机体对胰岛素产生抵抗，同时合并胰岛素分泌的相对不足[2], [3]。I型糖尿病的特有方面是beta细胞的自身免疫破坏，II型的特有方面则是效应器官对胰岛素反应性的降低。两者共同的特征则是beta细胞功能的丧失和外周器官因高血糖遭受的毒害。近几年来,糖尿病的发病率持续增长4。截止到1997年，全世界糖尿病患者为1 亿2 千4百万,其中97 %属于Ⅱ型糖尿病。随着生活方式的改变,经济的发展,以及人口结构变化,到2010 年，全球糠尿病患者将达到2 亿2 千1百万。在中国，糖尿病的患病人口为2 000～4 000 万,并在以年发病率75 万人的速度递增。如何有效控制糖尿病及其并发症是当前世界医学领域关切的课题。1.1 预备知识1.1.1 胰岛素的表达及分泌胰岛素基因的表达主要是在胰岛朗格罕氏细胞中，其5'端序列由转录启动子、增强子及负性调控元件组成，约0.5kb，二个胰岛素基因增强子盒（IEB）：-GCCATCTG-分别位于-112bp（IEB1）和-238bp（IEB2），还有4个A盒是人胰岛素基因的启动子（A1，A2，A3，A5）5。蛋白质结合分析实验已证明，有40多种蛋白质因子参与胰岛素基因的表达调控，但目前仅分离到胰岛素增强因子（IEF）和胰岛素上游因子（IUF）。胰岛素的合成是以前体形式存在。在运输途径中经过反以后加工为成熟的胰岛素。最主要的胰岛素促分泌素是葡萄糖。葡萄糖通过其代谢刺激胰岛的朗格罕氏细胞糖分解和胰岛素分泌。葡萄糖的代谢可触发大量电子化学反应，包括ATP敏感K+通路和Ca2+电势-闸门通道的激活。Ca2+增加能广泛影响beta细胞，包括激活磷酸甘油脱氢酶，蛋白酶，磷脂酶C以及其他线粒体酶等。大量研究证实，在对葡萄糖浓度变化的反应中葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖转移因子（GluT）是控制胰岛素释放的关键物质。关于这一点参见下文葡萄糖是控制胰岛素合成分泌的最重要因素。研究显示，葡萄糖本身就是控制胰岛素合成分泌的最重要因素。血糖浓度超过2mmol/L就会通过短期的翻译或长期的转录环节促进胰岛素的产生，一旦血糖基础水平超过5mmol/L，beta细胞就会立刻释放包含胰岛素的颗粒小囊。GluT2、GK/HK的比值是影响胰岛素分泌调节的关键因素。1.2 目前糖尿病的治疗方法1.2.1 胰岛素替代治疗目前临床上需要终身依赖外源性胰岛素替代治疗，但是每日注射胰岛素除给患者带来痛苦和不便外，过量胰岛素应用还可导致严重低血糖。并且由于不能重建正常的血糖调控，常常导致各种严重并发症。外源胰岛素的注射治疗并不符合正常生理反应要求，因为胰岛素皮下注射吸收较慢，且缺乏食物反馈调节作用，而正常胰岛bete细胞能及时、恰如其分地合成分泌机体代谢所需量的胰岛素。1.2.2 胰腺或胰岛移植人们相继发展了胰腺、胰岛细胞移植和胰肾联合移植技术替代功能丧失的胰岛，虽然取得了一定的疗效，但是由于受供体来源不足、外科技术难度、麻醉和手术以及术后感染、出血等外科并发症的高风险、免疫排斥、长期免疫抑制治疗等影响，使其临床应用受到限制。近来发展了免疫隔离装置，如微囊和中空纤维管，使来源相对丰富的异种胰岛如猪的胰岛用于人成为可能。而基因免疫治疗也为移植提供了新的辅助治疗手段，参见下文抑制beta细胞的免疫损害。1.2.3 小结I型和II型糖尿病所面临的共同的临床治疗上的问题来自于长期高血压的慢性作用。因为糖尿病的标准治疗方法不能把血糖控制在有像正常胰岛发挥作用情况下那样相对狭窄的范围内。虽然了解还不多，但人们认为高血糖导致了高反应性的advanced glycation endproducts（AGEs）水平升高6。长期暴露在AGEs的毒性水平下，导致多器官衰竭。临床上，主要导致肾衰竭，视网膜病变，神经系统病变和肢端切除手术。药物或胰岛素导致的低血糖看来是获得完美血糖控制的一个限制因素[7], [8]。但是，近来出现的胰岛素敏化试剂、胰岛素分泌增强子和新种类的胰岛素降低了医源性低血糖的发生率，从而使血糖的控制比以往任何时候都好。新种类的胰岛素的作用持续时间，有的很短，例如lispro and aspart insulin；有的稳定地保持一个平台期而没有峰值，例如glargine insulin。这些新种类的胰岛素和皮下连续灌输胰岛素方法的进展（CSII，还有胰岛素“泵”疗法）为胰岛素的摄入方法提供了更大的灵活性。最近，还有一种优化的胰岛移植治疗方案的发展，使人们对将其作为糖尿病一种可能的治愈方法抱有极大的希望和兴趣9。尽管拥有这些重要的进展，大多数糖尿病人仍然无法获得完美的血糖控制。胰岛素替代疗法主要的问题在于无法精确的模仿胰岛素的天然动力学来控制外源的胰岛素。另一个问题是对全身施用胰岛素时，必须经过静脉和肺循环之后才能通过肝动脉到达肝脏。而胰脏所分泌的胰岛素直接通过门脉循环到达肝脏，与前者差别相当大。激素在体循环和门脉循环中的生理作用有量的差别。虽然大多数成功接受胰岛移植的病人可以不再注射胰岛素，但正常的胰岛素-葡萄糖动力学看来并没有恢复。胰岛移植也受到供体的限制。每例成功的移植至少需要两个供体，常常需要更多。另外，病人必须接受长期——可能是终身的——免疫抑制治疗，承受一切潜在的副作用。除去这些缺点，胰岛素、其他降血糖药物和胰岛移植加在一起，为糖尿病的治疗提供了更大的灵活性，并且总体来说，病人的血糖控制情况比十年前改善了很多。2 I型糖尿病的基因治疗I型糖尿病是一种T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病。受到多基因调控，以胰岛素缺乏及高血糖为其主要特征。发病机制：由自身抗原诱导的beta细胞特异性自身免疫损害。I型糖尿病是由遗传基础和环境因素相互作用而引起的，有17个以上的染色体区与该病的易感性有关。2.1 目前实验研究治疗糖尿病的转基因方法基因转移是指将外源基因导入某种细胞或组织，并使其得以表达。2.1.1 转基因治疗糖尿病的生理和病理突破点2.1.1.1 阻断Beta细胞的免疫损害有时可以被称为I型糖尿病的基因免疫治疗。1986年，Feueren首次采用环胞菌素A，通过免疫抑制的方法治疗糖尿病，并收到一些疗效。此后人们就设想通过导入某种基因来阻断导致糖尿病的某一免疫环节，达到病因学上的治疗。目前公认的遗传学（HLA）和免疫学（自身抗体）指标所检出的高危对象大多数是糖尿病先证者的同胞兄弟姐妹，而大多数新发病I型糖尿病患者并无糖尿病家族史。遗传学指标虽然可以早期检测（胎儿期），但免疫学指标只能在引发beta细胞破坏的自身免疫过程开始之后才能在血中监测到。因此只有更可靠的预测指标及治疗手段的获得，才能尽可能的保存胰岛beta细胞功能，免于自身免疫破坏。随着对该病发病机制及细胞因子在免疫应答中的调节作用等研究的进一步深入，基因免疫治疗不仅对预防糖尿病的发生而且对其治疗均有十分重要的意义。2.1.1.1.1 通过自身抗原诱导beta细胞特异性T淋巴细胞的免疫耐受从免疫发病机制讲，I型糖尿病病因在于中枢及外周免疫系统对beta细胞特异性分子免疫耐受的丧失。胰岛淋巴细胞浸润以及血清高滴度抗胰岛细胞自身抗体的出现，证实了上述假说。基于该假说，可以通过诱导免疫耐受来保护胰岛免于自身免疫的破坏。现在已经开始了这方面的动物实验10。Uno等11发现主要组织相容性II类抗原（MHCII）中I-E分子表达的转基因NOD鼠在19周内无胰岛炎发生，为排除I-E表达仅仅是延迟胰岛炎发生的可能性，他们进一步研究了转基因NOD鼠I-E表达的特点和功能。Northern杂交显示转基因NOD鼠Ead基因表达同BALB/C鼠内源性Ead的表达。混合淋巴细胞反应（MLR）显示，转基因NOD鼠中这种新表达的I-E分子对正常NOD鼠T细胞来说为异源抗原。正常NOD鼠环磷酰胺可以有效引导糖尿病发生，而转基因NOD鼠却能抵抗环磷酰胺引起的糖尿病发生，因此认为I-E分子在预防转基因NOD鼠糖尿病发生中起了重要作用。2.1.1.1.1.1 胰岛素及其前体胰岛素原是唯一的beta细胞特异性自身抗原。如果在淋巴细胞发育早期接触胰岛素原就可能诱导beta细胞特异性的免疫耐受。French等12将鼠胰岛素原II置于主要组织相容性抗原（MHC）II启动子下建立了糖尿病鼠（NOD）转基因模型。胰岛素原基因可以在携带MHCII类分子的细胞，包括胸腺细胞表达，以便去处胰岛素原反应性T细胞。结果发现在转基因鼠中，胰岛内无单核细胞渗出，糖尿病发生被阻止，而唾液腺单核细胞渗出及对卵清蛋白的免疫反应无改变。表明转基因的保护效应是胰岛特异性的，不是总的免疫抑制所导致，胰岛素原的早期表达可诱导胰岛素原特异性CD4+和CD8+T细胞产生耐受。而向NOD鼠及BB鼠胸腺内注射胰岛提取物，也可以阻止糖尿病的发生。在这些研究中，Posselt等认为免疫耐受的发生可能使由于胰岛反应胸腺细胞克隆清除。如果免疫耐受及自身免疫抑制作用发生在胸腺——通过清除可识别胰岛或beta细胞特异抗原的胸腺细胞而造成克隆缺失，那么，可将编码自身抗原的基因导入糖尿病易感患者的胸腺内来诱导免疫耐受。研究发现，腺病毒载体可将目的基因导入胸腺，且可诱导对病毒编码蛋白的耐受，但仍缺乏有关在人类青春期后胸腺转染效率及可行性方面的知识。Ohashi等13建立的RIP-gp转基因鼠中，胰岛beta细胞可以表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白（LCMV-gp）。这些鼠中LCMV-gp特异性T细胞对胰岛表达的LCMV-gp无耐受性，当感染LCMV后，gp特异性T细胞被活化，胰岛内渗出，诱发糖尿病。Ally等14用LCMV-gp构建逆转录病毒载体（RV-gp），转染骨髓细胞表达自身抗原gp，可以诱发特异性T细胞耐受，阻止糖尿病的发生。2.1.1.1.1.2 DNA疫苗DNA疫苗是近几年兴起的一种转基因治疗手段。对于一些糖尿病高危个体，其体内被证实有遗传学和体液性致病标志物存在，但是尚没有进入beta细胞的自身免疫损坏阶段。