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吖啶酯化学发光免疫分析方法用于HIV-1P24抗原检测的研究
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吖啶酯化学发光免疫分析方法用于HIV-1P24抗原检测的研究
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3秒自动关闭窗口> 吖啶酯化学发光免疫分析试剂产品投资合作项目
&吖啶酯化学发光免疫分析试剂产品
一、市场及技术的可行性分析
据统计，现在临床诊断试剂已发展成为一个拥有200亿美元国际市场、50亿元人民币左右的国内市场、年增长达到3%～5%的朝阳产业。我国的诊断试剂产业正面临一个高速发展的阶段，根据专家估计,未来5年国内临床诊断市场的年增长率高达15％～20％。目前我国列入生物制品规程的诊断试剂只有62个，同国际上的几百种产品相比，国内市场还远没有得到开发。同时随着人们生活水平的提高、随着人们对诊断试剂在预防与治疗疾病过程中重要性认识的增加和国家医疗体制的改革，市场规模必然会进一步扩大。因此，国内临床诊断产业将因此迎来很大的发展机遇，同时也是处于发展的关键时期。面对巨大的发展机会和日益严重的竞争，国内企业的发展策略宜实施以自主创新为宗旨，以市场为导向，采取横向或纵向联合的方式，开发具有自主知识产权的诊断试剂与自动化仪器，迅速大幅度提升我国临床诊断试剂产业的国产能力和国际竞争能力。
当前诊断试剂总体发展呈现的一个主要特点是免疫分析试剂的市场越来越大,并将会逐渐取代临床化学试剂，成为诊断试剂发展的主流。目前市场上已有的免疫分析试剂包括放免、金标、酶标、荧光和化学发光等。在这些试剂中，化学发光免疫分析试剂（或者说化学发光免疫分析方法（CLIA）具有检测灵敏度高；标记物稳定、试剂盒有效期长；不需要激发光源、仪器设备简单；线性范围宽；受外界的干扰因素少、信噪比高；成本低和易实现全自动化等优点。是免疫试剂的重要发展方向之一,其技术及应用在近十多年来得到迅猛的发展，也是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法和试剂。目前国内三甲以上医院的检验科(包括血液科)所采用的体外诊断方法主要是化学发光免疫分析法。并且随着国内自主知识产权的化学发光试剂盒及化学发光仪器的开发与利用，将来三甲以下的医院也将逐步使用化学发光免疫分析试剂盒，替代现有的放免、酶标等而成为市场的主流。因此，化学发光试剂（发光底物）、化学发光免疫分析试剂盒及仪器的开发具有不可估量的市场前景。国外目前有多种商业化的CLIA系统，这些商业化系统都是封闭式全自动化学发光免疫分析仪及与之配套的试剂盒，最主要的如：Ciba Corning公司的Magic Lite System；Behring公司的Berilux System；Amersham公司的Amerlite System；DPC公司的Immulite System； Bochringer Mannheim公司的Elesys System, Beckman coulter 公司的ACCESS System等，国际知名公司如拜耳、罗氏、贝克曼、强生、DPC等。而我国对化学发光免疫分析的研究及仪器与试剂生产还相对比较落后，到目前为止还没有配套的全自动化学发光仪与相应的系列试剂盒。其原因一是由于我国化学发光免疫分析的研究起步较晚，二是发展较为缓慢。而发展缓慢的原因一是我国对仪器的基础技术和制造工艺水平不够，特别是高精度加工技术不高。二是大多数化学发光试剂的原料或受国外专利保护，或制造难度大，从国外购买的价格昂贵。目前，我国市场，特别是大型医院所用到的化学发光免疫分析仪器与试剂几乎被国外的公司所垄断。因此，我国急需研究开发符合国内条件及需要、生产成本低、价格低、有市场竞争力的化学发光试剂、化学发光免疫分析试剂盒及仪器，特别是配套的全自动化分析仪及系列化试剂盒。
