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乙型肝炎病毒全
作者：薛红安，杨倩，刘拉羊,成军,董菁
【关键词】& 乙型肝炎病毒
&&& Cloning and prokaryotic expression of HBV WholeX gene
　　XUE HongAn, YANG Qian， LIU LaYang, CHENG Jun, DONG Jing
　　1Department of Infection, Second Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China, 2Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Disease, 302 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China
　　【Abstract】 AIM: To construct the prokaryotic expression plasmid pET32a(+)WholeX. METHODS:& The WholeX gene was cloned into EcoR I/Sal I site of pET32a(+) and was sequenced. The fusion protein was expressed in E. coli with IPTG induction. After the induction and purification, the protein was analyzed in SDSPAGE and identified by Western blotting. RESULTS:& Endonucleases digesting and sequencing confirmed that the WholeX gene was correctly inserted into the vector. The WholeX gene was successfully expressed in E.coli. The fusion protein was confirmed by SDSPAGE and Western blotting. CONCLUSION:& The prokaryotic expression plasmid pET32a(+)WholeX has been successfully reconstructed, which provides the experimental base for study on its biological functions and antibody preparation.
　　【Keywords】 wholeX hepatitis B; prokaryotic expression
　　【摘要】 目的：构建乙型肝炎病毒全X基因原核表达载体并在细菌中表达、纯化. 方法：利用基因重组技术，将全X基因定向克隆于原核表达载体pET32a(+)多克隆位点中，限制性酶切和测序鉴定. 细菌表达产物及纯化后的产物经SDSPAGE和Western免疫印迹分析. 结果：经限制性酶切分析及测序鉴定，证实成功构建全X原核表达质粒. SDSPAGE和Western免疫印迹分析表明重组质粒在大肠杆菌中表达. 结论：本研究将全X基因定向克隆于原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达、纯化. 为进一步研究全X的功能及制备相应抗体奠定了基础.
　　【关键词】 全X基因；乙型肝炎病毒；克隆；原核表达
　　在对HBV基因组进行研究的过程中，发现在X基因的上游存在一个新的ORF区，编码168 bp核苷酸，将其命名为前X基因(preX). 通过上游启动子活性分析，分子流行病学调查及在线分析证实了前X基因真实存在［1，2］. 前X与X基因之间没有终止密码子，我们认为两者可能融和表达，将前X+X基因称为全X，全长约630 bp，编码210个氨基酸. 对全X基因进行原核表达，为其功能学研究、检测、抗体的制备奠定基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　E.coli DH5α，BL21由本室保存；Teasy克隆载体购自美国Promege公司，pET32a(+)购自Inventrigen公司. EcoR I，Sal I内切酶购自TaKaRa公司；Taq酶、蛋白分子标准购自美国Promege公司；DNA凝胶回收试剂盒购自博大生物有限公司；鼠抗HBxAg mAb购自晶美公司，HRP羊抗鼠IgG购自北京中山公司. 引物合成及测序由上海博亚生物公司完成.
　　1.2方法
　　在中分析全X蛋白分子质量及结构. 根据我们报道的全X基因序列设计合理引物. 上、下游引物5′端分别引入EcoR I，Sal I酶切位点，上游引物：5′GAATTCATGGGGCTTGGCTATTGG3′，下游引物:5′GTCGACGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCATG. PCR扩增全X DNA序列，玻璃奶纯化回收DNA片段，在T4 DNA连接酶的作用下，与pEGMTeasy载体连接，转化E.coli JM109,挑取在选择平皿(Amp,Xgal/IPTG)生长的白色菌落提取质粒，经酶切(EcoR I/Sal I)及测序鉴定. EcoR I/Sal I双酶切重组质粒pEGMT easy全X，玻璃奶纯化回收酶切产物，定向克隆至pET32a(+)载体，构建成重组质粒pET32a(+)全X. 转化E.coli氨苄平板筛选阳性克隆，小量提取质粒经双酶切及菌落PCR鉴定连接产物. 阳性克隆进行测序鉴定. 鉴定表达正确的pET32a(+)全X质粒转化E.coli表达菌株BL21. 挑选阳性菌落接种于LB氨苄培养基中，培养过夜，取0.5 mL菌液加入10 mL LB氨苄培养基中，37℃剧烈震荡培养至A600 nm 0.8，加入IPTG至终浓度为0.7 mmol/L，30℃剧烈震荡4 h，每隔1 h取1 mL菌液. 取40 μL进行SDSPAGE. 提取裂解液20 μL进行125 g/L十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜. 该膜经50 g/L脱脂奶粉封闭后，分别与鼠抗HbxAg mAb及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体各孵育1 h，DAB显色，拍照.
　　2.1全X蛋白软件分析结果全X蛋白质Mr为22.8×103，理论等电点pI: 8.68氨基酸序列结构:MGLGYWPSPH AWNLCGSSAD PYCGTPSSLF CSQPVWSKTY RNRQLCCPLS EIHLLSMAAR; VCCQLDPARD VLCLRPVGAE SRGRPVSGPF GTLPSPSSSA VPADHGAHLS LRGLPVCAFS; SAGPCALRFT SARRMETTVN AHQVLPKVLH KRTLGLSAMS TTDLEAYFKD CLFKDWEELG; EEIRLKVFVL&& GGCRHKLVCS& PAPCNFFTS.
　　2.2HBV全X基因的克隆与表达载体的构建以设计引物从HBV DNA质粒中扩增出一条约630 bp的条带，与目的片段大小相近. PCR产物TA克隆化后，经酶切以粘端方式插入pET32a(+)载体. 转化质粒用EcoR I，Sal I酶切得到630 bp大小的片段(Fig 1). 测序结果完全正确.