此时可以利用DNA疫苗预防糖尿病的进展。研究发现，含有谷氨酸脱羧酶（GAD，参见beta细胞抗体的耐受）基因结构的DNA疫苗注射到大鼠体内可以引起体液免疫。如果DNA疫苗的方法能够引起免疫耐受，beta细胞损坏也许是可以避免的。2.1.1.1.2 抑制beta细胞的免疫损害胰岛细胞移植中，胰岛细胞往往受宿主的免疫排斥反应，为克服这一移植排斥反应，有学者考虑利用基因重组技术将具有免疫抑制作用的细胞因子IL-10、TGF-beta和IL-1ra基因分别导入用于移植的胰岛细胞中，从而预防或减轻宿主对移植外源胰岛细胞的排斥反应15，而且因其仅引起局部免疫抑制效应，可减少全身免疫抑制剂的应用。这也是基因治疗的新途径，它赋予基因治疗以新的使命，可能成为移植免疫抑制治疗的新的辅助途径。2.1.1.1.2.1 通过Th2细胞因子抑制Th1细胞因子的产生在自身免疫的发生中，细胞因子的失衡起着重要作用。免疫反应由Th1和Th2细胞之间的平衡来调节。CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞，Th1细胞分泌细胞因子白介素（IL）-2、干扰素（IFN）-gama、肿瘤坏死因子（TNF）等，主要介导细胞免疫，与I型糖尿病发病密切相关，Th2细胞分泌IL-4、IL-10、IL-5等，主要介导体液免疫，这两种细胞因子相互拮抗。2.1.1.1.2.1.1 INF-gama单抗、IL-4、IL-10、IL-12P40体外实验证实，INF-gama对胰岛beta细胞具有毒性作用，而INF-gama的单抗可预防I型糖尿病的发生；IL-4和IL-10强烈抑制Th1细胞分泌INF-gama而减轻胰岛炎，促进beta细胞产生胰岛素而减少该病的发生率；IL-12促进Th1细胞的分化，其水平与胰岛beta细胞破坏程度成正相关，IL-12P40与IL-12受体有很高亲和力而能阻断IL-12的作用。因此，将具有免疫抑制作用的细胞因子基因（如IL-4、IL-10、IL-12P40等）导入到胰岛表达，则在一定程度上能够防止或减缓I型糖尿病的发生、发展，而又不对全身免疫系统产生影响。IL-10可以抑制IFN-Gama和TNF的产生16。将含有IL-10的质粒肌肉注射给NOD鼠，2周后可用ELISA法检测到IL-10的表达，尽管IL-10的表达不能改变胰岛素的严重性，却可显著降低NOD鼠糖尿病的发病率17。有学者18将含有IL-12P40基因的重组腺病毒表达载体转染胰岛beta细胞，并移植到患糖尿病小鼠的肾被膜下，结果使小鼠的血糖连续四周保持正常，移植胰岛素局部产生的IL-12P40抑制了INF-gama的产生，从而减缓胰岛炎的发生。Prudhomme等19人构建了重组INF-gama受体基因表达质粒，肌注糖尿病鼠（STZ诱导）后，血清中表达的INF-gama受体连续数月超过100ng/ml，因抑制INF-gama的作用而延缓了糖尿病的发展。2.1.1.1.2.1.2 TGF-Beta1转化生长因子（TGF-beta1）是一种多效性细胞因子，可直接抑制T细胞（尤其是对活化T细胞20）、自然杀伤细胞（NK细胞）和B细胞的活化，阻止许多炎性细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2）的表达。将含有TGF-beta1基因的表达载体给NOD鼠直接肌肉注射。使胰腺IL-2、IFN2γmRNA 表达明显下降, IFN2γ/ IL-4 mRNA比值下降。TGF-beta1的高表达可抑制迟发性超敏反应，阻止NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生21。2.1.1.1.2.1.3 降钙素基因相关肽（CGRP）CGRP是一含有36个氨基酸的神经肽，主要集中在感觉神经末梢，在所有组织中都具有局部免疫活性。CGRP在体外可以阻止T淋巴细胞产生细胞因子（IL-2、TNF-α、TNF-β、IFN-γ）22。Khachatryan等23将编码CGRPmRNA的人钙调素基因插到质粒PBK-RIP的胰岛素启动子下，用该质粒建立的三个转基因阳性鼠中，其中两个胰腺表达免疫反应性CGRP，其胰腺Beta细胞表达的CGRP可以阻止雄鼠和63%的雌鼠发生糖尿病，表明这一效应是CGRP的局部免疫抑制作用。提示用CGRP转染的胰岛细胞在移植后有可能免受自身免疫反应的损伤。另外如果能使胰岛细胞表达CGRP，则可能阻止糖尿病的发展或降低糖尿病的发病率。Sun等24用电击法将含CGRP基因的质粒转染到糖尿病小鼠的肌肉组织内，表达的CGRP显著抑制T细胞增殖及IFN-gama的分泌，升高IL-10水平，对IL-4、TGF-beta1无影响，说明CGRP通过调节Th1/Th2细胞活性阻止beta细胞的损害，减少I型糖尿病的发生。2.1.1.1.2.2 改变抗原提呈细胞（APC）功能及活性正常情况下，APC处于静止状态，局部受损时，APC可摄取受损处及其周围的抗原，同时产生前炎性因子，包括趋化作用，粘附分子水平亦上调，并可促进APC向周围淋巴器官迁移以激活其他淋巴细胞。因此，胰岛局部的APC，包括巨噬细胞和树突状细胞，可作为基因运载系统的靶细胞。APC转基因表达的分子必须具有：（1）阻止APC活化，（2）阻止APC对抗原的加工，（3）限制粘附分子上调，或（4）促进APC反应淋巴细胞调亡。IL-10通过对MHCII的降调作用抑制单核细胞的抗原提呈能力和减少抗原特异性T细胞增殖25。2.1.1.1.2.2.1 IL-1beta在巨噬细胞活化的早期可产生白介素（IL）-1beta，IL-1beta可通过诱导beta细胞一氧化氮（NO）产生以及触发细胞表面Fas表达来介导beta细胞死亡。因此，可通过基因手段阻断IL-1beta与其信号受体的相互作用或阻断诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）基因的表达，来阻止胰岛炎的发生26。已经证实，将携带IL-1beta受体拮抗蛋白基因的载体转染离体培养人胰岛，可阻止IL-1beta细胞NO的产生和细胞表面Fas的表达，从而避免IL-1beta介导的beta细胞损伤，并纠正糖耐量异常27。2.1.1.1.2.3 干扰协同刺激信号除了T细胞表面受体与APC表面抗原/MHC复合体相互作用外，辅助性T细胞充分活化尚需第二信号——由T细胞表面CD28分子与APC表面B7分子（B7-1和B7-2）构成。阻断CD28-B7相互作用可导致T细胞失活或凋亡。将融合蛋白（CILA4-Ig）——细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CILA4，一种B7受体拮抗蛋白）和IgG的Fc段融合——基因转染离体胰岛并移植至同系糖尿病鼠后，发现CILA4-Ig的局部表达可延长移植物生存期。2.1.1.1.2.4 调节细胞凋亡活化T细胞清除受凋亡机制调控，凋亡是一个受Fas抗原（CD95/APO-1）/Fas配体（FasL, CD95L）介导的死亡过程。FasL在某些组织的表达，如睾丸、角膜被认为是免疫盲区28，这可能使由于Fas+浸润T细胞与组织表达的FasL作用后自身被清除。因此，干扰Fas触发的凋亡及其后通路也可以保护胰岛。2.1.1.1.2.4.1 Bcl-2研究证实，B淋巴细胞瘤/白血病-2（Bcl-2）在离体培养beta细胞的转基因表达可保护其免于一组前凋亡细胞因子诱导的细胞凋亡29。2.1.1.1.2.4.2 其他干扰凋亡级联的分子近来发现许多其他干扰凋亡级联的分子可作为胰岛基因转染的候选分子，来阻止凋亡的激活。例如，新近克隆的一种被称为A20的细胞内锌指蛋白，可阻止肿瘤坏死因子（TNF）和Fas介导凋亡30。2.1.1.1.2.5 抗T细胞单克隆抗体多种抗T细胞单克隆抗体，如：CD3，CD4，CD8，CD45RB，CD40L，TCRαβ等的抗体可以封阻某一类T细胞亚群，减少T细胞的浸润，并可诱导胰岛beta细胞对T细胞的主动耐受。2.1.1.1.2.6 beta细胞抗体的耐受谷氨酸脱羧酶（GAD）是I型糖尿病发病机制中一个关键性自身抗原。已被用于DNA疫苗的研究中，参见DNA疫苗。谷氨酸脱羧酶自身抗体（GAD65Ab）是一种与I型糖尿病密切相关的自身抗体。将GAD65Ab的Fc段基因与IL-4基因同时注入动物体内，可以收到预防NOD小鼠发生糖尿病及减轻糖尿病患病个体病情的作用。热休克蛋白p277（hsp p277）是来源于热休克蛋白hsp60的“免疫调节肽”，是一种重要的自身抗原的靶向抗原。近10年的研究证实，hsp p277能有效地减轻实验动物的胰岛炎。Ras将这一结论扩展到临床，给35位I型糖尿病患者注射hsp p277，10个月中，与对照组比较，患者外源胰岛素的用量没有增加，C肽水平并没有下降。这一结果说明hsp p277对糖尿病具有一定的缓解作用，从动物实验大大向前跨进了一步。2.1.1.1.3 小结尽管上述研究尚处于实验研究阶段，但初步的研究结果表明，通过转基因手段实现特异性T细胞免疫耐受及抑制或阻断胰腺局部的免疫损害，可能会成为最具有希望的I型糖尿病预防及早期治疗方法。免疫基因治疗在十多年时间里进行了大量的实验研究。其中，CD3，hsp p277已深入到临床阶段，在一些病例中已经得到一定疗效。2.1.1.2 转基因表达胰岛素近年DCCT报告结果证实糖尿病并发症的发生与高血糖状态有密切关系，严格的血糖控制可以预防糖尿病并发症31。这促使学者们开始从分子水平考虑利用基因工程技术再造分泌胰岛素的克隆细胞来治疗IDDM。I型糖尿病的自然发展必然会出现胰岛素的绝对缺乏或缺失。目前常用注射外源性胰岛素替代疗法，但这种方法需定时给药、经常检测，而且血胰岛素浓度不符合生理要求。