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肺癌分子成像探针未来的发展方向
&&&&&&&&&多模态分子成像 肺癌的发展涉及多因素参与，是一个多步骤、多阶段的复杂过程，而且分子靶点在肺癌发生发展过程中呈现动态变化。因此，单一分子靶点往往不能客观反映和描述肺癌复杂的生物学行为及特性。选取多靶点进行联合应用，能更准确地反映体内分子靶点之间相互依赖、相互制约、动态变化的关系，在一定程度上减少诊断的假阳性或假阴性结果，提高肺癌的早期诊断水平。 2009年发表在《自然?方法学》(NatureMet
&&&&&&&&多模态
&&&&&&&&的发展涉及多因素参与，是一个多步骤、多阶段的复杂过程，而且分子靶点在肺癌发生发展过程中呈现动态变化。因此，单一分子靶点往往不能客观反映和描述肺癌复杂的生物学行为及特性。选取多靶点进行联合应用，能更准确地反映体内分子靶点之间相互依赖、相互制约、动态变化的关系，在一定程度上减少诊断的假阳性或假阴性结果，提高肺癌的早期诊断水平。
&&&&&&&&2009年发表在《自然?方法学》(NatureMethods)杂志上的综述强调&融合多种模态分子成像技术可以更准确地对病灶进行定位，能够更敏感地对靶点进行识别&，该综述同时也对多模态融合分子成像技术的必要性和必然性进行了论述。
&&&&&&&&程震等开展了通过亲合体(affibody)修饰铜(64Cu)标记的异质纳米复相结构材料金-铁氧化物靶向EGFR，借助PET、MRI、光学三模态成像从体外(invitro)和在体(invivo)不同层面对EGFR进行可视化的研究，证实了使用多模态成像手段用于对肺癌关键分子靶点EGFR研究的可行性，并证实多模态成像方式能够更敏感地检测EGFR表达。
&&&&&&&&黄钢等通过中外联合研究，在顺磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰针对HER2分子的靶向性多肽H2009.1并且负载抗癌药物DOX，通过MRI监测其对肺癌的靶向成像和治疗效果。
&&&&&&&&克卢扎(Kluza)等利用纳米粒子的靶向分子修饰特性对脂质体MRI纳米分子成像进行双靶向配体标记，协同提高了纳米分子成像探针的分子靶向性和特异性。
&&&&&&&&纳米技术应用
&&&&&&&&近年来，纳米材料及纳米技术的发展极大地推动了分子成像探针的构建，利用纳米材料及纳米技术多成分共输送、长/缓释控、靶向分子修饰及智能化响应等优势构建纳米分子成像探针，可应对肺癌多样的分子分型、独有的解剖学特点、复杂的生理屏障及微环境，从而大大提高纳米分子成像探针的特异性、靶向性及敏感度。利用纳米在体的多成分共输送的特性，研究者可将多种模态分子成像探针共同递送，从而实现多模态分子成像，提高分子靶点的成像识别率。
&&&&&&&&兰杰(Rangger)等利用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽和P物质结合肽双标记多功能纳米脂质体，利用荧光素、放射性核素111In和顺磁性螯合剂对脂质体纳米粒子进行多模态标记，证实了肿瘤细胞&v&3整合素及神经激肽1受体双向体外及在体成像的可行性。克辛格(Kessinger)等人开发了一种荧光染料标记超顺磁性氧化铁纳米粒子构成的&v&3靶向纳米分子探针，在人肺癌小鼠皮下移植瘤体内证实了荧光及MRI双模态高分辨率定量成像新生血管生成的可行性。
&&&&&&&&纳米技术的应用有望解决肺癌分子成像在体分子分型的瓶颈问题，实现肺癌诊疗的重大突破。
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3秒自动关闭窗口利用纳米探针鉴定具有抗癌活性的新型噻唑烷酮类化合物的靶点蛋白及其双靶向抗癌机制的研究--《山东大学》2013年博士论文
利用纳米探针鉴定具有抗癌活性的新型噻唑烷酮类化合物的靶点蛋白及其双靶向抗癌机制的研究
【摘要】：小分子化合物可以通过对细胞内大分子的作用来调节其功能,从而影响细胞的进程。小分子化合物的这种作用,使其在药物开发和生命科学研究上的应用非常广泛。由于许多药物都是基于细胞表型的筛选而发现的,这类药物的作用靶点和作用机理往往是未知的。对于药物作用靶点及其作用机制的研究可以更好地了解药物的治疗效果及其副作用,也为第二代药物的研发提供了很好的导向。然而,尽管技术在不断发展,但是生物活性的小分子化合物的靶点鉴定仍然是药物化学和化学生物学领域的一个关键问题。