　　2.3pET32a(+)全X的诱导表达重组质粒转化菌在30℃ IPTG诱导后，进行SDSPAGE (Fig 2). 含空载体的菌株在Mr约15 000处可见标签蛋白条带，重组质粒转化菌在在Mr约40 000处可见一条明显的条带，除去标签蛋白，符合目的片段表达蛋白质的大小(Fig 2). 进一步Western免疫印迹分析也证实了表达结果(Fig 3).
　　乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝部分双链DNA病毒，不仅引起急慢性病毒性肝炎，而且与肝纤维化（LF）、肝细胞癌（HCC）的发生发展密切相关. 1979年Gelibert 等发表了HBV基因组的第一个全长核苷酸序列，并将HBV基因组划分出4个ORF，分别编码病毒的核壳（C）和包膜（S）蛋白，病毒复制酶（聚合酶）P及与病毒基因表达有关的蛋白质X. 但我们发现存在另一前X基因编码序列，长度168 bp，与X基因之间没有终止密码子，将其命名为前X(preX)基因.
　　Takahashi等［3］于1995年研究曾发现前X区的存在，并认为此种变异与肝细胞癌（HCC）的形成有关，在1998年的研究报道中发现来源于HCC患者的40个全HBV基因序列中，有18株具有前X基因，且均为adr亚型［4］. 但之后未见有相关报道，对前X基因是否真实存在及其与肝细胞癌的关系未见进一步的研究报道.
　　为了证实前X基因的真实存在，在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列，应用DNASIS软件重新确定其ORF，结果发现甘人宝等揭示的HBV基因组序列中存在前X区ORF. 将前X区编码氨基酸序列输入GenBank后进行同源性搜索，结果发现已经存入中的序列中，有19个克隆中含有的氨基酸序列与研究获得的序列有较高的同源性，同源性为85%～94%，这些克隆均来自日本学者对肝细胞癌患者体内存在的HBV基因组分析所获得的. 我们研究发现前X基因ORF中ATG上游核苷酸序列（长度约200 bp）具有启动子活性，进一步证实了关于HBV基因组中存在前X基因的推断和发现. 同时采取横断面研究方式对慢性乙型肝炎患者体内感染的HBV基因组进行研究，自17例HBV DNA阳性的患者克隆库中随机选择了共45个克隆进行核酸序列测定，其中27个克隆编码前X区，编码前X基因的克隆中以C基因型为最多. 10例患者体内的HBV病毒基因组编码前X基因, 占采样总数的58.8% (10/17)，提示多数患者体内的HBV基因组编码前X基因. 前X基因编码不能主要由于3种突变所导致,即A2608→C/T替换突变、C/A2733→T替换突变以及上述2个位点的双替换突变［5］.
　　利用软件NTI8对基因编码的前X多肽进行分析，结果显示该多肽Mr约为6.2×103，有15个疏水氨基酸，24个极性氨基酸. 应用DNASIS软件的蛋白质分析功能分析了全X（前XX）基因的完全表达产物，前X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区. 前X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构.& 前X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象. 根据对前X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关. 我们将X区编码氨基酸序列在GenBank进行同源性搜索，发现同源性为85%～94%的克隆，均克隆自HCC患者. 因此认为前X和全X蛋白可能与肝细胞癌的发生更为密切相关. 对其功能的研究，及其在肝细胞癌形成中的作用成为我们目前研究的重点和感兴趣的课题.
　　我们利用pET原核表达系统对全X蛋白进行了表达［6］，在合适的温度和IPTG诱导下，提取细菌蛋白进行电泳，成功得到了全X蛋白，为进一步研究全X蛋白的结构和生物学功能，在蛋白质水平上探讨全X蛋白在肝癌发病机制中的作用提供了一定的物质基础.
　　【参考文献】
　　［1］ 董菁，成军. 乙型肝炎病毒前X基因区的界定［J］. 世界华人消化杂志， ): .
　　Dong J, Cheng J. Study on definition of preX region in hepatictis B virus genome［J］. World Chin J Dig, ): .
　　［2］ 杨倩,董菁,成军,等. 乙型肝炎病毒基因组中前X编码基因启动子活性的鉴定［J］. 解放军医学杂志， -762.
　　Yang Q, Dong J, Cheng J, et al. Identification of preX promoter sequence in Hepatitis B virus genome and appraisal of its transcription activity［J］. Med J Chin PLA, -762.
　　［3］ Takahashi K, Kishimoto S, Ohori K, et al. A unique set of mutations in the "preX" region of hepatitis B virus DNA frequently found in patients but not in asymptomatic carriers: Implication for a novel variant［J］. Int Hepatol Commun，）:131.
　　［4］ Takahashi K, Akahane Y, Hino K, et al. Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of hepatocellula comparative analysis of 40 fulllength isolates［J］. Arch Virol, 3-2326.
　　［5］ 董菁， 杨倩，成军. 乙型肝炎病毒基因组前X区的分子流行病学研究［J］. 世界华人消化杂志， ):794-800.
　　Dong J, Yang Q, Cheng J. The molecular epidemiological study on preX region in hepatitis B virus genome［J］. World Chin J Dig, ):794-800.
　　［6］ 梁英民, 蒋姗姗, 孙强, 等. BCRABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备［J］. 第四军医大学学报，):.
　　Liang YM, Jiang SS, Sun Q, et al. Expression and purification of BCRＯABL fusion protein and the production of its& antiserum［J］. J Fourth Mil Med Univ, ):.
　　基金项目：陕西省自然科学基金（）
　　通讯作者：杨倩. Tel.(029)
　　作者简介：薛红安（1960），男（汉族），陕西省西安市人. 副主任医师. Tel.(029)Email.　　　　(1西安交通大学第二医院感染科,陕西 西安 解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心,北京 100039)
　　编辑许昌泰
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