采用转基因治疗方法，利用基因工程再造分泌胰岛素的非胰岛细胞以替代胰岛功能，建立更符合生理要求的血胰岛素浓度释放机制，因为无须免疫抑制而受到关注，是I型糖尿病转基因治疗研究的热点。有时又称为替代基因治疗，即指将一段能分泌胰岛素的基因导入患病个体体内，来弥补和纠正胰岛素的缺乏。其所面临的重要问题包括肿瘤的形成，遗传加工的体细胞胰岛素原的过多分泌及其调控等。2.1.1.2.1 将胰岛素基因通过载体直接导入体内这是进行转基因治疗I型糖尿病的方法之一。Vatera等选择PEPCK启动子和人胰岛素基因构建了嵌合体基因进行的这方面的研究，参见下文有效的生理性调控序列。2.1.1.2.1.1 逆转录病毒载体PLNCXKolodka等32采用逆转录病毒载体PLNCX构造胰岛素基因重组体，经GPAM-12细胞包装后，收集假病毒上清液经门静脉注入肝内，2周后以链脲菌素诱导糖尿病。获得的转基因鼠可以低水平表达胰岛素，阻止酮症酸中毒的发生，禁食24小时血糖正常，无低血糖发生，组织免疫学未发现肝脏有异常表现。2.1.1.2.1.2 缺点体内直接注射胰岛素基因重组载体，有发生随机整合的可能，剂量不易掌握，一旦发生副作用则难以控制。2.1.1.2.2 建立功能性胰岛素分泌细胞鉴于体内直接注射胰岛素基因重组载体的种种缺点，近年来更倾向于体外建立功能性胰岛素分泌细胞，然后回输入体内的方法。这种方法需要解决的问题是：1、能表达具有活性的胰岛素；2、胰岛素的表达具有接近生理的调节能力。2.1.1.2.2.1 表达具有活性的胰岛素2.1.1.2.2.1.1 胰岛素原的加工问题胰岛素原的生物学活性是成熟胰岛素的10%33，它必须经过内肽酶的转化处理，加工为成熟的胰岛素后才能发挥生物学功能。在机体内能够将激素原转化为激素的内源性蛋白酶统称内肽酶，它们一起形成一个超家族，在结构上与酵母Kex2基因产物类似。其中furin和PACE4存在于非内分泌细胞，PC2与PC3存在于内分泌或神经内分泌细胞。此家族的其他成员包括PC4（限于睾丸），PC5，PC6，PC7。在beta细胞内，PC3作用于B链与C肽连接处的Arg-Arg序列，PC2作用于C肽与A链连接处的Lys-Arg序列34，使B链与A链摆脱C肽，仅靠彼此之间的二硫键相连，形成胰岛素的成熟形式。最后由存在于多种细胞中的羧肽酶去除B链C端的Arg-Arg残余部分35。PC2和PC3是钙依赖性哺乳动物蛋白酶中的枯草杆菌蛋白酶成员，仅限于神经内分泌细胞合成大量激素原时表达。神经内分泌细胞（参见垂体前叶ACTH瘤细胞）也有同样的酶。非内分泌细胞的很大问题在于缺乏分泌调节途径和将胰岛素原转换为胰岛素的酶（PC2和PC3），因此Groskreutz等36根据大多数细胞都有Furin蛋白酶的特点，在A、B链与C肽连接酶解位点突变成Furin识别位点，表达出成熟的、具有生物活性的胰岛素。Furin是一种I类跨膜蛋白，广泛存在于多种细胞的高尔基体中，参与多种膜蛋白前体（如胰岛素原受体）及生长因子（如转化生长因子beta病毒糖蛋白）的加工。Furin对氨基酸的序列有特殊的识别要求。只能识别“Arg-X-Arg/Lys-Arg”序列37（X代表任意一种氨基酸）。这就要求对人或者鼠胰岛素原在B-C和C-A连接处引入突变。Falqui等40和Yamasaki等38在这方面作出过尝试。Groskreutz在此基础上还将胰岛素原第10位的组氨酸变为天门冬氨酸，增加了胰岛素在转基因大鼠体内的稳定性。结果表明，在用基因突变改造的人胰岛素cDNA转染的NIH3I3（纤维母细胞）、HeG2（肝）、Cos（肾上皮）和CHO（卵巢上皮）细胞中，将胰岛素原加工成胰岛素的程度与细胞中furin的表达水平相关。在furin含量低的细胞中，需进一步将突变胰岛素cDNA与furin基因共转染，可获得胰岛素原到胰岛素的完全转换39。Arcelloni等40人最近也做过类似研究。另外，Kaufmann等41尝试使非beta细胞表达PC2和PC3来实现胰岛素原的正确加工。2.1.1.2.2.1.2 胰岛素单链类似物胰岛素的三维结构提示，A链和B链可以用少于35个氨基酸来连接。2000年，Lee等42和Olefsky43等用一小段肝肽（Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg）取代正常C肽，构建了具有20%~40%胰岛素活性44的单链胰岛素类似物（SIA）；胰岛素的生物活性可以通过改变组成这一短肽链的氨基酸而变化。他们将编码此胰岛素类似物的DNA插入到经过改造的腺相关病毒中，经静脉注射到糖尿病大鼠和小鼠体内，使目的基因整合到肝细胞基因组中，通过控制肝细胞中的L-PK基因启动子调控胰岛素的分泌。实验发现对胰岛素原分子进行改造后，使其能被肝脏特异性蛋白水解酶剪切，从而分泌具有生物活性的胰岛素类似物（持续8个月），维持糖尿病大鼠和小鼠的血糖正常。在Lee的研究中，糖耐量实验时观察到SIA在糖负荷骤增后3~4小时达到峰值，6小时后恢复基线水平。这种动态曲线虽然在时相上比正常胰岛素有延迟（正常胰岛素30分钟分泌达到峰值，2小时后恢复基线水平），但是在变化形式上保持一致，动物没有出现低血糖情况。试验期间没有发现明显的毒副作用。SIA在STZ诱发的糖尿病大鼠体内和在自身免疫性糖尿病NOD小鼠体内的持续表达时间分别为8个月和5个月。但是此法可能会因为缺少C肽而导致某些生理异常。C肽的释放对糖尿病患者有重要的生理意义，但对健康人却没有影响45。2.1.1.2.2.2 胰岛素的分泌调节胰岛素的表达调控是糖尿病基因治疗的关键。目前，目的基因的导入体内并在靶细胞中表达看来并不困难，但是要使其表达调控达到生理或预想的治疗水平并不容易46。目的基因表达调控包括两个方面：（1）定点插入目的基因，即基因打靶，对外源性目的基因必须进行修饰，使病毒载体包括有与靶位点同样的核苷酸序列。（2）外源性目的基因必须保留自身的调控区或者连接特殊的启动子。分别在胰岛素瘤细胞（RIN，参见下文RIN细胞系及其改进），促肾上腺皮质细胞（AtT-20，参见下文垂体前叶ACTH瘤细胞）和肝HepG2细胞进行了研究[47],
[49]。2.1.1.2.2.2.1 胰岛素基因的结构大鼠胰岛素基因的某些调控序列已经被定位。位于转录起始部位上游40至350bp之间，有所谓增强子区域，这些调控元件中最重要的称为NIR和FAR盒，分别位于核苷酸的-112至-105和-238至-231bp之间。这些区域含有相同的序列（GCCATCTG），对胰岛素基因的转录及细胞特异性表达十分重要。任一序列的突变将导致其活性下降80%至90%，而两个序列的突变可造成所有增强子活性的消失。人类的胰岛素基因位于11号染色体的短臂上，仅由3个外显子和2个内含子组成50。通过研究人胰岛素基因，发现它与大鼠的胰岛素基因调控元件相似，但人胰岛素基因除了包含NIR盒和上游FAR盒外，还有一个cAMP反应元件和类似FLAT元件的区域51。人胰岛素基因表达的调控序列位于基因上游的300个bp内，在这一区域内有启动子和稀疏分布的调节转录的顺式作用元件。其中最重要的元件是E盒和A盒，E盒又分为E1和E2，分别位于转录起始点上游约-103bp（E1）和-230bp（E2）。E1和转录因子IEF1结合，后者是由至少两种蛋白（Beta2和E47）组成的二聚体52。Beta仅存在于beta细胞和一些其他的神经内分泌细胞，而E47广泛分布于组织中。去除E1能明显影响基因的转录。E2更为复杂，它至少结合包括广泛存在的HLH（helix-loop-helix）因子USF等三种蛋白53，E2对基因的转录也起着重要的作用。在人的胰岛素基因启动子中有4个A盒（A1、A2、A3和A5），它们与被称之为IUF1的因子结合（也就是IPF1，IDX1和STF1）[54], [55], [56]。IUF1局限于beta细胞，也有可能存在于内脏的生长抑素分泌细胞，在胰岛的发生过程中，它对决定细胞的谱系起着重要的作用57。在葡萄糖的代谢过程中，IUF1发挥其调节胰岛素基因转录的作用58。另外，VNTR（variable numble of tandem repeats）区大约位于启动子上游200bp处，是一个激素反应元件59。与IDDM遗传相关的IDDM2位点已经被定位于VNTR区60。因VNTR与转录因子（Pur-1）结合，所以它可能也有转录调节功能61。尽管对胰岛素的启动子及其相关的DNA结合蛋白的研究取得了明显的进展，但仍不能设计一个模型来显示这些蛋白是如何与启动子相互作用，控制胰岛素基因的转录。2.1.1.2.2.2.2 beta细胞的分泌途径beta细胞有两种分泌途径62：（1）调节分泌途径，即胰岛素原北包装进储存颗粒，并根据适当的刺激而分泌，如细胞内的钙离子浓度增高。（2）结构通道，它存在于所有类型的细胞中，被用于转移膜蛋白、糖蛋白和其他快速分泌的蛋白至细胞表面。2.1.1.2.2.2.3 葡萄糖是控制胰岛素合成分泌的最重要因素研究显示，葡萄糖本身就是控制胰岛素合成分泌的最重要因素。血糖浓度超过2mmol/L就会通过短期的翻译或长期的转录环节促进胰岛素的产生，一旦血糖基础水平超过5mmol/L，beta细胞就会立刻释放包含胰岛素的颗粒小囊。2.1.1.2.2.2.4 GluT2、GK/HK的比值是影响胰岛素分泌调节的关键因素发现在上述这些细胞中转入葡萄糖转运子2（GluT2），这些细胞在一定浓度葡萄糖下引起最大胰岛素分泌，但这一浓度低于生理性胰岛分泌胰岛素所需的浓度。在RIN细胞培养体系中加入2-脱氧-6-磷酸葡萄糖以防止己糖激酶（HK）的表达，但对GluT2和GK的表达无影响，可获得近似生理葡萄糖浓度下胰岛素最大分泌。此外，GluT2转基因细胞中GK表达增加，但单独表达GK并不出现葡萄糖刺激胰岛素分泌效应，说明GluT2和GK在葡萄糖调节胰岛素分泌中缺一不可。GK在胰岛素释放调节中的重要性从与GK基因突变密切相关的成年型幼年糖尿病（MODY）中得到进一步证实。