一氧化碳释放分子对炎性环境人牙龈成纤维细胞粘附分子表达的影响--《山东大学》2011年博士论文
一氧化碳释放分子对炎性环境人牙龈成纤维细胞粘附分子表达的影响
【摘要】：慢性牙周炎(chronic periodontitis)是危害人类健康的口腔疾病,是目前成年人牙齿缺失的主要原因。口腔内龈下区以格兰氏阴性菌占主导地位的病原菌及其分泌的内毒素脂粘多糖(lipopolysaccharide, LPS)不仅能对牙周组织产生直接的破坏,还能够激发宿主的免疫反应。其中,T细胞、B细胞以及单核细胞／巨噬细胞等免疫活性细胞大量浸润至牙周组织内并分泌产生炎性因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β),IL-6,以及前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)等,造成进一步的牙周组织损害。其中,TNFα和IL-1β被认为是与牙周破坏密切相关的两种最重要的炎性因子[1]。
免疫活性细胞向局部炎性牙周组织内的迁移(migration)、浸润(infiltration)和驻留(residence)是慢性牙周炎最重要的病理变化之一[2,3]。这一病理过程依赖于血管内皮细胞(vascular endothelial cell)和牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast)各种粘附分子(adhesion molecules)的表达[4,5]。其中,血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1),细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1),内皮细胞白细胞粘附分子(endothelial leukocyte adhesion molecule 1, E-selectin)已被研究证实为与炎性反应密切相关的最重要的粘附分子[4,5]。
牙龈成纤维细胞是牙周组织中含量最多的细胞[6]。研究发现,牙龈成纤维细胞不仅能维持牙周组织的整体性,在局部牙周免疫炎性反应中也具有重要意义[6,7]。在炎性环境中,血管内皮细胞表面的粘附分子表达增强,粘附分子作为配体与免疫活性细胞表面的受体结合,导致免疫活性细胞粘附继而浸润至血管周围的牙龈组织中,并继续产生和分泌炎性因子,如TNF-α和IL-1β[8]。在多种炎性因子的刺激下,牙龈成纤维细胞表面的粘附分子也出现表达增强,导致浸润的免疫活性细胞更长时间的驻留于局部炎性组织中[5,9,10],浸润细胞不断产生的炎性因子进一步强化了局部的免疫应答,延长了炎性反应时间,对组织造成了更加严重的损害。因此,降低牙龈成纤维细胞粘附分子的表达,从而减少浸润细胞进一步在牙周组织中的驻留成为牙周病治疗中的一个有效措施。研究表明,粘附分子的表达依赖于核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)的转录调控,抑制NF-κB的转录活性可以降低粘附分子的表达[5,11]。
一氧化碳(carbon monoxide, CO)是血红素(heme)代谢的产物。血红素在血红素氧化酶(heme oxygenase, HO)的催化作用下,在体内代谢产生一氧化碳,铁和胆绿素[12]。适量的一氧化碳已被证实在诸多细胞生命过程中具有重要意义,如抑制细胞增殖(proliferation)[13,14],抑制免疫炎性反应[15,16],减少肾脏、肝脏和心脏移植过程中的缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury)[17-20],调节血管活性[21]等。近几年,一类新型的化合物一氧化碳释放分子(carbon monoxide releasing molecue, CORM)引起了广泛的关注[22]。CORM包括多种不同的能够可控制地释放CO的化合物。其中,CORM-3为水溶性化合物,一旦溶于水便可快速地释放CO[22]。研究显示, CORM作为CO的替代物质,不仅具有与CO相似的生物学行为,而且克服了应用CO剂量难以控制,应用途径单一的缺点。因此在科研和临床上都具有更加光明的前景。
在对已有文献的综合分析基础上,我们首次将CORM引入牙周炎相关研究中。本实验中,我们以人牙龈成纤维细胞为体外(in vitro)实验模型,以TNFα和IL-1β的共同存在模拟体外炎性环境,研究CORM-3对炎性环境下牙龈成纤维细胞粘附分子表达的调节作用,并探讨其可能的作用机制,旨在为探索牙周病的新型治疗药物和方法提供科学的理论基础和实验依据。
材料和方法
第一部分：CORM-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞粘附分子表达的影响