目前应用于CLIA的化学发光体系有多种，最主要的有：鲁米诺（或异鲁米诺及其衍生物），吖啶酯（或吖啶磺酰胺），螺旋金刚烷-1,2-二氧乙烷及其衍生物和电化学发光体系等。其次还有咪唑类化合物、芳香草酸酯、黄嘌呤类化合物、葡萄糖氧化酶等。目前市场上应用的化学发光免疫分析试剂所采用的体系主要是前四种，而在这四种体系中，鲁米诺（或异鲁米诺及其衍生物）体系的灵敏度相对后三种低且稳定性差，后三种发光体系的灵敏度都很高并基本相当。其中吖啶酯（或吖啶磺酰胺）发光体系具有非常独特的优点，一是发光体系相对最简单，不需要催化剂和增强剂，在碱性H2O2溶液中就可以直接发光；二是由于不用催化剂和增强剂，受干扰因素少，本底低，信噪比高。三是发光为flash型，发光快速集中，发光强度大，检测快速，检测灵敏度高，精密度高；四是发光标记物稳定，试剂盒有效期长，而且标记简单；五是成本低；六是对仪器要求简单，易实现全自动化。基于吖啶酯发光体系具有的独特优点，研发吖啶酯类化学发光免疫分析系列试剂盒及配套仪器，从理论与实际意义上讲是切实可行的。
目前国际上应用于化学发光免疫分析临床诊断试剂盒所采用的吖啶酯为AE&NHS [4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl) phenyl-10methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate] 和DMAE&NHS[2&,6&-Dimethyl-4&-(N-Succinimidyloxycarbonyl)Phenyl-10-Methyl-Acridinium-9-Carboxylate Methosulfate]。AE&NHS易水解、热稳定性不好。 DMAE&NHS的分子结构的酚环上连有两个甲基，空间位阻大，水解稳定性好，它的光量子产率与AE&NHS相当，但其水解稳定性、热稳定性和信噪比均较AE&NHS高。我们以前的研究结果表明，室温下，DMAE&NHS在pH为5.8, 7.0, 8.0的PB缓冲液中， 16天后其发光活性只分别降低1.6%、3.6%和8.3%，在4℃或冰冻条件下, DMAE&NHS在pH为 7.0 的0.1mol/L PB缓冲液中， 保存半年后，其发光活性没有下降。DMAE&NHS与蛋白的偶联物同样具有相当好的稳定性。DMAE&NHS应用于化学发光免疫分析商业试剂盒已取得巨大成功，如Ciba Corning公司的Magic Lite化学发光免疫分析系列试剂盒及其配套的全自动化学发光免疫分析仪，就是使用DMAE&NHS做发光标记物，它目前有几十个免疫分析试剂盒。但目前国内的企业，由于技术上的原因，尚未有成规模的商业化的用于临床诊断的吖啶酯化学发光免疫分析试剂盒及配套的化学发光免疫分析仪。而且现在从市场上能买到的商品化吖啶酯只有AE&NHS（价格昂贵），没有DMAE&NHS。而要开发临床诊断试剂盒，只能选择性能好的DMAE&NHS，不能选择性能相对劣势的AE&NHS。