在这类病人中，GK基因误义突变发生在外显子5、7、8中，此突变可影响酶活性位点结构和酶的稳定，从而影响葡萄糖结合和胰岛素分泌63。GluT-2是在beta细胞中表达的一种主要葡萄糖转移因子异构体，在缺乏葡萄糖刺激胰岛素分泌和类似人类NIDDM特征的啮齿类动物胰岛细胞中明显减少64。研究表明，GluT-2的高Km值有利于beta细胞摄取葡萄糖，保持细胞内外的葡萄糖浓度达到平衡65。然后，葡萄糖被葡萄糖激酶磷酸化，高Km葡萄糖激酶（11mmol/L）是通过糖酵解途径调节流量的重要限速酶。增加beta细胞内葡萄糖的代谢引起ATP/ADP比值增高，导致细胞表面的ATP依赖性钾通道关闭。细胞膜的去极化激活电压依赖性钙通道，Ca2+进入细胞内刺激胰岛素储存颗粒向胞外排放。根据这些研究，当细胞外的葡萄糖或其他的促分泌物质变化时，细胞内的一些蛋白参与胰岛素分泌的调节，如葡萄糖GluT-2，葡萄糖激酶和ATP敏感性钾通道。现在认为：GluT2、GK/HK的比值是影响胰岛素分泌调节的关键因素，通过合理调整细胞内这三种成分表达的比例，有希望获得更符合生理要求的功能性胰岛素分泌细胞。2.1.1.2.2.2.5 肝细胞是很有前途的靶细胞肝细胞由于可以表达与胰岛beta细胞相似的GLUT-2和葡萄糖激酶基因，且肝细胞在中间代谢、代谢产物的存储方面发挥关键作用，因而被认为是糖尿病基因治疗非常有前途的靶细胞。Simpson等49研究发现，稳定转染含有人胰岛素cDNA的质粒后，肝细胞瘤细胞可通过成分性合成途径合成、贮存、分泌胰岛素，cAMP类似物可快速调节其释放胰岛素，但其胰岛素的释放不受生理性刺激物葡萄糖的调节。而当稳定转染人葡萄糖转运子（GLUT）-2cDNA后，其对葡萄糖的敏感性恢复。但正常beta细胞含有特异性肽酶PC2和PC3，可加工前胰岛素原为成熟胰岛素，并调节胰岛素释放，而肝细胞不具有。将含有PC2和PC3基因的质粒共转染靶细胞或将普遍存在的蛋白内切酶furin/PDCE4（参见表达具有活性的胰岛素）识别切割序列插入人胰岛素原cDNA中，将有助于靶细胞分泌具有生物活性、成熟的胰岛素。2.1.1.2.2.2.6 包被移植为了防止移植后转染细胞持续大量增殖，分泌过多胰岛素导致危及生命的低血糖，Taniquchi等66将待移植的转染细胞用具有半透性的5%琼脂糖凝胶包被后移植，可防止移植后细胞的过度增殖，从而获得胰岛素持续平稳表达。但移植后30天，组织学发现囊周存在炎症反应，这可能造成包被细胞的功能不良，从而影响其分泌胰岛素。2.1.1.2.2.2.7 人工可诱导表达系统参见下文胰岛素的表达调控。2.1.1.3 逆转代谢紊乱及并发症I型糖尿病代谢紊乱是胰岛素缺乏的必然结果。长期糖、脂肪等代谢紊乱会引起许多并发症的发生。2.1.1.3.1 葡萄糖磷酸化功能障碍与转基因表达GK在I型糖尿病中，存在葡萄糖磷酸化功能障碍，肝内GK表达下降。Ferre等67将GK cDNA置于PEPCK启动子下，构建成PEPCK/GK嵌合体基因，经显微注射法建立转基因鼠模型，然后用链脲菌素诱发糖尿病。转基因鼠表达GKmRNA水平和酶活性增加，其增加水平与细胞内6-磷酸葡萄糖和糖原水平增加相关。肝内丙酮酸激酶活性和乳酸增加，使参与葡萄糖生成和酮体生成的基因表达正常化。血糖、酮体、甘油三酯、自由脂肪酸水平恢复正常，而且这些作用并不依赖胰岛素的存在。表明通过转基因表达GK可以促进葡萄糖磷酸化，纠正糖尿病中一系列代谢紊乱。2.1.1.3.2 心血管并发症心血管并发症是I型糖尿病最常见并发症之一。2.1.1.3.2.1 血管内皮生长因子通过转基因的方法将血管内皮生长因子（VEGF）转入NOD鼠中，可以促进转基因鼠缺血组织中VEGF的表达，促进组织中新生血管的形成，改善血液供应68。Schratzberger等69将含VEGF的质粒直接注射到糖尿病大鼠的肌肉组织，4周后，治疗鼠神经的血管和血流与正常鼠相似，周围神经功能受到保护。2.1.1.3.2.2 载脂蛋白E将载脂蛋白E（apoE）转入小鼠体内，肝内表达apoE可以降低血浆甘油三酯和胆固醇水平，阻止动脉壁脂肪酸斑块的形成70。2.1.1.3.2.3 视网膜病变Murata等71将beta-半乳糖苷酶基因经反转录病毒转入视网膜光凝固点附近，5天后检测到表达，持续12周。该研究结果提示血管内皮生长抑制因子治疗糖尿病视网膜病变的可能性。2.1.1.3.2.4 小结这些结果表明转基因治疗可以预防糖尿病心血管并发症的发生。2.1.1.3.3 神经系统Goss等72以复制缺陷性单纯疱疹病毒（HSV）为载体将神经生长因子（NGF）基因转导至背根神经节或腹股沟脂肪组织内，其表达产物能阻止糖尿病鼠感觉神经振幅的降低。2.1.1.4 调节基因治疗与前几种方法相比，调节基因治疗可说是一种崭新的理论。在胰岛beta细胞发生、发育、分裂的过程中，需大量因子进行调节。各种基因的开启，各种蛋白质的失活与激活都由一套精密的程序决定。基于这一理论，人们将胰岛beta细胞发生、发育所必需的因子导入体内来促进beta细胞的成熟。虽然至今已发现几十种与胰岛beta细胞生长发育调控相关的因子，有些因子甚至已经发现了三十余年。能用于进行这种改造的理想细胞必须具备如下特征：能实现葡萄糖依赖性的胰岛素基因转录；胰岛素原可以被转化为成熟胰岛素；能表达GluT-2、GK和己糖激酶（HK）等葡萄糖生理性分泌所依赖的“传感器”74。现有研究表明，肝细胞是最与beta细胞类似的候选细胞。胰腺十二指肠同源异形盒基因1（PDX-1）是调节胰腺发育、胰岛细胞功能和胰岛素基因表达的重要因子。在胚胎发育过程中，缺乏PDX-1基因将导致胰腺发育不全，影响胰腺上皮的分化、增殖。在成熟的胰腺细胞中，PDX-1还与GluT2、GK等因子相互作用，共同调节胰岛素的分泌。2000年，Ferber等73将重组有PDX-1基因（以beta-半乳糖苷酶为对照）的第一代腺病毒载体（FGAd）注射到糖尿病小鼠（BALB/c和C57BL/6）体内，发现只有肝脏出现PDX-1基因和胰岛素基因的异位表达。另外，在小鼠肝细胞内还出现了只在内分泌细胞内存在的激素原转化酶（PC3/PC1）。在转染后的1周内，小鼠的血糖从33.3mmol/L下降到11.1mmol/L，显示了良好的治疗效果，与对照组小鼠比较，其肝脏胰岛素的含量是前者的25倍，血液中的胰岛素水平是前者的3倍，从肝脏中提取的胰岛素约60%是完全加工的。人们74推测PDX-1的作用可能与两种机制有关：（1）它可能激活了肝脏中的胰岛素基因，表达出持续、低水平的胰岛素；（2）也可能是影响了肝细胞的发生和分化，将肝细胞（1%以下）诱导转变为胰岛beta细胞（的表现型），并根据体内血糖的水平而合成、释放胰岛素。若假设成立，人们就有可能在体内改造出符合生理要求的胰岛素分泌细胞，从而省去了在体外构建调控序列的工作，和胰岛细胞移植所带来的排斥反应及对免疫抑制剂的依赖。但是，还不清楚能进行这种分化得肝细胞的确切特点，另外这些肝细胞合成的胰岛素不能在细胞内储存并按需分泌。这种方法所面临的问题还有：如何达到大量安全、稳定的载体，保障其从血流中离开、选择性转移到靶细胞内，同时没有引入毒性、免疫原性和病原性。虽然目前PDX-1基因的作用还不足以达到公认，但此发现无疑将对糖尿病的治疗具有重大意义。Kojima等75近期的研究验证了Ferber等人的前瞻。他们向链脲菌素诱导糖尿病鼠的肝中转移了两种不同的转录因子Pdx1和Beta2（又称NeuroD，写作NeuroD/Beta2），使用了HDAd（参见裸腺病毒载体）作为载体。Pdx1诱导的短暂的降血糖效应呈现剂量效应，但是能够完全逆转高血糖的剂量使小鼠呈现病态，停止进食并死亡。尸检显示产生胰岛素的细胞十分靠近肝脏的门脉三岔体。还有发生严重肝炎的证据，而这通常不发生在HDAd介导的治疗中。进一步的分析显示出小鼠同时表达了外分泌胰腺产生的一种消化酶——胰蛋白酶。胰岛素和胰蛋白酶由这些小鼠中相同的细胞同时产生，这是短暂的降血糖效应的原因。表达胰岛素的细胞很快就因为共表达的胰蛋白酶的自身降解作用而死亡。这严重限制了其治疗效果的持久性。回顾一下，Pdx1促进外分泌和内分泌的功能是已知的。天生缺失Pdx1作用的鼠类和人类没有胰腺——也就是说，外分泌和内分泌胰腺都没有7677——而且我们知道，在整个胚胎发育过程中Pdx1的分化功能是既包括外分泌又包括内分泌胰腺细胞系的78。NeuroD/beta2在Pdx1下游发挥功能。因为NeuroD/beta2功能缺陷的鼠或者人会患糖尿病而且呈现引人注目的胰岛紊乱现象，Kojima等人尝试将NeuroD/beta2作为下一个候选的治疗基因。用HDAd介导NeuroD/beta2转移至糖尿病鼠的肝脏中，使得高血糖症状显著改善。加上一个胰岛生长因子betacellulin（beta动物纤维素？），使糖尿病完全逆转。小鼠开始在血清中表达正常水平的胰岛素，腹腔注射方式进行的葡萄糖耐受试验显示出基本正常的反应。HDAd-NeuroD/beta2处理的鼠在肝脏发生胰岛素的转录和蛋白质的产生。免疫组化分析在肝脏中探测到胰岛簇的出现。大部分这种簇位于肝囊下。肝中“胰岛”里的细胞产生胰岛素，也产生正常胰岛的其他基本激素胰高血糖素、生长激素抑制素和胰腺多肽。他们产生和分泌成熟胰岛素因为他们表达激素原转化酶PC1/3和PC2，也具有ATP-敏感性钾离子通道亚基Kir6.2和SUR1。值得注意的是，免疫电镜分析观测到在缺乏肝细胞特征的这些内分泌细胞囊泡中的胰岛素颗粒的存在。简言之，NeuroD/beta2基因转移到肝脏通过诱导肝脏中胰岛的再生导致小鼠糖尿病的康复。我们说一种策略有希望并不意味着我们接近了其临床应用。大多数由NeuroD/beta2基因治疗诱导的“胰岛”细胞会产生一些胰岛激素，表明这些新生“胰岛”是不成熟的。除了Pdx1， NeuroD/beta2是唯一测试过的可能具有诱导胰岛再生作用的治疗基因。NeuroD/beta2上下游的其他基因也应该尝试一下，也许其中一些回诱导出更为成熟的胰岛。