我们首先收集临床上因需拔除埋伏牙而获得的健康牙龈组织,用组织块法培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGF),以此建立了细胞模型；通过细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的测定来检测500μM的CORM-3对细胞生长的影响,从而确定其是否对细胞产生毒性反应；以50ng.ml-1的TNF-α和10ng.ml-1的IL-1β共同刺激细胞,以模拟体外的炎性环境。同时在部分培养瓶中加入浓度为500μM的CORM-3。在刺激的不同时间点收集细胞,用常规Trizol方法提取细胞总RNA,然后用RT-PCR测定细胞ICAM-1,VCAM-1和E—Selectin的mRNA表达,以研究两种炎性因子在mRNA水平上对粘附分子表达的影响以及CORM-3的调控作用；在不同时间点收集细胞后提取细胞总蛋白,用Western Blot方法测定ICAM-1, VCAM-1和E-Selectin的蛋白表达,以研究两种炎性因子在蛋白水平上对粘附分子表达的影响以及CORM-3的调控作用；根据CORM-3的动态释放曲线,研究完全释放掉CO的CORM-3对炎性环境下细胞粘附分子的调节作用,以说明CORM的作用是否来自于CO；为研究CORM-3对细胞粘附分子的调控作用是否真正降低了免疫活性细胞对细胞的粘附作用,我们进行了功能性粘附实验,采集健康志愿者的外周血,用梯度密度离心方法提取了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),然后以细胞荧光标记物CSFE-DA标记PBMC。将PBMC置于HGF上,共同孵育3小时后,以磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline, PBS)轻轻冲洗上层细胞,荧光显微镜下观察不同条件下PBMC对HGF的粘附情况的改变。
第二部分:CORM-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞粘附分子表达影响的作用机制
为研究CORM-3的作用是否通过先前多有报道的鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase, GC)系统,将GC抑制剂ODQ用于CORM对粘附分子的调节作用实验；为检测CORM-3对炎性因子刺激下转录因子核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)活性的影响,我们用DEAE-dextran为主要转染试剂将含有NF-κB反应元件的报告基因载体(6-κB.luc)瞬时转染至HGF中,同时转染的还有泛素依赖的Renilla荧光素酶报告基因,通过Dual-Glo荧光素酶检测系统检测荧光素酶的活性,以此说明NF-κB的结合活性；NF-κB家族中两个最主要的亚型为NF-κB-p50和NF-κB-p65,在TNF-α和IL-1β共同刺激细胞4小时后,对加入或不加入CORM-3的细胞提取核蛋白,通过Western Blot方法检测NF-κB-p50和NF-κB-p65的核内表达情况,以检测CORM-3是否对此具有调节作用；在炎性因子刺激的不同时间点,用Western Blot检测细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK), p38和jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表达及磷酸化情况,以明确丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)系统在CORM-3的调节作用中的地位。
第一部分：根据以往研究及预实验结果,选定500μM为本实验中CORM-3的工作浓度。LDH的实验结果显示500μM的CORM-3刺激细胞HGF或PBMC24小时后,细胞的数量及形态与正常培养液中生长的细胞无明显差异,提示该浓度的CORM-3对HGF或PBMC未见毒性作用；以50ng.ml-1的TNF-a和10ng.ml-1的IL-1β共同刺激细胞12小时、24小时后,粘附分子ICAM-1, VCAM-1和E-Selectin的mRNA表达水平均有明显增强,条带定量分析结果显示差异具有显著性(p0.01),而500μM的CORM-3可显著性抑制这一表达的增强(p0.01)；Western Blot的结果显示,TNF-a和IL-1β共同刺激细胞8小时、24小时后,ICAM-1, VCAM-1和E-Selectin的蛋白表达水平均出现显著增强(p0.01),CORM-3同样表现出对上述粘附分子蛋白表达的抑制作用(p0.01)；根据CORM-3的动态释放曲线,将完全释放掉CO的CORM-3进行上述实验,结果显示CORM-3失去了对ICAM-1蛋白表达的调节作用,说明CORM的调节作用来源于CO; PBMC功能性粘附实验的结果表明,两种炎性因子的共同刺激可导致PBMC对HGF的粘附作用增强(p0.01),以ICAM-1, VCAM-1的中和性抗体同时作用HGF后,该粘附增强现象消失,说明炎性因子导致的粘附增强现象主要通过ICAM-1和VCAM-1介导。CORM-3可显著抑制TNF-α和IL-1β导致的PBMC对HGF的粘附增强(p0.01),表现为粘附于HGF的绿色荧光标记的PBMC数量的减少。