我们在国内首先独立掌握吖啶酯DMAE&NHS（包括AE&NHS）及其化学发光免疫分析试剂的研发技术，已申请国家发明专利。我们具备的技术包括吖啶酯的合成、标记、免疫分析方法的建立到最终试剂盒的生成等。我们从1999年开始从事化学发光免疫分析试剂盒的研究，已有近十的从事该领域研究工作的历史，曾对多种不同化学发光体系进行过研究，包括吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、草酸酯等。尤其是做了大量的有关吖啶酯化学发光免疫分析的研究，这些研究取得了一些创新性成果, 比如我们首次在国内报导成功合成DMAE&NHS, 首次应用合成的DMAE&NHS作为发光标记物建立TSH和TT4的化学发光免疫分析试剂（此工作在中国原子能科学研究院完成），并发表多篇与之相关的研究论文及申请数项相关专利。除此之外，我们还做过许多其他方面与化学发光有关的研究工作，如毛细管电泳-化学发光联用技术分离检测氨基酸（此工作在美国完成），化学发光免疫分析检测兴奋剂蛋白质芯片及化学发光增强剂的合成（此工作在生物芯片北京国家工程研究中心完成），艾滋病p24抗原化学发光免疫分析试剂的研究（此工作在北京工业大学完成）等。这些相关的研究基础提供了技术保障。
二、技术路线
吖啶酯DMAE&NHS及其衍生物的合成可采用下列两条路线:
&&& 图：路线1
其中R1、R2、R3为取代基，X为官能团。路线1包括七个步骤，与国外的文献方法一致，路线2只有4个步骤，是我们对文献方法进行改进后设计的新合成路线，该方案缩短合成路径由七步到四步，可大大节省原料与时间，降低合成难度，提高产率。
除合成DMAE&NHS与AE&NHS外，我们还可以合成新的吖啶酯衍生物。我们在设计合成新的吖啶酯类化合物时可以从两个方面改进其结构以达到提高其发光效率和分析灵敏度之目的。一是根据吖啶酯类化合物的化学发光反应机理，从电子效应方面考虑，可采取在吖啶环上引入吸电子基团，如氰基、酯基、硝基等，从而降低吖啶环与吖啶环上C-9碳原子的电子密度，有利于过氧化氢离子的亲核进攻，降低激发态与基态之间的能级差，降低反应活化能，提高分子激发效率和发光效率，加快反应速度。从空间效应考虑，应减少化合物的空间位阻，在吖啶环和苯氧环上尽量引入小基团的取代基。二是增大其水溶性，从而增大分子碰撞几率和反应分子数，进而提高发光反应效率和发光强度。为增大化合物的水溶性，一方面在合成的最后一步连接能增加化合物水溶性的官能团，另一方面，可在吖啶环上引入亲水基团，如磺酸基等。我们推断通过这两方面的改进，吖啶酯的发光效率会得到进一步提高，超越已有吖啶酯类化合物。这是我们根据反应机理和前面研究结果提出的新思路。
吖啶酯的标记简单易行，可采用琥珀酰亚胺修饰的吖啶酯与蛋白质氨基共价键连接形成酰胺键的方法，在碱性缓冲液中进行标记，标记的蛋白质与游离吖啶酯的分离纯化可采用Sephadex G-50 凝胶柱层析法。
吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立及试剂盒的生成，从原理与方法上讲与其它标记免疫分析方法类似，如免疫分析方法可采用夹心法或竞争法，可引入生物素-链亲和素放大分离系统，固相材料可用96孔板或试管等。最后试剂盒的生成所需要的方法学参数包括检测灵敏度、标准曲线、线性范围、准确度、精密度（包括批内、批间变异）、健全性及与其它方法的相关性、内标、有效期等。
纵上所述，开发吖啶酯类化学发光免疫分析试剂盒，关键技术是吖啶酯的合成，而此关键技术我们已完全掌握且有自已的专利，而且与之相关的化学发光免疫分析技术我们很熟悉，因此在技术上是切实可行的，不存在风险。
&需求资金：报价底价180万元（正好够科研、试制、实验费用，半年可做出稳定的批量产品），无任何弹性。合作方式：投资合作方式为主。
虫洞（北京）卫生科技有限公司&& 戴天岩&&经理
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[公司博客]虫洞医学与生命科学博客.cn/cnyr本站已经通过实名认证，所有内容由潘业大夫本人发表
6周吖啶酯化学发光法抗量抗...