也可能其中一些因子的联合使用会比单独使用效果更好，NeuroD/beta2和胰岛生长因子betacellulin的联合疗法就显示了这一点。另一个令人感兴趣的问题是由NeuroD/beta2基因转移所诱导产生的胰岛是否是“永久”的。近来Ber等79的研究表明Pdx1诱导的胰岛素分泌细胞在FGAd-Pdx1载体消失之后能继续存在很长一段时间。虽然对胰岛再生过程的更深入的了解并不是在人类中成功应用所必需的，但因为有助于引出其他可行途径，也是受到欢迎的。2.1.1.5 干细胞工程干细胞工程是当今生命科学领域最热门的话题，在过去的两年里，围绕干细胞工程的实验研究让人们看到应用干细胞工程技术治疗包括糖尿病在内的许多疾病的光明前景。干细胞（SC）是一种具有自我复制和分化能力的独特细胞群体。虽然成年哺乳动物许多组织中都含有干细胞，但是成年干细胞只能发育为有限的细胞类型。相反，来自哺乳动物早期胚胎，处于囊胚期的胚胎干细胞（ESC）可以分化形成机体的所有细胞类型。ES具有正常的染色体核型，保持高度的端粒酶活性，表现出显著的长期分化潜能，从而使处于培养中的细胞可以无限期扩增80。而且，与体内胚胎细胞所有胚层的分化方向类似，它们可以演化成所有细胞。因为人类ES细胞具有无限增殖和多向分化的能力，ESC可以提供人类移植的组织来源，并用于许多疾病如帕金森病，糖尿病和心脏衰竭等的治疗。利用干细胞进行治疗性克隆的基本思路是从病人体内获得体细胞的细胞核，从供者体内得到去核卵母细胞，经过细胞核转移操作，在体外培养“杂交”细胞直至得到胚胎干细胞。控制胚胎干细胞的体外扩增并进行定向诱导分化，最终获得想要得到的各种组织，如胰腺胰岛细胞，血细胞，心肌细胞，神经细胞，肝细胞等等。胰腺干细胞是将从人工培育或人工流产的胚胎里提取的细胞、成人胰腺组织或其他组织中分离的细胞通过体外培养，诱导、分化而成的永生的胰岛细胞，可移植到患者体内“传宗接代”，源源不断地分泌胰岛素，从而达到控制血糖、彻底治愈糖尿病的目的。用于实验研究的干细胞有以下种类。全能干细胞：包括胚胎干细胞（ESC）、胚胎生殖脊细胞（EGC）及胚胎瘤细胞（ECC）。多能干细胞：当前研究最多的是骨髓来源的干细胞。已有研究证实，骨髓来源的干细胞可以分化为肝脏细胞、神经细胞等。由此推测，其可能具有向胰岛细胞分化的潜能，但这种推测尚未得到证实。定向干细胞：包括胚胎胰腺干细胞、胰腺导管细胞和胰岛来源的干细胞。Soria等81将胰岛素基因转移到小鼠胚胎干细胞，在体外对ESC进行特殊培养及分化诱导，得到来自ESC的产胰岛素细胞克隆，输入到糖尿病小鼠体内后可以治疗糖尿病。这种产胰岛素细胞克隆可以在体内持续表达，可以加工胰岛素原为成熟胰岛素，可以针对血糖变化做出生理性调节反应。缺点是存在移植物排斥反应和自身免疫系统对新“beta细胞”的再攻击。Soria等82建立了一整套体外培养，诱导分化和筛选的方法，使R1大鼠的ESC转变为可分泌胰岛素的beta细胞。等83也进行了类似在体外诱导人类ESC分化为胰岛素产生细胞的研究。除了胚胎干细胞外，一些器官内的成年干细胞同样可以自我复制和更新，并保留分化潜能。Vijayakumar等84在体外从未发病的非肥胖性（NOD）糖尿病小鼠胰腺导管内分离出胰岛干细胞，随后诱导胰岛干细胞分化为胰岛细胞。注射入糖尿病小鼠后治疗糖尿病。这种胰岛细胞具有生理性调控分泌机制，可以产生成熟胰岛素。在这些基础上，Valéry等85还创建了新的从胰腺导管和胰腺外分泌组织中分离提取导管上皮细胞进而将其诱导分化为胰岛细胞的方法。这种技术可以获得数量更多，活力更强的胰岛细胞，但移植后仍会出现排斥反应。Ramyia等86从未发病的成年NOD小鼠的胰腺导管上皮结构中分离出胰岛干细胞，在体外诱导分化为胰岛后，移植到已发病的NOD小鼠的肾囊或皮下组织，能够逆转其糖尿病的发生。人胰腺导管细胞也已经被成功分离并诱导分化为胰岛细胞87，但尚未证实其是否有降低血糖水平的功能。另外，从人和大鼠胰岛中已分离得到Nestin染色阳性的细胞，在体外培养下可分化为胰腺外分泌细胞、导管细胞和内分泌细胞以及肝细胞。Yang等88则证实在高糖环境下成年大鼠肝干细胞可分化成胰岛内分泌细胞，具有分泌胰岛素、胰高血糖素及胰多肽等激素的功能。2.1.2 转基因治疗糖尿病的方法学有人认为，一个成功的基因治疗由以下几部分构成：（1）有效的胰岛素基因转载系统；（2）根据血糖对胰岛素进行准确调节的系统；（3）将胰岛素原加工成胰岛素的装置；（4）合适的宿主细胞。2.1.2.1 基因转染的策略2.1.2.1.1 体细胞介导的基因治疗体细胞介导的基因治疗（ex vivo）即将靶细胞取出，在体外培养并导入重组基因再重新植入体内。早期发现成纤维细胞、肝细胞和神经内分泌细胞经转导人前胰岛素cDNA后均能合成分泌胰岛素，转染的阳性克隆细胞，注射于糖尿病鼠腹腔后，糖尿病鼠高血糖状态明显改善，体重恢复[89],
[92]。2.1.2.1.1.1 靶细胞的选择选择用于基因治疗的靶细胞必须参考以下原则：细胞容易取材，体外培养有较高的生长效率，容易进行遗传学改造，以可以控制的方式进行增殖，体内存活期较长，无论是培养时还是在体内都有稳定的表型。根据Newgard等90的观点，基因改造分泌胰岛素的细胞系应具备以下的细化的理想特性：分泌足够量的胰岛素；如同时分泌其他激素，应以分泌人胰岛素为主；以调节分泌途径为主（胰岛素的基础分泌量低）；高效、彻底地将胰岛素原加工为胰岛素；在生理范围内对葡萄糖刺激分泌胰岛素；正确的感受阈（≥4mmol/L葡萄糖）；适当的反应强度；适当的反应动力学；在体内外具有稳定的基因型和表型；设备相容性；便于大规模扩增；便于进一步基因改造。传统用于糖尿病基因治疗的靶细胞有胸苷激酶缺乏的成纤维细胞、肝细胞和垂体前叶ACTH瘤细胞。有人将胰岛素原基因的表达载体分别转染上述靶细胞后，在糖尿病鼠体内外均出现胰岛素的表达，并取得一定的降血糖效果[91],
[错误！未定义书签。],
[92]。但这些靶细胞对于糖尿病基因治疗尚存不足。2.1.2.1.1.1.1 beta细胞系工程用胰腺移植治疗糖尿病有许多困难。Beta细胞工程可以避免胰腺的分离及纯化。成人的beta细胞是分化最复杂的细胞之一，不能在培养基中生长及分裂，但是目前已得到一些无限繁殖的beta细胞系。这些细胞系的优点是具有beta细胞表型，包括胰岛素的合成、分泌以及相关基因的表达；不足之处是多数beta细胞系失去了对葡萄糖刺激的正确应答能力，而且在移植后仍有可能受到移植受体胰岛自身免疫破坏机制的损伤，但是可以通过免疫隔离移植来阻止免疫损伤的发生。Beta细胞系移植还需要克服细胞在体内无限制生长的问题。解决途径之一是通过控制移植细胞的生长来调节胰岛素释放量，建立条件转化的beta细胞系，使其含有能够控制细胞进行生长分裂还是保持分化状态不生长的遗传开关，可参见下文利用SV40 Tag产生转化的beta细胞系中Efrat等的研究。2.1.2.1.1.1.1.1 RIN细胞系及其改进RIN1046-38细胞系来自放射线所致的胰岛素瘤，GluT-2和GK基因在其中表达，但是在培养过程中逐渐丧失葡萄糖刺激分泌胰岛素的能力47。Ferber等93发现在这些细胞中葡萄糖刺激胰岛素分泌与GluT-2和GK的表达有关，把含GluT-2 cDNA的质粒转染到RIN细胞中，可以观察到葡萄糖刺激胰岛素分泌，但是转染含GK cDNA的质粒后不能提高葡萄糖刺激胰岛素分泌能力，有意义的是当GluT-2表达增强后GK活性也相应增强。将含GluT-2基因的RIN细胞在含2-脱氧葡萄糖培养基中培养24小时后，细胞能在葡萄糖浓度50μmol/ L~5mmol/L范围内刺激胰岛素分泌。Clark等94进一步对RIN1046-38细胞进行改造，将多拷贝的人胰岛素基因转染给RIN细胞，这些细胞系胰岛素含量大大增加，与正常人的胰岛细胞相似，同时用HPLC分析在这些细胞中胰岛素加工的效率相当高，进一步将GK和GluT-2基因导入细胞系后，发现这三种转基因的表达可持续0.5~1年。将这些人工细胞系移植到裸鼠体内所有的转基因至少表达48天。这些结果提示导入所构建的细胞系的优点是能保持功能及表型的稳定性，特别是在活体内。同时该小组还研究了这些新构建的胰岛素瘤细胞系的胰岛素分泌能力及葡萄糖代谢的调控。含人前胰岛素基因的beteGI/17细胞系胰岛素分泌量明显比RIN1046-38高，导入GluT-2和GK基因的betaG49/206和导入GK基因的betaG40/110细胞系的胰岛素分泌量比betaGI/17要少，但是后二者葡萄糖刺激胰岛素分泌能力增强。Hamid等95用藻酸钠珠包裹胰岛素分泌细胞系BRIN-BD11，在16.7mmol/L葡萄糖、10mmol/L精氨酸、10mmol/L丙氨酸的分别刺激下，其分泌胰岛素较未包裹细胞增加1.5，2.9及4.2倍。2.1.2.1.1.1.1.2 INS-1细胞系由Asafari等96分离出的INS-1细胞系保留了不同于beta细胞的许多特征，主要是胰岛素含量高，以及葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应超过了生理浓度。INS-1细胞能分别表达GK和GluT-2。Sekine等97将INS-1细胞在含催乳素、IGF-1和Tridothyronine的无血清培养基中生长，3天后，生长在无血清培养基中的INS-1细胞对葡萄糖、丙氨酸、亮氨酸的反应能力降低，而对30mmol/L K+的反应稍微增强。高血糖素样多肽-1（GLP-1）可促进胰岛素的释放，胰岛素瘤细胞系INS-1既可分泌胰岛素，又能分泌少量GLP-1。Chepurny等98通过转基因技术使INS-1细胞过度表达GLP-1受体，GLP-1与GLP-1受体相互作用促进INS-1细胞分泌胰岛素。2.1.2.1.1.1.1.3 利用SV40 Tag产生转化的beta细胞系另一种产生转化的beta细胞系的方法是在细胞中导入病毒癌基因SV40 T抗原（SV40 Tag）基因。