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HPLC-EC检测法测定血浆中的罗红霉素*
来源：青年人()&更新时间： 16:22:24 &【字体： 】
摘要　目的：建立测定血浆中罗红霉素浓度的HPLC-EC检测法，并与微生物法的测定结果相比较，评价两种方法的相关性。方法：以克拉霉素为内标，C18反相色谱柱，流动相为甲醇-乙腈-0.06mol.L-1磷酸二氢钠-0.003mol.L-1EDTA (0.11∶0.39∶0.49∶0.01,pH7.0)，安培型电化学检测器的工作电压+1.2V；0.5ml血浆样品经液-液萃取纯化后溶于流动相中，进样20μl。结果：本法的线性范围0.1～10mg.L-1，日内RSD＜3.2%，日间RSD＜5.5%，方法回收率99.5%～103.3%，最低检测限0.1mg.L-1。比较HPLC和微生物法的测定结果，相关性显著(P＜0.01)。结论：方法灵敏度高，重现性好，操作简便，适用于罗红霉素的药代动力学研究。关键词　罗红霉素；电化学检测法；微生物法；相关性
Determination of roxithromycin in human plasma using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection
Tian Lei (Tian L),Zhong Dafang (Zhong DF) (Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,110015)
ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a HPLC method for the determination of roxithromycin in human plasma using electrochemical detection,and to compare the results measured by HPLC with that by microbiological assay for assessing the correlation of the two methods.METHODS:Clarithromycin was used as the internal standard.The mobile phase consisted of CH3OH-CH3CN-NaH2PO4-EDTA (0.11∶0.39∶0.49∶0.01) and was adjusted to pH 7.0.The applied potential of the amperometric detection was set at +1.2v and the extracts of samples were chromatographed on a C18 reversed-phase column after liquid-liquid extraction.RESULTS:The method was linear over the range 0.1～10mg.L-1.The intra-day RSD was less than 3.2% and the inter-day RSD less than 5.5%.Method recovery was 99.5%～103.3% and the limit of quantification was 0.1mg*L-1.Analytical results for roxithromycin in plasma samples (n=280) between the two methods was found to be correlated lineal (P＜0.01).CONCLUSION:The method has good selectivity,sensitivity and reproducibility and has proved to be suitable for pharmacokinetic studies of roxithromycin in human.KEY　WORDS　roxithromycin,electrochemical detection,microbiological assay,correlation
　　罗红霉素(roxithromycin,RM)是一种新的半合成大环内酯类抗生素，有其血浆浓度的检测方法，国外多采用反相HPLC-EC检测［1～2］，但国内多用微生物法，也有HPLC-UV检测法的报道［3］。我们建立了罗红霉素的HPLC-EC检测法，并与微生物法的测定结果进行了比较［4］，以评价两种方法的相关性。