状态：就诊前
希望提供的帮助：
是感染了艾滋病吗？尿道口痛打针输液无效，是艾滋病合并性病吗？
所就诊医院科室：
广西医科大附一 皮肤性病科
8周检测阴性可以排除。其他问题先先泌尿科诊治。
状态：就诊前
我这是急性期症状吗
症状没有任何特异性。
状态：就诊前
我10周酶免阴，但是出现症状的时间和症状吻合，我依然不放心，我该怎么办？想自，杀了
没有什么症状可以诊断艾滋病感染，血液检测阴性就是没有问题。就是艾滋病感染也没有必要自杀，治疗后完全跟正常人一样生活和工作，寿命也一样。
请尽快填表，我需要了解你的情况
大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！
潘业大夫通知通知:各位患者朋友：传染科方面慢性病毒感染长期抗病毒治疗，定时吃药是关键，按时随访复查相关指标也很重要。家庭式看护非常重要，为了避免出现问题时你们束手无策，需要长期咨询或需要医学指导的家庭可以申请家庭医生服务，本人每天会抽出一定的休息时间在网上回复你们的问题，因为平常工作比较辛苦繁忙，有时候回复不及时也请多多谅解，我会尽量照顾到各位患友，祝您早日恢复健康！申请家庭医生流程如下（两种方式）： 1.微信：点击公众号—搜好大夫—点击我的医生—点击“发消息”—选择家庭医生即可 2.好大夫在线APP：搜索医生名称—点击医生—点击“请他做我的家庭医生”即可
大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！
潘业大夫通知出停诊:因休假，于日（周二）停诊，端午假日期间专家门诊30号停诊，请安排好就诊时间，您可以留言或电话咨询，我会尽快回复！
大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！
疾病名称：护士抽血手上有艾滋血递给我化验单会感染吗&&
希望得到的帮助：会不会感染
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疾病名称：怕是恶意扎针症状很多不下十种，情况复杂！&&
希望得到的帮助：请医生给我一些治疗上的建议
病情描述：事情是这样的，公共场所有个女的在身后走过，感觉后背刺痛一下，不是很痛，痛了两天，突然想到艾滋恶意扎针，开始恐惧，后来有二十天感冒了，而且嘴里的黏膜发白，头晕眼花，脖子和腹股沟淋巴结...
疾病名称：9周检测艾滋病抗体为阴可以排除吗&&
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希望得到的帮助：现在淋巴结肿大
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可以排除吗
还需要测三代六周吗
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疾病名称：恐艾&&
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疾病名称：无套口交、带套性交会感染艾滋病吗？&&
希望得到的帮助：前两天嫖娼，和两个小姐无套口交带套性交，会感染艾滋病吗？
病情描述：前两天嫖娼，和两个小姐无套口交带套性交，会感染艾滋病吗？
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潘业，主任医师，籍贯福建泉州，1991年毕业于福建医科大学。 首批“全国肝病科普咨询专家”；“全国肝胆病咨...
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感染性疾病科化学发光法与化学免疫荧光法一样吗
化学发光法与化学免疫荧光法一样吗
一、"荧光粉"发光的启示 为了弄清荧光粉的化学成分，我们首先想到了荧火虫的发光，荧火虫的发光原理主要有以下一系列过程。 成光蛋白质＋成光酵素含氧成光蛋白质（发出绿光） 含氧成光蛋白质＋H2O成光蛋白质 这就是荧火虫为何能持续发光，并且光亮一闪一闪的原因，值得注意的是，荧火虫所发出的绿光是一种"冷光"，其结果转化率竟达97%。 其次，我们又注意了发光塑料的发光，发光塑料主要是在普通塑料中掺进一些放射性物质，如14C、35Sr、90Sr及Na、Th和发光材料ZnS、CaS这些硫化物在放射光线的照射下，被激发而射出可见光（冷光）。 荧光粉的化学成份由模糊的硅酸盐、钨酸盐，单一的元素Ba、Sr最后深化到标准的化学式，其化学组成为： 类别 化学式 颜色 密 度 红 粉 Y2O3：Eu 白 5.1±0.2 绿 粉 CeMgL11O19：Tb 白 4.2±0.2 蓝 粉 BaMgAl10O17：Eu 白 3.7±0.2 双峰蓝粉 BaMgA10O17：（Eu、Mn） 白 3.8±0.2 上转化荧光粉，即红外线激发荧光粉的成分为： 化学组成：YErYbF3 外 观：白色无机粉末 晶粒尺寸：30nm 激发波长：980nm 发光颜色：绿光 特 性：透光率较高，有较高的耐溶剂、耐酸碱性能 应对荧光粉危害的几种方法 由于荧光粉在充入日光灯管过程中，含有较多量的Hg，因此其危害的主要来源就是其散发的Hg蒸气，权威资料显示： 汞蒸气达0.04至3毫克时，会使人在2至3月内慢性中毒；达1.2至8.5毫克量，会诱发急性汞中毒，如若其量达到20毫克，会直接导致动物死亡。 