SV40 Tag通过隔绝肿瘤抑制基因p53和RB基因的产物而起作用。无限繁殖的细胞系中胰岛素基因启动子通常和编码SV40 Tag基因连接，这种DNA结构注射入小鼠胚胎，然后移植入假孕的雌鼠中，在其子代中SV40 Tag仅在beta细胞中表达，生长成肿瘤，分离beta细胞肿瘤即产生细胞系。存在的问题是SV40 Tag保留了某些转化活性，产生的细胞系趋向于再分化99。成功的案例参见原核调控元件，Deuschle、Effrat等人作出了有意义的研究。2.1.2.1.1.1.2 非beta细胞系工程非beta细胞工程有二种方法，一是把胰岛素基因及其必需的基因直接导入来自糖尿病患者的原代细胞；二是将胰岛素基因导入非beta细胞，这些细胞是在培养基中生长，移植时需要微胶囊化。其优点是可以避免被移植受体的beta细胞自身免疫系统识别和破坏。表格 1 胰岛素基因治疗中非beta细胞靶细胞的几个特点特点靶细胞肝脏下丘脑肌肉K细胞葡萄糖敏感系统+--+胰岛素原加工酶-+-+葡萄糖可调节的启动子+--+胞吐系统-+-+2.1.2.1.1.1.2.1 垂体前叶ACTH瘤细胞垂体前叶ACTH瘤细胞作为神经内分泌细胞具有一般内分泌细胞分泌激素特有的结构和功能，含有胰岛细胞同样的调节分泌通路。已经证实AtT-20ins细胞分泌颗粒中含有Beta细胞分泌颗粒的肽酶PC2和PC3，因而能够加工胰岛素原为成熟的胰岛素[100], [101]。但其分泌的其他多种肽类激素，有可能对胰岛素产生拮抗作用而限制其进一步应用。大鼠的垂体细胞AtT20细胞系稳定地导入胰岛素基因后构成AtT20ins细胞，能有效地把前胰岛素加工成胰岛素。该细胞系能对cAMP等类似物有反应，能刺激细胞释放胰岛素，但是对葡萄糖不敏感[89],
[92]，而且GK表达水平低下，而GluT-2表达缺失[102],
[103]。Hughes等48将GluT-2基因转染到AtT-20ins细胞系，显示胰岛素含量增加，葡萄糖直接刺激胰岛素的分泌，而且在亚生理状态的葡萄糖浓度有最大的反应性。但是导入GluT-1基因后则不能增加胰岛素释放或生物合成，因此，只有GluT-2转染细胞才能在外源葡萄糖变化的较短时间内分泌胰岛素，而且当葡萄糖刺激消失时胰岛素分泌迅速减少（即呈双向反应，类似于正常beta细胞的胰岛素的双向反应）。但是已有数据表明该细胞系胰岛素分泌量最大在10~15mmol/L葡萄糖浓度（另说104刺激细胞分泌最大量胰岛素的葡萄糖浓度为50μmol/L~20mmol/L），大大低于正常细胞反应开始的浓度（葡萄糖刺激阈值）。另有研究中AtT20细胞被导入含金属硫蛋白启动子的人胰岛素cDNA，参见下文其他真核细胞可诱导性表达系统。 存在的问题是，进一步的体内移植实验表明，神经内分泌细胞分泌的其他多种肽类激素，有可能对胰岛素产生拮抗作用甚至产生严重的代谢功能紊乱。2.1.2.1.1.1.2.2 成纤维细胞胸苷激酶缺乏（Ltk-）的成纤维细胞易获取、体外培养、增殖、转染和移植回体内并表达分泌蛋白质，还可能根据需要从体内移去，但缺乏加工胰岛素原的酶（PC2和PC3），使基因治疗的效率降低。Kawakwi等91利用免疫监测系统对转导细胞的胰岛素分泌量进行了研究。将对宿主动物免疫源性很低的CD8.2抗原再导入于成纤维细胞，发现CD8.2单克隆抗体（MAb）可以消除已植入小鼠体内的成纤维细胞。一旦发现转导成纤维细胞表达过量胰岛素，就可利用CD8.2的Mab以免疫清除方式将其除掉，这似乎为控制转导细胞胰岛素分泌量提供了一条途径。Falqui等105利用重叠PCR技术得到编码突变人胰岛素原的cDNA并将其转染大鼠成纤维细胞产生成熟胰岛素。Falqui等106还在1996年对小鼠成纤维细胞（NIH3T3）进行了转基因体外培养。但Ltk和NIH3T3出现过度增长并聚集成结节的情况[105],
[73]。2.1.2.1.1.1.2.3 肝细胞肝脏是胰岛素作用的主要器官，对保证血糖的调控起重要作用，且肝细胞具有与胰岛beta细胞类似的一些特点，能够表达beta细胞分泌胰岛素所需的特异葡萄糖转运蛋白（GLUT）和葡萄糖激酶。进食后糖和其他营养成分首先通过门静脉进入肝脏并形成肝-胰联系。其特殊的解剖部位和血循环特点，使静脉或腹腔途径移植或转导的细胞较易进入，故而可以通过这两条途径直接进行基因转移。故肝细胞是糖尿病基因治疗较为理想的靶细胞。1995年Kolodka等采用重组逆转录病毒所作的研究，在当时证实肝脏是异位表达胰岛素基因最好的靶器官，参见逆转录病毒载体PLNCX。但同成纤维细胞一样缺乏加工胰岛素原的酶。为此有学者提出引入furin酶切位点，参见下文表达具有活性的胰岛素。含胰岛素cDNA基因转染到人肝细胞系（HPEG2ins）可以对cAMP等类似物起反应，引起胰岛素合成、贮存及释放，但是对葡萄糖的刺激不敏感。Simpson等49在HepG2ins细胞系中导入人胰岛的GluT-2后，细胞系显示出葡萄糖刺激胰岛素分泌的能力，虽然引起胰岛素分泌增加的葡萄糖浓度（5mmol/L）略低于正常胰岛，但是动态葡萄糖刺激实验中表现的胰岛素分泌曲线却接近正常胰岛的分泌曲线。免疫电镜显示细胞中含胰岛素分泌颗粒大小、形态与正常beta细胞相似。表明该细胞在以构成方式分泌胰岛素的同时，又能以可调节方式对葡萄糖刺激做出反应。Rivera等107提出用人造调节系统在肝细胞中形成分泌颗粒。参见上文葡萄糖是控制胰岛素合成分泌的最重要因素研究显示，葡萄糖本身就是控制胰岛素合成分泌的最重要因素。血糖浓度超过2mmol/L就会通过短期的翻译或长期的转录环节促进胰岛素的产生，一旦血糖基础水平超过5mmol/L，beta细胞就会立刻释放包含胰岛素的颗粒小囊。GluT2、GK/HK的比值是影响胰岛素分泌调节的关键因素。Grosl等108将突变的人胰岛素置于磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子之下转染大鼠肝癌细胞，形成FT0Insm细胞系。该细胞系表达较高水平的胰岛素的mRNA和蛋白质，有90%的胰岛素原被裂解为胰岛素，同时在cAMP和地塞米松的诱导下胰岛素的分泌迅速增加。Lu等109发现将PEPCK基因（参见上文有效的生理性调控序列）的启动子和原胰岛素基因连接后转染到原代培养的肝细胞中，胰岛素的产生随cAMP和胰高血糖素增加而增加，随着胰岛素增加而减少。Aoki等110发现，原代培养的肝细胞移植入体内后不会出现增殖情况。肝细胞还被用来进行调节基因治疗，参见调节基因治疗。2.1.2.1.1.1.2.4 成肌细胞具有重要意义的发现是成肌细胞可将合成的胰岛素原完全转换为胰岛素111。成肌细胞（myoblast）是单个核细胞，并且保持分裂的潜能。经肌肉注射后，可以穿过基膜与预先存在的多细胞核的肌小管融合，几乎无限期地保存下来。由于成肌细胞含有控制细胞增殖分化的天然开关，如果转染的成肌细胞分化成肌管后仍可以分泌胰岛素，则提供了一个可移植的良好的胰岛素分泌系统。成肌细胞已经被广泛应用于基因治疗的临床实践中。Yazigi等112发现，原代培养的成肌细胞移植入体内后不会出现增殖情况。而Falqui等105目前正在尝试用MyoD基因控制成纤维细胞向成肌细胞转化，并最终把成肌细胞改造为产胰岛素的beta细胞替代品。2.1.2.1.1.1.2.5 K细胞2000年，Cheung等113发现位于胃、十二指肠、空肠的K细胞具有较高的GK表达能力。K细胞本身可以合成、分泌葡萄糖依赖的促胰岛素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide， GIP），来增强糖对胰岛素分泌的调节。GIP与胰岛素的分泌都受血糖浓度调控。在进糖后几分钟内，GIP开始升高，2小时内恢复基础水平（与胰岛素的分泌一致）。GIP能易化餐后胰岛素的释放。Cheung将人胰岛素基因导入小鼠的一种肠道细胞——STC-1细胞中，使之在GIP的调控下进行表达，发现胰岛素的产量会根据血糖的浓度而发生改变。在能够分泌人胰岛素的转基因小鼠中，人胰岛素基因只限定在胃、十二指肠的K细胞中表达，对于由链脲佐菌素（STZ）诱导的高血糖，起到了满意的降糖效果。口服葡萄糖耐量实验也证实，胰岛素的分泌很好地受到了血糖的调控，符合生理要求。由于它位于肠胃道，易于接近，且数量较大，有可能通过一种非创伤性方法，如：内窥镜或口服，将胰岛素基因导入K细胞中使之表达。K细胞有根据血糖调节胰岛素合成的装置及胞吐能力，并有把胰岛素原转变为胰岛素所需要的酶。虽然这种基因转染的K细胞可能丢失，但可以经过重复给药实现长期的胰岛素分泌。因此K细胞内认为是非beta细胞工程的理想选择，有希望解决胰岛细胞移植中胰岛beta细胞供体不足的问题。2.1.2.1.1.1.2.6 小结肝脏和骨骼肌是摄取胰岛素基因的常用载体组织。这主要因为：肝细胞在结构上更接近胰岛beta细胞，胰岛素基因可被更好地表达；而骨骼肌的总体积较大，供血丰富且易于操作。通过门静脉或肌肉注射的方式，将胰岛素基因输入糖尿病动物体内，可观察到血糖被控制在正常水平达数月，动物体重增加，尿量减少，症状明显改善。另外还有皮肤角化细胞细胞也是适宜的候选靶细胞114。2.1.2.1.1.2 基因转移的途径基因治疗的关键之一是如何将外源基因导入相应的靶细胞并获得安全有效的表达。有10余种基因转移技术可以将外源基因转移至哺乳动物细胞内，一般分为物理方法、化学方法及生物学（病毒）方法等三大类。2.1.2.1.1.2.1 物理和化学方法物理和化学方法近年来发展迅速，常用的有电击法、颗粒轰击法、磷酸钙转移法及脂质体转移法等。这些方法较安全，不存在野生型病毒污染及免疫反应等问题，但基因转移效率低115。以低压脉冲电流介导的体内转染方法——电穿孔法（electroporation）能显著提高基因表达效率，也被用于胰岛素基因的体内转染。其安全、高效的特点正受到人们越来越多的关注，成为一种很有前途的体内转染方法116。