第二部分：ODQ为GC的抑制剂。蛋白检测结果显示ODQ不能改变CORM-3对炎性刺激下ICAM-1的调节作用,说明CORM的调节作用不是通过GC系统来实现的；瞬时转染和报告基因的检测结果显示,自TNF-α和IL-1β共同刺激细胞4小时后,即出现转录因子NF-κB的活性显著性增强(p0.01),而CORM-3可显著性抑制NF-κB的活性(p0.01)；TNF-α和IL-1β共同刺激细胞4小时后核蛋白的Western Blot检测结果显示,NF-κB-p50的核内表达无明显变化,而NF-κB-p65的核内表达有显著性增强(p0.01),CORM-3同样能够显著性抑制NF-κB-p65的核内表达(p0.01),提示NF-κB-p65在CORM-3对HGF粘附分子的调节作用中可能具有重要作用；在TNF-a和IL-1β共同刺激HGF10分钟、20分钟后收集细胞,Western Blot检测结果表明,两种炎性因子的共同刺激可显著增强p38,ERK和JNK的磷酸化水平,而CORM-3能够显著性抑制炎性介质导致的p38磷酸化水平(p0.01),但对ERK和JNK的磷酸化水平无显著影响。
正常情况下,人牙龈成纤维细胞(HGF)只能表达极其微弱的ICAM-1, VCAM-1和E-Selectin。然而在炎性因子TNF-a和IL-1β的共同刺激下,这些粘附分子的表达无论在mRNA水平还是蛋白水平均出现显著增强,CORM-3通过其释放的CO可显著抑制三种粘附分子的表达,显示出一定的抗炎作用。CORM-3对粘附分子的表达抑制导致了炎性环境下由ICAM-1和VCAM-1为主要介导的人外周血单核细胞(PBMC)对HGF的粘附作用的显著降低,表明其在免疫活性细胞对HGF的粘附作用中的功能性调节作用。
CORM-3对HGF粘附分子的调节作用并非通过以往多有报道的鸟苷酸环化酶(GC)通路,而是通过其对转录因子NF-κB的调节作用来实现的,表现为CORM-3可显著抑制两种炎性因子共同刺激下细胞转录因子NF-κB的活性,这一作用可能是通过其降低NF-κB家族的主要亚型NF-κB-p65的核内表达来完成的。CORM-3还能够抑制TNF-α和IL-1β导致的p38磷酸化水平的升高,提示CORM对MAPK系统的调节作用可能部分参与了其对HGF粘附分子的调节作用。
HGF粘附分子的表达上调在免疫活性细胞向炎性牙周组织的浸润和驻留过程中具有重要作用,并且被认为是疾病预后的决定因素之一,因此,降低免疫活性细胞对HGF的粘附,从而控制牙周炎的病理性炎症反应,是牙周炎治疗中的重要环节。CORM-3对炎性环境下HGF粘附分子的抑制作用及其对转录因子NF-κB的调节作用使其成为极具潜力的牙周炎治疗新方法。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R781.4【目录】：
符号说明6-8摘要8-13Abstract13-18前言18-27第一部分 一氧化碳释放分子-3(CORM-3)对炎性环境下人牙龈成纤维细胞(HGF)粘附分子表达的影响27-43 第一节 人牙龈成纤维细胞的培养和一氧化碳释放分子-3对细胞的毒性检测27-32 第二节 一氧化碳释放分子-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞粘附分子表达的影响32-43第二部分 一氧化碳释放分子-3(CORM-3)对炎性环境下人牙龈成纤维细胞(HGF)粘附分子表达影响的机制43-56 第一节 鸟苷酸环化酶(GC)在CORM-3对炎性环境下HGF粘附分子表达影响中的作用43-46 第二节 CORM-3抑制炎性因子刺激下细胞核内NF-κB-p65的表达46-52 第三节 CORM-3对炎性因子刺激下MAPK系统的影响52-56讨论56-60参考文献60-68致谢68-69攻读博士期间已发表的论文69-70附录 英文论文70-112学位论文评阅及答辩情祝表112
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京公网安备74号一、问答题：针对相关问题作简明扼要的回答。
1．PCR-SSCP用于细胞粘附分子基因的多态性测定的主要缺点是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:主要缺点是：①测定点突变时，不能排除假阳性，测定特异性必须由DNA测序来证实；②PCR-SSCP的测定操作难于标准化。PCR-SSCP测定的影响因素较多，没有一个适合于各种情况下的通用实验条件，实验室必须根据自己的摸索，得出自己实验室的最适实验条件。因此，PCR-SSCP对实验操作者的经验要求较高，不好掌握，应用不是很普遍。