1　实验材料与方法1.1　试剂与仪器　　罗红霉素对照品(沈阳华泰药物研究所，由中国药品生物制品检定所标定，含量为95.4%)；内标克拉霉素(黑龙江省药品检验所)。甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。二氯甲烷用前重蒸馏。　　高效液相色谱仪(包括LC-10AD泵，L-ECD-6A电化学检测器，日本岛津公司)；WDL-95色谱工作站(中国科学院大连化学物理研究所)。1.2　实验方法1.2.1　色谱条件　色谱柱为Alltima C18柱(200mm×4.6mm,5μm,天津凯德公司)；流动相为甲醇-乙腈- 0.06mol.L-1磷酸二氢钠-0.003mol.L-1 EDTA(0.11∶0.39∶0.49∶0.01)，用2mol.L-1 NaOH 调节pH7.0；流速1.0ml.min-1；工作电压+1.2V，柱温20℃。1.2.2　血浆样品预处理　取0.5ml血浆样品，加入甲醇100μl和内标克拉霉素溶液50μl(40mg.L-1甲醇溶液)，用0.1mol.L-1碳酸钠溶液200μl碱化血?　国家自然科学基金资助项目第号样，涡流混匀后再加入正己烷-二氯甲烷-异丙醇(0.65∶0.32∶0.03)3ml，涡流混合1min，往复振荡10min，离心后取有机相于45℃下氮气流吹干，残留物溶于100μl流动相中，进样20μl。
2　实验结果2.1　方法专属性　　将受试者空白血浆的色谱图与血浆中加入罗红霉素及内标物得到的色谱图进行比较，证明血浆中的内源性物质不干扰测定，见图1。罗红霉素和内标的保留时间分别为11.9min和10.2min。
图1　测定血浆中罗红霉素浓度的色谱图A-空白血浆样品；B-空白血浆中加入RM及内标；C-给药后3h受试者血样；1-内标；2-罗红霉素
2.2　标准曲线和线性范围　　取空白血浆0.5ml，依次加入罗红霉素标准系列甲醇溶液100μl，使之分别对应血浆浓度0.1，0.2，0.5，2.0，5.0，10.0mg.L-1，其余同“血浆样品预处理”项下操作，依法测定，以罗红霉素的浓度为横坐标，以待测物与内标的峰高比为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归，罗红霉素的线性范围为0.1～10mg.L-1(r=0.5，n=3)，最低定量浓度为0.1mg.L-1。2.3　精密度和准确度　　按“标准曲线”项下操作，制备罗红霉素低、中、高3个浓度(分别为0.2，2.0，10.0mg.L-1)的质量控制样品(QC)，6样本，连续测定3d，并与标准曲线同时进行，计算QC样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的精密度与准确度，以相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。本法的RE＜4%，日内RSD＜3.2%(n=6),日间RSD＜5.5%(n=18)，方法回收率99.5%～103.3%，均符合目前生物分析方法指导原则的要求［5］。2.4　受试者血药浓度测定结果　　采用本法测定了10名男性健康受试者交叉po罗红霉素分散片(制剂A)和罗红霉素片(制剂B)150mg后的血浆样本，以当日的标准曲线计算各时间点样本中罗红霉素的浓度，同时测定QC样本(3个浓度，双样本)以保证结果的可靠性。10名受试者po制剂A和制剂B后的平均药时曲线见图2。
图2　健康受试者po150mg罗红霉素后的平均药-时曲线—　▲　—-制剂A；—　◇　—制剂B
2.5　HPLC与微生物法测定结果的比较　　本次实验的全部血浆样品(n=280)均经过HPLC-EC检测法和微生物法两种方法平行测定。微生物法采用管碟检验法［4］，以藤黄八叠球菌(CMCC(B)28001)为试验菌株，抑菌圈直径与血浆中罗红霉素浓度的对数呈线性关系，线性范围0.4～0.6mg.L-1，最低定量浓度为0.35mg.L-1。以微生物法的测定结果为横坐标，HPLC的测定结果为纵坐标，绘制相关图，见图3。两种方法的相关直线方程为Y＝12.3X+0.0673，r=0.8982。对相关系数r进行统计学t检验，结果证明两种方法的测定结果相关性显著(P＜0.01)。根据HPLC和微生物的测定结果分别求算药代动力学参数，结果见表1。以制剂B为对照制剂，由两种方法求得的相对生物利用度分别为(278.2±225.1)%和(280.7±252.0)%。
表1　受试者po 150mg罗红霉素后的药代动力学参数
t1/2（ke）/h
10.12±3.12
13.67±5.24
11.77±2.87
14.33±9.30
　1.57±1.04
　3.50±1.58
　1.70±0.92
　3.70±1.57
cmax/mg.L-1
　6.54±1.96
　2.61±1.69
　4.97±1.17
　2.04±1.26
76.31±37.72
38.31±18.65
62.25±11.91
35.03±16.88
图3　HPLC与微生物法测定结果的相关图