常用的靶点鉴定方法大致可以分为两种类型：一种是直接分离鉴定可以与小分子化合物结合的蛋白；另一类方法是通过组学的方式,比如基因组学和蛋白质组学,来寻找化合物作用后的基因和蛋白水平的变化,从而间接的推倒出化合物的作用靶点。与后者相比,直接分离鉴定靶点的方法的好处是可以得到直接的靶点蛋白信息,容易找到化合物最上游的作用靶点。这类方法主要是以亲和纯化为基本思路,需要将化合物连接上可分离的固相载体或者可直接观测的荧光分子等,主要包括亲和层析法、生物素化法、同位素或荧光标记法、光亲和法等。其中,最简单最经典的亲和层析法需要把所研究的化合物修饰后连接到固相载体上,然后与所需的细胞、器官或有机体的裂解物孵育,通过简单的过滤、洗涤、和洗脱将亲和结合而来的蛋白从细胞的全蛋白中分离出来。这种方法的好处在于操作简便,体系复杂程度低,以及适用范围广。然而,由于化合物连接在固相载体上可能使其失去原有的生物活性,从而无法与靶点蛋白结合,所以该方法最大的缺陷在于无法检测连接在固相载体上的化合物是否仍然保持其原来的生物活性。
针对这一点,我们建立了一种利用纳米探针来鉴定化合物靶点蛋白的方法。将待鉴定的小分子化合物修饰连接上含有硫辛酸的结构,使其可以通过金硫键连接在金纳米颗粒表面。这种表面连接有小分子的金纳米探针可以从细胞的全蛋白中“钓”出与小分子特异性结合的靶点蛋白。这种方法是基于亲和层析法建立的,却弥补了亲和层析法的不足。由于金纳米材料具有易于合成,易于表面修饰,易于被细胞摄取,金纳米本身的细胞毒性较小等特点,该方法的优势在于可以进入活细胞,在鉴定靶点蛋白之前判断连接在纳米颗粒上的小分子是否仍保持其生物活性,从而提高靶点鉴定的准确率。
运用这个方法,我们成功地鉴定了能选择性杀死非小细胞肺癌H460细胞的噻唑烷酮类化合物1的作用靶点。在鉴定靶点之前,我们先检测了连接有化合物1的金纳米探针对H460细胞的杀伤作用。在确定了金纳米探针基本保持了化合物1原有的生物活性之后,才开始利用该金纳米探针进行靶点的分离与鉴定。在鉴定的过程中,我们利用了一个与化合物1结构相似的对H460细胞抑制作用很弱的化合物3作为阴性对照,经SDS-PAGE分离后,成功地观察到两条与化合物1特异性结合的蛋白的条带。之后,通过对这两条带中的蛋白进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF/TOF MS)分析和Mascot数据库检索,确定了化合物1的靶点蛋白为微管蛋白(a-tubulin)和热激蛋白90(HSP90)。我们利用细胞外微管聚合实验,H460细胞的微管免疫荧光检测和微管损伤下游蛋白JNK磷酸化的检测,验证了化合物1对微管蛋白的靶向作用；同时,通过检测HSP90底物蛋白CRAF-1, ERBB2和磷酸化的AKT在细胞内的水平,也验证了化合物1对HSP90的作用。我们的工作证明了纳米技术在药物发现和化学生物学研究领域中的重要价值。以往的靶点鉴定方法都必须在知道靶点之后再进行靶点真实性的判断,这将是一个冗长又昂贵的过程,使得作用机制的分析成为药物发现的一个限速步骤。而纳米探针的应用,可以在靶点鉴定之前对探针的生物活性保持与否做出预先的判断,从而提高研究效率,所以纳米探针在这个领域将扮演一个至关重要的角色。除此之外,我们还揭示了新型噻唑烷酮类化合物的微管干扰作用及其双靶向的特性。
微管蛋白作为常用抗癌药物的主要作用靶点之一,一直以来都受到广泛的关注。从微管蛋白正常的聚合/聚被破坏到最终导致细胞死亡的整个过程,受到细胞内多种信号分子的调节。其中,细胞激酶就是一类起关键作用的信号分子。在微管损伤之后,一些激酶可以介导细胞存活,抑制凋亡的发生,而另一些激酶的激活却可以促进细胞凋亡。目前,仍然有很多与微管损伤相关的激酶需要进一步的探究,更好地理解微管损伤与激酶的关系将会大大增强癌症治疗的效果。