2．简述细胞表面粘附分子的测定的意义。答案：显示答案&&&&正确答案:组织细胞活检标本的特定细胞粘附分子测定，可作为恶性肿瘤诊断和预后的指标。LI-钙粘素是肠道特异的细胞粘附分子，胃活检组织标本的LI-钙粘素免疫组化测定可作为胃化生和肿瘤形成及分化较好的腺癌的一个重要的早期辅助诊断指标。对组织标本的E-钙粘素的免疫组化测定为阴性，可能预后不良，如E-钙粘素测定可作为已分化的甲状腺癌的一个独立的预后指标。
3．可溶性细胞粘附分子的测定的临床意义。答案：显示答案&&&&正确答案:血液循环中可作为疾病辅助诊断的可溶性细胞粘附分子主要有免疫球蛋白超家族的VCAM-1和ICAM-1和选择性家族。ICAM-1在肝病、寄生虫病如阿米巴病、贾第虫病和弓形体病等、转移癌、溃疡性结肠炎等的患者血循环中浓度明显增高，其测定可作为血管内皮损伤及疾病严重程度的诊断指标。VCAM-1在肾功能损害、自身免疫病如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等、器官移植排斥、深静脉栓塞等的患者血循环中有明显增高。在深静脉栓塞手术后的病人血清中检测VCAM-1，可作为静脉血栓症的早期诊断指标。在器官移植的病人，在移植器官发生排斥反应前数天，即可测出病人血液中VCAM-1有明显升高，可作为器官移植后监测早期排斥发生的非侵入性指标。E、L和P三种类型的选择素均可出现于血循环中，可溶性B选择素的增高可见于糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫病、败血症、结节性多动脉炎和巨大细胞动脉炎等疾病患者血循环中，这种增高与疾病的活动性无关，而与器官受损伤的程度相关。因此，血液中可溶性E选择素水平的测定可作为疾病严重程度及预后的辅助诊断指标。血液中可溶性L-选择素的增高可见于败血症、HIV感染和AIDS患者，L-选择素具有抑制白细胞对内皮细胞粘附的功能，因此，血液中可溶性L-选择素的增高可作为疾病预后的辅助诊断指标。血液中可溶性P-选择素的增高可见于溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者，P-选择素可阻断TNF-α对β整合素的激活，进而抑制中性粒细胞与内皮细胞的粘附。<input name='Answer_10106_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='血液循环中可作为疾病辅助诊断的可溶性细胞粘附分子主要有免疫球蛋白超家族的VCAM-1和ICAM-1和选择性家族。ICAM-1在肝病、寄生虫病如阿米巴病、贾第虫病和弓形体病等、转移癌、溃疡性结肠炎等的患者血循环中浓度明显增高，其测定可作为血管内皮损伤及疾病严重程度的诊断指标。VCAM-1在肾功能损害、自身免疫病如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等、器官移植排斥、深静脉栓塞等的患者血循环中有明显增高。在深静脉栓塞手术后的病人血清中检测VCAM-1，可作为静脉血栓症的早期诊断指标。在器官移植的病人，在移植器官发生排斥反应前数天，即可测出病人血液中VCAM-1有明显升高，可作为器官移植后监测早期排斥发生的非侵入性指标。E、L和P三种类型的选择素均可出现于血循环中，可溶性B选择素的增高可见于糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫病、败血症、结节性多动脉炎和巨大细胞动脉炎等疾病患者血循环中，这种增高与疾病的活动性无关，而与器官受损伤的程度相关。因此，血液中可溶性E选择素水平的测定可作为疾病严重程度及预后的辅助诊断指标。血液中可溶性L-选择素的增高可见于败血症、HIV感染和AIDS患者，L-选择素具有抑制白细胞对内皮细胞粘附的功能，因此，血液中可溶性L-选择素的增高可作为疾病预后的辅助诊断指标。血液中可溶性P-选择素的增高可见于溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者，P-选择素可阻断TNF-α对β整合素的激活，进而抑制中性粒细胞与内皮细胞的粘附。'/>
4．实时荧光PCR方法用于细胞粘附分子基因的多态性测定的主要优缺点是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:优点主要是：①扩增和产物测定同时完成，扩增反应管在测定的始终总是处于闭管状态，因此出现扩增产物污染的可能性小、②简便快速；③可同时测定大量样本。缺点是：①对每种突变，需制备得到相应的荧光标记特异探针；②需要特殊的实时荧光测定设备。