3　讨　论　　与红霉素一样，罗红霉素仅在短波长范围内有很弱的紫外吸收(≤235nm)，用紫外法测定生物样品时灵敏度低，不适用于药代动力学研究。但因其氨基糖结构中含有一个可被氧化的叔胺基，从而被电化学检测器检测，专属性强，灵敏度高。与其它电化学活性化合物相比，红霉素类化合物具有相对较高的氧化电位，因此文献中认为［6］需用双电极库仑型电化学检测器测定此类化合物，而不宜用安培型检测器，因为后者可能在测试过程中灵敏度下降很快，且背景干扰大。但本实验采用单电极安培型检测器，在数百个血浆样品连续测定过程中未见灵敏度下降，且色谱图基线平稳。为了选择适宜的工作电压，本实验考察了外加工作电压和信号响应值之间的关系，结果见图4。在工作电压+1.2V下，罗红霉素具有最大的信号响应值，且背景噪音较小。
图4　罗红霉素的外加电压-信号强度曲线
　　采用电化学检测器时，流动相的pH和离子强度均对信号响应有影响。在较高的pH条件下可促进大环内酯类抗生素的电化学氧化［6］，提高灵敏度，使分析物的保留时间延长，但pH过高对色谱柱的损害也相应增大，因此本实验选择流动相pH7.0，既保证了样品测定不受干扰，保留时间适宜，又满足了实验灵敏度的要求。在预试验中，曾采用磷酸二氢铵-氨缓冲液配置流动相，但信号响应不及用磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液的流动相强。　　在测定罗红霉素时，文献多采用红霉素作为内标［2～3］。红霉素在水溶液中易发生降解反应，色谱行为较差，给测试过程带来不便。本方法首次使用克拉霉素作为内标，它是罗红霉素的结构类似物，稳定性好，且与罗红霉素的保留时间、信号响应程度接近，保证了方法的准确性和重现性。　　HPLC测定的是样品中罗红霉素的浓度，具有较高的选择性；微生物法测定的是样品对敏感菌株的抑菌活性 ，将其转化为浓度时，可能受到血浆蛋白结合、活性代谢物等因素的影响。因此，两者的结果在理论上不是完全相等的。　　本实验建立的HPLC比微生物法的线性范围宽，仅对测得浓度在6.4mg.L-1以内的数据对进行相关分析，则线性相关方程为Y＝1.13X+0.1195,r＝0.9168,相关程度有显著提高，说明两种测定方法在低浓度范围内的相关程度比高浓度范围内的好，这与微生物法在高浓度范围内有抑菌饱和趋势有关，提示采用微生物法测定时线性范围不宜设定过宽。对由两种方法得出的主要药代动力学参数进行统计学检验，除cmax外均无显著性差异(P＞0.05)，说明HPLC和微生物法均适合罗红霉的药代动力学研究。　　红霉素肟醚类衍生物因其侧链的羟肟键而具有Z型和E型两种立体异构体，罗红霉素是E构型的红霉素肟醚衍生物，其体内抗菌活性是Z构型衍生物的3倍［7］。我们通过LC/MS联用技术对血浆和胆汁中罗红霉素的立体异构进行了研究，发现在血浆中仅有E构型的罗红霉素原形药物，适宜于应用本法测定；而胆汁中Z，E两种构型的异构体都存在，相应的检测方法尚在进一步研究中。
作者单位：田蕾　钟大放　　 (沈阳110015沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室)
　1　　Birkert DJ,Robson RA,Grgurinovich N,et al.Single oral dose pharmacokinetics of erythromycin and roxithromycin and the effects of chronic dosing.Ther Drug Monit，):65.　2　　Demotes-Mainaird FM,Vincon GA,Jarry CH,et al.Micro-method for the determination of roxithromycin in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography using electrochemical detection.J Chromatogr，):115.　3　　秦永平，黄英，梁茂植，等.血清中罗红霉素的反相高效液相色谱法测定.药物分析杂志,)：249.　4　　钟大放，黄海华，王爱民，等.罗红霉素片剂生物利用度的比较研究.药学学报,1998，33.　5　　Shah VP,Midha KK,Dighe S,et al.Analytical methods validation:bioavailability,bioequivalence and pharmacokinetic studies.J Pharm Sci,):309.　6　　Duthu GS.Assay of erythromycin from human serum by high performanec liquid chromatography with electrochemical detection.J Liq Chromatogr,):1023.　7　　Gasc JC,D?A mbrieres SG,Lutz A,et al.New ethr oxime deriatives of erythromycin A：a structure-activity relationship study.J Antibiotics,):313.
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