鉴于本实验室合成的新型噻唑烷酮类化合物可能作用于微管蛋白及其双靶向的潜质,我们从一系列噻唑烷酮类化合物中筛选出两个在细胞外具有相似抑制微管聚合能力的化合物(探针A和探针B)。通过研究这两个化合物在细胞中的不同效应及对激酶不同的作用能力,来深入探讨激酶在微管损伤后的影响。我们发现,虽然探针A和B在细胞外抑制微管蛋白聚合的能力相当,但是二者在细胞水平上对微管的影响,细胞周期阻滞的恢复及细胞凋亡的程度都有明显的差别。通过体外激酶实验发现,探针A可以显著抑制Dyrk1B激酶的活性,而B化合物对所检测的激酶都没有明显地作用。我们进一步检测了探针A和B在细胞内对Dyrk1B激酶的影响,发现探针A和B引起微管损伤后都可以激活Dyrk1B激酶,但是探针A作用的细胞中Dyrk1B激酶的活性远低于探针B作用后的活性,这不仅更加充分地证明了探针A对Dyrk1B激酶的抑制,而且表明了Dyrk1B激酶在微管损伤后活性会显著的提高。根据已有的关于Dyrk1B激酶介导细胞存活功能的报道,以及我们以上的研究结果,可以认为Dyrk1B激酶在微管损伤后被激活,从而起到保护细胞,维持细胞生存的作用。通过进一步的研究发现,在微管损伤后Dyrk1B激酶介导细胞存活主要通过以下两个途径：一方面,通过促进微管相关蛋白4(MAP4)的表达量升高,从而增强微管的稳定性并使细胞周期从G2/M期阻滞中恢复；另一方面,通过磷酸化p21蛋白促进其向线粒体的转移,从而通过抑制caspase-3的活性来抑制凋亡的发生。除了探究Dyrk1B激酶与微管损伤的关系,本研究还首次报道了一个可以同时抑制抗癌靶点及该靶点抑制引起的修复途径的双靶向化合物探针A。与单靶向微管的探针B相比,双靶向作用带来了高出10倍的癌细胞抑制能力,这为新的抗癌策略的设计提供了新的思路。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：TQ460.72【目录】：
摘要10-14Abstract14-18符号说明18-19第一章 绪论19-54 1.1 小分子化合物靶点鉴定方法概述19-30
1.1.1 采用亲和层析法的靶点鉴定策略19-21
1.1.2 采用生物素化法的靶点鉴定策略21-26
1.1.3 采用同位素或荧光标记法的靶点鉴定策略26-27
1.1.4 采用光亲和法的靶点鉴定策略27-28
1.1.5 靶点蛋白种类的鉴定和验证28
1.1.6 现存靶点鉴定方法的不足与利用金纳米探针鉴定靶点的优势28-30 1.2 金纳米颗粒的合成,与细胞的相互作用及其在靶点鉴定中的应用30-34
1.2.1 金纳米颗粒的合成方法30-31
1.2.2 金纳米颗粒与细胞的相互作用31-33
1.2.3 金纳米颗粒在靶点鉴定中的应用33-34 1.3 细胞内激酶对微管损伤后的细胞存活的影响34-38
1.3.1 微管损伤后促进细胞凋亡的激酶35-36
1.3.2 微管损伤后维持细胞存活的激酶36-37
1.3.3 Dyrk1B激酶的功能及其在微管损伤后的作用37-38 1.4 本研究工作的意义与前景38-39 1.5 参考文献39-54第二章 利用纳米探针鉴定新型噻唑烷酮类化合物的抗癌靶点54-83 2.1 引言54-55 2.2 主要实验材料55-56 2.3 主要实验仪器56-57 2.4 实验方法57-65
2.4.1 化合物2和4的设计与合成57-61
2.4.2 金纳米探针GNP-2 and GNP-4的合成61
2.4.3 金纳米探针的电镜观察61
2.4.4 定量金纳米探针表面连接的化合物的数量61
2.4.5 非小细胞肺癌H460细胞的培养61-62
2.4.6 细胞存活率的检测62
2.4.7 金纳米探针细胞摄入的电镜观察62-63
2.4.8 H460细胞裂解液的准备63
2.4.9 靶点蛋白的鉴定63
2.4.10 微管蛋白聚合实验63-64
2.4.11 微管免疫荧光实验64
2.4.12 蛋白印迹法(Western Blot)检测64-65
2.4.13 流式细胞术检测细胞周期分布65 2.5 结果与讨论65-77
2.5.1 阴性对照小分子化合物3的细胞效应确定65-66
2.5.2 金纳米探针GNP-2和GNP-4的表征66-68
2.5.3 金纳米探针的生物活性68-70
2.5.4 利用金纳米探针进行化合物1的靶点鉴定70-73
2.5.5 化合物1的靶点验证73-76
2.5.6 化合物1引起细胞周期阻滞和凋亡的发生76-77 2.6 结论77-78 2.7 参考文献78-83第三章 双靶向抑制微管聚合及Dyrk1B激酶的新型噻唑烷酮类化合物的研究83-111 3.1 引言83-84 3.2 主要实验材料84-85 3.3 主要实验仪器85-86 3.4 实验方法86-90