5．酶免疫显色测定方法与酶免疫化学发光测定方法的主要异同点是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:酶免疫化学发光测定方法与酶免疫显色测定方法的原理、测定模式和测定步骤基本相同，不同的是，在最后一步显色反应时，加入的不是酶的显色底物，而是酶的发光或荧光底物，如标记酶为HRP，则可使用鲁米诺(luminol)作为其发光底物。如标记酶为碱性磷酸酶(AP)，则可使用四甲基伞形酮磷酸盐、AMPPD(dioxetanes磷酸酯)等荧光和发光底物，然后再用相应的发光检测仪或荧光检测仪进行检测。本法测定的灵敏度通常高于显色方法。
6．分子生物学测定方法的方法学评价。答案：显示答案&&&&正确答案:主要用于测定细胞因子的基因水平和转录水平。可用于细胞内发生的细胞因子的基因突变、缺失、重排及染色体易位等的检测；可得到特定的病理情况下何种细胞中特异DNA序列发生了何种改变；揭示细胞中细胞因子基因的特定改变及其表达究竟发生在细胞增殖周期的哪个阶段及其与细胞形态学之间的关系；可用于探讨细胞因子基因的改变与特定疾病发生发展之间的关系。
7．简述肿瘤坏死因子(TNF)生物学检测法的原理。答案：显示答案&&&&正确答案:TNF的主要生物学活性之一就是对某些肿瘤细胞的细胞毒作用，利用敏感特异的靶细胞和TNF一起孵育，一般细胞死亡率与TNF活性成正比，根据细胞死亡率即可得出TNF的相对活性。
8．与T细胞识别、粘附及活化有关的CD分子主要有哪些?简述其结构特点、配体识别与功能的关系。答案：显示答案&&&&正确答案:与T细胞识别、粘附及活化有关的CD分子及其结构特点，配体识别及与功能的关系如下：(1)CD3：CD3分子由γ、δ、ε、ζ、η五种链组成，与T细胞受体组成TCR-CD3复合物，其胞浆区有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构，其中的酪氨酸磷酸化后，可活化有关激酶，转导TCR-CD3介导的活化途径的信号。(2)CD4：CD4为单链跨膜糖蛋白，胞膜外有四个IgSF结构域，CD4是T细胞TCR-CD3识别抗原的辅助受体，与配体MHCⅡ类分子结合，参与信号转导。(3)CD8：CD8分子是由α、β链借二硫键连接的异源二聚体，是T细胞的辅助受体，与MHCⅠ类分子结合，参与T细胞活化和增殖的信号转导。(4)CD2：又称为LFA-2，其配体主要是CD58(LFA-3)，与配体结合后能促进T细胞对抗原的识别功能和介导T细胞的信号转导。(5)CD58：又称LFA-3，与配体LFA-2结合后，可参与T细胞信号的转导。(6)CD28：CD28分子是由二硫键相连的同源二聚体，其配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，CD28作为辅助刺激分子，提供T细胞活化的辅助信号。(7)CTLA-4：又称CD152，为同源二聚体，与配体CD80/CD86结合后，对已活化的CD8T细胞的扩增起抑制作用。(8)CD40L：又称CD154，属TNF超家族成员，以三聚体形式结合CD40分子，与B细胞表面的配体CD40结合产生的信号，是B细胞进行免疫应答和淋巴结生发中心形成的重要条件。<input name='Answer_10111_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='与T细胞识别、粘附及活化有关的CD分子及其结构特点，配体识别及与功能的关系如下：(1)CD3：CD3分子由γ、δ、ε、ζ、η五种链组成，与T细胞受体组成TCR-CD3复合物，其胞浆区有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构，其中的酪氨酸磷酸化后，可活化有关激酶，转导TCR-CD3介导的活化途径的信号。(2)CD4：CD4为单链跨膜糖蛋白，胞膜外有四个IgSF结构域，CD4是T细胞TCR-CD3识别抗原的辅助受体，与配体MHCⅡ类分子结合，参与信号转导。(3)CD8：CD8分子是由α、β链借二硫键连接的异源二聚体，是T细胞的辅助受体，与MHCⅠ类分子结合，参与T细胞活化和增殖的信号转导。(4)CD2：又称为LFA-2，其配体主要是CD58(LFA-3)，与配体结合后能促进T细胞对抗原的识别功能和介导T细胞的信号转导。(5)CD58：又称LFA-3，与配体LFA-2结合后，可参与T细胞信号的转导。(6)CD28：CD28分子是由二硫键相连的同源二聚体，其配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，CD28作为辅助刺激分子，提供T细胞活化的辅助信号。(7)CTLA-4：又称CD152，为同源二聚体，与配体CD80/CD86结合后，对已活化的CD8T细胞的扩增起抑制作用。(8)CD40L：又称CD154，属TNF超家族成员，以三聚体形式结合CD40分子，与B细胞表面的配体CD40结合产生的信号，是B细胞进行免疫应答和淋巴结生发中心形成的重要条件。'/>