汞一旦进入人体内，可很快弥散，并积累到肾、胸等组织和器官中，慢性汞中毒会导致精神失常，植物神经紊乱，急性症状常头痛、乏力、发热、口腔及消化道齿龈红肿酸痛，靡烂出血，牙齿松动等，部分皮肤红色斑、丘疹，少数肾损害，个别肾疼、胸痛，呼吸困难，紫绀等急性间质性肺炎。 汞如若保管和处置不当，还会对生态环境造成巨大危害，它以各种形态进入环境中，直接污染土壤、空气和水源，再通过食物链进入人体，危害着人们的健康生活，因此绝对不能将日光灯管碎片随处丢弃。 如果室内日光灯管碎裂了，可用碘1克/立方米加酒精后薰蒸或直接用1克/立方米碘分散于地面置8－12小时，这样挥发或升华的碘与空气中的汞生成难挥发的碘化汞（Hg+I2＝HgI2）。用以降低汞蒸气的浓度，还可用5%－10%的三氯化铁或10%的漂白粉冲洗被污染的地面。 一 前言化学发光(chemiluminescence)是指某些化学反应中发出可见光现象。最早发现的化学发光现象发生在生物体内，发光生物体广泛存在于自然界，大约有13大类近千种。1902年Schmitz最早合成的鲁米诺发光试剂被广泛用于血迹鉴定工作。国外化学发光分析方面的研究在20世纪六七十年代得到迅速发展，直到现在，化学发光分析的研究和应用仍然是痕量分析领域的一个十分重要的研究方向。我国的化学发光研究工作起步比较晚，到20世纪70年代后期才有介绍文章，80年代才有原始性的研究报道。在过去的20多年中，我国的化学发光从无到有，从小到大，从国内走向国际，2004年9月第十一届发光光谱分析国际会议在北京召开，标志着我国的化学发光研究走上了一个新的台阶。随着光电转换技术的提高和计算机的普及和使用，化学发光仪器性能获得空前的提高，化学发光的研究和应用得到快速的发展，特别是在临床检验和环境检测方面已经成为不可缺少的分析方法。化学发光检测技术在环保、食品安全、冶金、制药等其它领域也有广泛的应用前景，例如在环保领域对重金属、残留农药、水中有机污染物的检测，化学发光诊断试剂盒可广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断等，同时它还可以应用于环保监测、刑事侦查、海关检查、动植物检验检疫等众多领域。可以这样说，开发出的试剂盒种类越多，仪器使用的范围就越广。二 化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA ，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围广泛，近10年发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。 化学发光与放射免疫法是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和最成熟的检测方法，二者的原理、技术与方法早已成熟并被国外各大医院用于肿瘤检测和激素检测，二者的试剂与仪器均通过美国FDA认证与我国药监局的批准。但是，放射免疫分析法虽有很高的灵敏度，却存在放射性防护和同位素污染的问题，况且试剂价格昂贵只有一个有保质期，在基层医疗机构难以普及。化学放光免疫分析仪继承了放射免疫的所有优点，同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点，是临床免疫检测最理想的新方法。可以肯定的说，她将取代放射免疫和酶联免疫成为临床免疫检测最理想的新技术。1 化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。其反应原理如下: 其中: L 为发光标记物或发光底物,A g 为抗原,A b 为抗体,Sp 为固相。2 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:(1)化学发光标记免疫分析法;(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法2. 1　化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) , 是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光(见图1)。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法(见图2) , 大分子抗原则采用夹心法(见图3) , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。2. 2　化学发光酶免疫分析从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。2. 2. 1　HRP 标记的CL E IA常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) , 或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。其结构如图4 所示。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。
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