磷酸钙沉淀法的转移效率比较低，不适合迅速转染培养中的原始靶细胞。电穿孔法有较高的转染效率，但具体的实验步骤很难优化，而且细胞的死亡率比较高。脂质体转移法已经在体外转基因过程中加以应用，但其同样面临转移效率比较低的问题。还有DNA直接注射法和基因枪法。2.1.2.1.1.2.2 生物学方法生物学方法介导的基因转移效率高，是当前基因治疗的主要手段，但其安全性问题仍需注意。糖尿病基因治疗中常用的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体（AAV），可参见下文。2.1.2.1.1.3 胰岛素的表达调控正常生理状态下，胰岛beta细胞能感应葡萄糖浓度，调节胰岛素的分泌。研究发现在胰岛素释放对葡萄糖浓度变化的反应中，葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖转运蛋白（GLUT）是关键性物质，参见上文胰岛素的分泌调节。在前期进行的一些转基因治疗糖尿病的动物实验中，胰岛素的分泌缺乏针对葡萄糖浓度变化的反应性，有的甚至使动物出现致死性低血糖。持续的胰岛素产物及释放，是一种比糖尿病本身更危险的致死因素。而目前经遗传修饰的靶细胞难以达到如此的可调节性，但也找到了一些人为手段，在一定程度上能调节胰岛素的表达，虽然远不如生理性血糖调节灵敏。2.1.2.1.1.3.1 有效的生理性调控序列据报道117，肝细胞中有一些基因调控区域可根据细胞外葡萄糖浓度的升高上调胰岛素基因的转录活动。如磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）118、肝脏丙酮酸激酶（L-PK）119和葡萄糖6-磷酸酶（G6Pase）的启动子。这些参与糖代谢的酶基因中存在葡萄糖反应元件（GIREs）。2.1.2.1.1.3.1.1 PEPCK启动子PEPCK启动子可同时受血糖和血浆胰岛素的反馈调控，但它的作用在血糖明显升高时会受到抑制而使胰岛素的产量减少，目前已不多用。Valera等120选择PEPCK启动子和人胰岛素基因构建了PEPCK/insulin嵌合体基因，以转基因小鼠为模型定位于肝脏转入，结果该基因随血糖浓度变化呈生理模式表达。PEPCK是肝脏特异表达的基因，其活动受胰岛素和胰高血糖素的双重控制。其启动子含有cAMP反应元件（CRE）和P3元件两个序列。这两个序列对cAMP反应具有重要意义。另外还有胰岛素反应元件，糖皮质反应区。应用PEPCK/insulin建立的转基因鼠健康，血糖正常，肝脏表达胰岛素mRNA和蛋白质，逆转葡萄糖激酶（GK）、糖原合成酶活性，恢复6-磷酸葡萄糖和糖原的正常水平。2.1.2.1.1.3.1.2 L-PK启动子Mitanchez等首先将L-PK基因启动子与胰岛素基因重组使胰岛素成功地在转基因小鼠的肝脏表达。Lee等和Olefsky等进行的胰岛素单链类似物（SIA，参见胰岛素单链类似物）的研究中也利用了L-PK基因启动子。由于L-PK启动子除含有GIREs外还有胰岛素反应元件，有可能引起过多的胰岛素表达。因此Thule等121用Chimeric启动子调节胰岛素原基因的表达。Chimeric启动子由3套兴奋性葡萄糖反应元件组成：来自大鼠L-PK中的GIREs插入到抑制性反应元件、来自胰岛素样生长因子结合蛋白-1的启动子的上游。该启动子受肝细胞内葡萄糖激活（5~25mmol/L），并被胰岛素（10-10~10-7mol/L）抑制。通过基因重组，利用腺病毒载体进行的大鼠的动物实验122发现，其血糖值1~1周保持在接近正常水平，血糖值很少低于2.8mmol/L。另外，基因转染可使糖尿病大鼠葡萄糖耐量正常，禁食10小时仍能维持正常血糖水平。肝细胞产生的人胰岛素可维持正常血糖，使体重增加，且不需要注射外源胰岛素，不会导致低血糖。2.1.2.1.1.3.1.3 G6Pase启动子葡萄糖6-磷酸激酶基因启动子（G6P）本身存在与L-PK不同的GIREs，胰岛素可抑制此元件的反应性。Chen等[123], [124]的研究组将G6P与胰岛素基因重组，从而实现了葡萄糖反应性以及胰岛素自限性的胰岛素表达。当将此种表达元件转染肝细胞后，血糖在5.5mmol/L可使胰岛素达到3.5~5.3×10-11mol/L的分泌。2.1.2.1.1.3.1.4 S14血糖调控元件Alam等125构建含有人胰岛素基因、肝白蛋白启动子及S14血糖调控元件的载体，在体外转染肝细胞后分泌出胰岛素，而转染到糖尿病鼠体内能降低血糖。2.1.2.1.1.3.1.5 小结可惜的是，PEPCK、L-PK、G6Pase、S14启动子均为肝细胞特异的。另据报道，GIP（参见INS-1细胞系）和IGFBP-1基因的启动子也可调控胰岛素基因根据血糖浓度调整分泌量。L-PK和G6Pase是相对理想的启动子，但活性均较低都不够强大，基因表达效率不高，影响了降糖的效果。同时L-PK基因启动需要胰岛素协同，因此这两种表达控制元件的临床应用受到了限制。提高增强子的活性可能有利于改善胰岛素的产量。但是也有人126认为，这些启动子的调节作用十分复杂，除依赖于葡萄糖外，还依赖于胰岛素。它们不可能在IDDM病人体内和非糖尿病人体内的作用效果相同，而且转录水平的反馈调节要比分泌水平的反应慢得多。当饭后需要胰岛素时，合成胰岛素的过程可能造成几个小时的高血糖；当低血糖时，胰岛素mRNA的半衰期又延长了胰岛素分泌不受控制的时间。胰岛素产生的减少将依赖于外源性胰岛素的补充，而胰岛素产生过多又导致低血糖的发生。所以就目前的情况来说，胰岛素转录调节的风险大于收益，并没能促进胰岛素用量的精确性，置患者于一个充满危险的境地。Tanigchi K等利用糖皮质激素启动子成功地实现了对胰岛素原基因的负表达调控，能部分抑制胰岛素基因的表达127。2.1.2.1.1.3.2 通过控制内质网（ER）中的凝聚过程来调控胰岛素的储存和分泌Rivera等128和Aridor等129报道了通过控制ER中的凝聚过程来调控胰岛素的分泌。单聚体、可溶性蛋白质FKBP12经改造，其第36位的Phe变成Met后，可与胰岛素嵌合基因转录翻译后以特殊的肽链连接并储存在ER内。一种人工合成的能通过细胞膜的小分子药物可在20分钟内使之变构，并被furin酶在连接处水解，迅速释放成熟胰岛素到细胞外。当不加外源药物时，培养液中胰岛素的含量非常低，而ER中储存的胰岛素的量相当于5~10小时的合成量，因此可通过改变此药物浓度控制胰岛素分泌率。Rivera等将上述表达载体的细胞植入到用STZ诱导的糖尿病小鼠体内，15分钟后在血清中可检测出胰岛素，2小时后达到高峰，循环浓度达8×10-10mol/L。随着胰岛素的释放，血糖浓度迅速下降，在30分钟内下降40%，2小时内下降90%，2小时后循环胰岛素量减少，血糖升高。这与生理性胰岛素释放非常相似。可进行此种基因转染的宿主细胞可能不受限制。如果能证明在人类也具有可行性，则一次性或间断性注射含此功能基因的载体将可能代替重复注射胰岛素治疗I型糖尿病。2.1.2.1.1.3.3 其他真核细胞可诱导性表达系统现在已经分离出有作用的真核细胞可诱导性表达元件有多种，如重金属离子诱导的金属硫蛋白启动子等。将这些启动子元件与目的基因融合构成转基因，常可表现出相应基因的可诱导性表达。Stewart C等利用金属硫蛋白启动子系统增强了外源性前胰岛素原基因的表达92。AtT20细胞被导入含金属硫蛋白启动子的人胰岛素cDNA后，构建成AtT-20Mtins细胞系，移植入STZ处理的小鼠，1~2天后血浆中人C肽浓度为 0.02nmol/L，喂食硫酸锌3~5天后,血浆C肽为0.11nmol/L,如果不继续喂锌，血浆人C肽浓度将下降。高血糖的数量明显低于不移植AtT-20Mtins细胞系，提示体细胞基因治疗糖尿病是有潜力的。Kawakami等91也做过类似研究。尽管这些启动子系统能诱导基因的表达，但诱导效率低、特异性不高及诱导物常有一定的生物学效应甚至毒性，故使其广泛应用受到一定限制。2.1.2.1.1.3.4 原核调控元件为了克服上述真核表达系统的不足，人们又探索用原核调控元件来控制真核转基因表达。常用的有Lac系统及四环素抗性系统（Tet系统）。这些原核启动子的诱导物在真核细胞中常不存在，并且对真核细胞也无毒副作用，因此是较有前途的诱导表达系统。1992年Gossen和Bujard用四环素作为调节因子调控目的基因的表达。四环素调节已经在许多真核细胞系统中发挥了作用，但只是对促红细胞生成素（Epo）基因的表达调控研究较多。Sturtz等130指出四环素调节系统有3个重要特点：（1）非渗漏性调节，四环素作用48小时后影响蛋白分泌。（2）调节范围广。（3）调节具有可逆性。但是由于四环素表达系统不是葡萄糖反应性系统，如何控制糖尿病患者血糖有待于今后的研究。Deuschle等131将SV40 Tag安置在大肠杆菌E. coli转座子Tn10中四环素操纵子调控系统的控制下，利用这一系统Tag活性可以在体内调控。Efrat等132利用Tet抗性操纵子调控SV40 Tag基因表达，在转基因小鼠中产生有条件的转化胰腺beta细胞。他们首先将Tet抑制子与HSV病毒VP16蛋白融合形成的转录活化子Tet RVP16的基因序列置于胰岛素启动子之下，以该基因制作的转基因小鼠的胰岛beta细胞可表达Tet R-VP16。然后在另一转基因小鼠中将SV40大T抗原（Tag）基因置于Tet操纵子和一最小启动子下游，这一构件由于缺少功能性启动子而不能被转录。由这两种小鼠杂交产生的双转基因小鼠的beta细胞中，表达的Tet R-VP16可结合到Tet操纵子上并活化Tag，Tag的表达可产生beta细胞瘤。这些肿瘤在Tet缺失培养基中培养分离得到的beta细胞系，在四环素存在的条件下，由于抑制Tet R-VP16融合蛋白表达，细胞停止生长，当这些细胞移植入有STZ处理过的小鼠体内，血糖在2周内正常，但是这些细胞继续增殖，产生低血糖直至小鼠死亡。