3.4.1 探针A和B的合成与表征86
3.4.2 细胞外微管蛋白聚合实验86-87
3.4.3 横纹肌肉瘤RD细胞的培养87
3.4.4 免疫荧光实验87
3.4.5 流式细胞术检测细胞周期分布87
3.4.6 RD细胞裂解液的准备87-88
3.4.7 细胞凋亡的检测88
3.4.8 细胞存活率的检测88-89
3.4.9 KINOMEscan's激酶实验89
3.4.10 细胞外Dyrk1B激酶活性的检测89
3.4.11 免疫复合物激酶试验89-90
3.4.12 蛋白印迹法(Western Blot)检测90 3.5 结果与讨论90-106
3.5.1 两个小分子探针具有相似的微管聚合抑制作用90-92
3.5.2 两个小分子探针引发不同的细胞效应92-98
3.5.3 与探针B相比,探针A可以抑制Dyrk1B激酶的活性并阻断Dyrk1B相关的细胞修复途径98-102
3.5.4 微管损伤后Dyrk1B激酶介导的细胞存活效应的程度定量102-103
3.5.5 Dyrk1B相关的维持细胞存活的机制103-106 3.6 结论106-107 3.7 参考文献107-111附录1111-112附录2112-114附录3114-118附录4118-121致谢121-122攻读博士期间发表的学术论文目录122-124学位论文评阅及答辩情况表124
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> 肺癌种类很多，诊断时一定要注意鉴别
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病情描述（发病时间、主要症状、症状变化等）：
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想得到怎样的帮助：
绕过心脏大血管返行至喉。以上向大家介绍了哪些是肺癌的早期表现。进而支配发音器官。
3、面、颈部水肿是肺癌晚期常见症状。淋巴结转移长见于锁骨上淋巴结。室内用煤。目前已公认长期接触铀、镭等放射性物质及其。
因不能面诊，医生的建议仅供参考
职称：医生会员 |
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我的建议：
绕过心脏大血管返行至喉。以上向大家介绍了哪些是肺癌的早期表现。进而支配发音器官。
3、面、颈部水肿是肺癌晚期常见症状。淋巴结转移长见于锁骨上淋巴结。室内用煤。目前已公认长期接触铀、镭等放射性物质及其衍化物、致癌性碳氢化合物、砷、铬、镍、铜、锡、铁、煤焦油、沥青、石油、石棉、芥子气等物质。出现头痛、恶心、呕吐、精神异常等症状。多数发热由肿瘤引起的阻塞性肺炎所致。可引起颅内高压。在临床中很多见。应及。
我的建议：
时就医用药。一定要谨记吸ｃｈｎeeｂｅrg矿区肺癌发病率高的报道。　　以上介绍的三点都是可以导致肺癌的主要因素。肿瘤直接侵犯胸膜或心包时。多无痛感。转移到骨骼。我们的专家可以为大家做出更科学详细的讲解。尽量避免感冒。表现为淋巴结固定坚硬、逐渐增大、增多。肺癌的胸外转移比较容易辨别。空气污染包括室内的小环境以及室外大环境污染。以免发生肺炎。主要是鳞癌和未分化小细胞癌。彻底治疗。接触煤烟或者是其不完全。
我的建议：
燃烧物为肺癌的危险因素。尤其是经常吸烟的朋友。该疗法不是放化疗。便产生声嘶现象。这是因为控制发音功能的喉返神经由颈部至胸部。北京肿瘤医院专家建议：肺癌治疗可采用中医分子靶向免疫治疗体系进行治疗。若肿瘤侵及纵隔左侧令喉返神经受迫。会引起胸腔积液、心包积液。最后导致面、颈部水肿。不要在空气污浊的场所停留。此外肺支气管慢性炎症以及肺纤维疤痕病变。大气污染是一个非常重要的致肺癌因子。均可诱发肺癌。避免吸入。
我的建议：
二手烟。可引起骨痛和病理性骨折。二氧化硫、氧化氮和一氧化碳等。可以随时咨询北京国龙中医医院的专家。经过多年的调查研究。状。如果发生上呼吸道感染。对于肺癌的早期表现不可掉以个因素也是由于大气污染造成的肺癌产生。
2、声音嘶哑是肺癌晚期典型症状。不是手术治。希望可以有效的帮助到大家。令颈静脉因回流不畅而怒张。（四）肺部慢性疾病 如肺结核、矽肺、尘肺等可与肺癌并存。应随时监控并尽早治疗缓解。其中主要有。
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