如果细胞移植时同时移植缓慢释放的四环素量小，细胞不再生长，正常的血糖可维持4个月，这一结果提示含遗传开关的细胞用来治疗糖尿病是有前景的，特别是由于猪的生理与人较接近，用转基因技术获得含有遗传开关的猪胰岛beta细胞系是很有可能的。2.1.2.1.1.3.5 “自杀”基因经遗传学改造后的靶细胞在回输体内后过度增殖（参见成纤维细胞），甚至聚集成结节形成胰岛素过度分泌造成低血糖的结构基础。一种解决办法是包被移植，参见包被移植。近年来发现，胰岛素分泌的调节可以通过“自杀”基因的表达来实现。人类单纯疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（tk）基因就是一种“自杀”基因。HSV-tk基因编码产生胸腺嘧啶激酶（tk），该酶可以催化核苷类似物GCV变为GCV单磷酸、双磷酸和三磷酸。它们与dNTP竞争，在DNA合成时被掺入DNA分子，最终导致细胞死亡。病毒tk的高特异性及对哺乳动物的低亲和力使GCV成为选择性杀死表达tk基因细胞的理想药物。Yoshimoto等133应用质粒pRB1转化小鼠胰岛素分泌细胞D2CD8.2，并将其注入糖尿病小鼠体内，使胰岛素和tk同时表达。当小鼠表现低血糖时输入GCV，则低血糖得到纠正，甚至恢复高血糖状态。这个实验说明“自杀”基因可以实现基因表达的调控，而且仅有HSV-tk基因的表达并不会对细胞带来任何影响，关键要有GCV的补充应用。这为研究人员提供了一种控制细胞何时死亡的机会。当靶细胞过度增殖聚集成结节，目的基因表达失控时就可以应用GCV进行调控、补救。现在，HSV-tk基因的临床应用，已经得到美国国立卫生研究所（NIH）下属的基因重组委员会批准认可。2.1.2.1.1.3.6 小结目前，转录水平胰岛素的调节还存在时间延后的问题。与正常动物相比，服糖后转基因动物的胰岛素升高是延迟的，而且服糖后3~5小时会出现短暂的低血糖现象。正常动物的beta细胞对细胞外葡萄糖的细微变化非常敏感，通过胞吐方式快速释放胰岛素。而多数转基因动物胰岛素的分泌是在转录水平调控的，需要相对长的时间才能对血糖的变化做出反应，因此，需要开发一个更接近正常胰岛素分泌的系统。通过修饰启动子可以取得更好的效果：插入多套葡萄糖反应元件来增加胰岛素的表达；插入胰岛素敏感元件进行负反馈抑制；把一些特殊元件整合到基因序列中，可以控制转基因胰岛素mRNA的半衰期，使其很快被降解，避免低血糖134。2.1.2.1.2 体内直接转基因治疗体内直接转基因治疗（in vivo）即将带有遗传物质的病毒、脂质体或裸露DNA直接输注（通过静脉、皮下、支气管，或者局部注射）到试验个体内，并让其在体内表达的一种治疗方法。此类方法操作简便，易于推广，但存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题，值得进一步探索。体内基因转移的方法在治疗某些非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）方面也可能有效。参见II型糖尿病的基因治疗。2.1.2.1.2.1 体内直接转基因治疗糖尿病的策略体内直接转基因治疗糖尿病有三种策略：转移编码加速葡萄糖利用或者抑制肝脏生成葡萄糖的蛋白的基因；转移编码受血糖调控的胰岛素的基因；转移编码在肝脏内诱导beta细胞产生的发育或转录因子的基因。2.1.2.1.2.1.1 非胰岛素降血糖类基因的转移有两类非胰岛素的基因被用作转基因来降低血糖：一是抑制肝脏内葡萄糖生成的；二是加速肝脏或者骨骼肌内葡萄糖利用的。第一类中，很多研究小组进行了向啮齿类动物体内转移了葡萄糖激酶的实验[66], [135], [136], [137], [138]。虽然葡萄糖激酶被划归到肝脏中降低葡萄糖生成的这一类中139，但这些研究中从未直接测量过肝脏的葡萄糖生成。该酶对下游最主要的作用可能是加速葡萄糖的利用135。高剂量的葡萄糖激酶导致高血脂和脂肪肝[135], [138]。而该转基因疗法最好是作为一种辅助治疗方法来补充胰岛素治疗138。转移Gck调节蛋白基因产生作用的方式与转移Gck基因产生作用的方式非常相似140。一个6-磷酸果糖-2-激酶（果糖-2，6-二磷酸酶）的突变体被用来激活磷酸果糖激酶-1，同时抑制果糖-1，6-二磷酸酶以下调糖异生。其在2型糖尿病小鼠模型中的过量表达表现出对葡萄糖-6-磷酸酶的下调和对Gck的上调作用，从而刺激葡萄糖的利用、抑制肝脏葡萄糖的产生141。另一种下调肝脏葡萄糖产生的思路是过量表达“糖原靶向蛋白”（PTG，Protein targeting to glycogen）使葡萄糖转化为糖原142。这个蛋白是调节糖原代谢的蛋白磷酸酶-1的糖原靶向亚基家族的一员。以腺病毒介导PTG的转移在大鼠体内刺激肝脏内糖原的合成、降低血糖，因此代表了糖尿病基因治疗的一条有潜力的途径143。上面已经暗示，Gck在肝脏的过量表达看来是促进了葡萄糖的利用，所以Gck也可认作是属于第二类刺激葡萄糖消耗的有潜力的治疗基因。令人注意的是，Gck在链脲菌素诱导的糖尿病小鼠骨骼肌中的过量表达也刺激葡萄糖的消耗，保护机体避免高血糖144。包括６-磷酸果糖-2-激酶／果糖-2，６-二磷酸酶和PTG在内的其他转基因看来也都类似地影响到肝脏内葡萄糖的利用和产生。总之，针对非胰岛素之外的影响葡萄糖产生和利用的目标基因，有不同的调控血糖的策略。但其中大多数是辅助性的治疗，而且看来更适合于做为小分子化合物的目标145而不是基因治疗的目标。2.1.2.1.2.1.2 葡萄糖反应性胰岛素基因的转移大多数糖尿病基因治疗的文献涉及到向肝细胞转移各种胰岛素基因。这些基因具有以下特点：（1）经过修饰，要么使胰岛素原易于被加工为成熟的胰岛素，要么避免了加工的需要[146], [182]；（2）或者经过修饰以使其基因的表达对血糖的变化做出反应。因为肝细胞不产生胰岛激素转换酶PC1/3和PC2，很多研究者向胰岛素原分子中引入了新的蛋白酶切割位点，以供在包括肝脏在内的多种组织中存在的furin酶识别，参见胰岛素原的加工问题。或者，胰岛素基因被修饰为编码一种具有正常成熟胰岛素20-40%活性的单链类似物，参见胰岛素单链类似物。胰岛素基因治疗最有挑战性的部分是为胰岛素转基因的表达授予葡萄糖反应性。正常beta细胞十分灵巧：它们产生几乎是瞬时的胰岛素释放来回应葡萄糖浓度的变化。研究者们使用了各种不同的葡萄糖反应性的启动子，其来源包括PEPCK基因，LPK，G-6-P，（参见有效的生理性调控序列）以及各种其他基因[182], [150]。这些措施使胰岛素转基因在血糖水平变化后1-2小时内在转录水平上受到调控，3-4小时内在蛋白质分泌水平上受到调控。在血糖恢复正常或者已经偏低的时候，这些基因也需要更多的时间才能关闭其表达。由于分泌反应的滞后，转基因胰岛素依赖转录水平调节的血糖控制显得缺乏规律性，而低血糖成为主要并发症。另一种途径是在内质网水平上用药物诱导蛋白质去凝聚来控制分泌，参见通过控制内质网（ER）中的凝聚过程来调控胰岛素的储存和分泌。但是，任何需要药物的操作都背离了基因治疗的目的，因为通过使用现有的各种形式的胰岛素，药物治疗已经具较大范围内具有相当的灵活性。2.1.2.1.2.1.3 针对肝脏内诱导beta细胞再生的基因治疗通过在肝脏内诱导beta细胞或者胰岛的形成，可以回避开上面总结的各种方法存在的潜在问题。参见调节基因治疗。2.1.2.1.2.1.4 小结2.1.2.1.2.1.4.1 胰岛素基因治疗和胰岛再生治疗的对比胰岛素基因治疗和胰岛再生治疗这两种选择都可以逆转高血糖，但是它们之间存在着显著的差别。为了真正发挥效果，产生胰岛素的细胞必须拥有感应葡萄糖的机制。以肝脏为目标器官，部分地解决了这个问题，因为像beta细胞一样，肝细胞有其自身的葡萄糖感应机制可供被胰岛素基因转染的细胞借用。但是肝细胞与beta细胞的葡萄糖感应机制是不同的，只有胰岛细胞再生具有在目标细胞中重建真正的beta细胞特异性的葡萄糖感应机制。成熟胰岛素是该激素最具有活性的形式；它也是beta细胞所分泌的主要形式。向肝转移胰岛素cDNA后，激素以胰岛素原的形式产生，只有成熟胰岛素5%的活性。这种情况，可以通过向转基因构造中引入furin酶的切割位点，或者通过表达胰岛素单链类似物来避免，但是胰岛素突变形式可能的免疫原性问题仍然存在。参见表达具有活性的胰岛素。胰岛素的生物发生和控制的另一难题是精确模仿胰岛素分泌控制。Beta细胞通过其受调控的胞吐过程151产生几乎瞬时性的胰岛素释放，来对进食后或者喝含糖饮料之后血糖的迅速增加做出反应。参见胰岛素的分泌调节。与之对比，胰岛素基因治疗在胰岛素分泌反应上的可观的滞后导致不规则的血糖控制，表现在刚刚饭后的高血糖和数小时之后以及运动后的低血糖现象。参见胰岛素的表达调控。最后，需要强调的是beta细胞不是孤立的出现的。它们被胰岛非beta细胞所包围，与其紧密接触。这些非beta细胞能够调节胰岛素分泌反应，自身还能直接调控血糖。这些相互作用对正常胰岛素分泌的重要性尚不清楚。总的来说，诱导产生的胰岛再生显示出了正常beta细胞胰岛素分泌的所有特征。未来的发展将决定它是否能成为糖尿病基因治疗的手段。2.1.2.1.2.1.4.2 未来展望胰岛素基因治疗的简便性使它成为许多实验室流行的方法。但是由于胰岛素基因转移无法复制受调控的胞吐过程，无法模拟正常胰岛素分泌反应。相比之下，诱导再生看来是一个更有前途的方法（参见调节基因治疗），如果能够解决与I型糖尿病相关联的自身免疫问题的话。现在临床试验的主要限制因素看来是一种安全有效的基因转移载体的可行性。由于缺乏一个理想的载体是体内直接转基因治疗的通病，世界上很多实验室把发展一种安全有效的基因转移载体作为主要目标152。可以相信载体和胰
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