9．利用细胞增殖法检测细胞因子的依赖株有何特性?举例说明。答案：显示答案&&&&正确答案:只对某种特定的细胞因子起反应，并依赖于这种特定的细胞因子的细胞系称为依赖细胞株。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定的细胞因子后才能增殖。例如白细胞介素-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加人IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过检测细胞增殖情况，即可鉴定IL-2的含量。<input name='Answer_10112_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='只对某种特定的细胞因子起反应，并依赖于这种特定的细胞因子的细胞系称为依赖细胞株。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定的细胞因子后才能增殖。例如白细胞介素-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加人IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过检测细胞增殖情况，即可鉴定IL-2的含量。'/>
10．T辅助细胞(Th细胞)有哪些免疫功能?答案：显示答案&&&&正确答案:Th细胞是机体免疫应答的启动细胞，没有Th细胞的活化，机体会处于免疫无能状态；活化的Th1细胞释放IFN、IL-2和其他免疫效应因子，可以促进T细胞应答、抑制抗体产生、诱导迟发型超敏反应；活化的Th2细胞释放IL-4和IL-5等细胞因子，可使B细胞活化，促进抗体产生。所以Th细胞是免疫应答的中心细胞。
11．试举出细胞因子及其相关制剂对其有治疗或预防价值的六类疾病。答案：显示答案&&&&正确答案:感染性疾病；肿瘤；移植物的排斥；血细胞减少症；超敏反应；自身免疫性疾病。
12．利用淋巴细胞增殖法检测IL-1的原理是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:利用细胞增殖法检测IL-1有直接增殖法和间接增殖法两种：(1)直接增殖法。IL-1具有淋巴细胞活化因子的活性，在促有丝分裂原存在的情况下，能够促使胸腺淋巴细胞和某些体外健康株的T淋巴细胞克隆生长，因此测定这些细胞的增殖情况即可反映IL-1的活性。(2)间接增殖法。IL-1可以刺激T细胞产生IL-2或其他T细胞生长因子，某些品系小鼠的T细胞系只有在IL-1存在的条件下才能产生IL-2，并且IL-2的产量与IL-1的浓度成直线关系。因此可利用IL-2依赖细胞株测定IL-2，从而间接测定IL-1的含量。<input name='Answer_10115_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='利用细胞增殖法检测IL-1有直接增殖法和间接增殖法两种：(1)直接增殖法。IL-1具有淋巴细胞活化因子的活性，在促有丝分裂原存在的情况下，能够促使胸腺淋巴细胞和某些体外健康株的T淋巴细胞克隆生长，因此测定这些细胞的增殖情况即可反映IL-1的活性。(2)间接增殖法。IL-1可以刺激T细胞产生IL-2或其他T细胞生长因子，某些品系小鼠的T细胞系只有在IL-1存在的条件下才能产生IL-2，并且IL-2的产量与IL-1的浓度成直线关系。因此可利用IL-2依赖细胞株测定IL-2，从而间接测定IL-1的含量。'/>
13．简述T细胞增殖试验的形态学变化及实验原理。答案：显示答案&&&&正确答案:T细胞增殖试验又称T细胞转化试验，T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，在24～48h细胞内蛋白质和核酸合成增加，从而产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、染色质疏松、淋巴细胞转变成母细胞。&&实验原理是将外周血液或分离的单个细胞与适量的植物血凝素(PHA)混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：转化的淋巴细胞/(转化的淋巴细胞十未转化的淋巴细胞)×100%。<input name='Answer_10116_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='T细胞增殖试验又称T细胞转化试验，T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，在24～48h细胞内蛋白质和核酸合成增加，从而产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、染色质疏松、淋巴细胞转变成母细胞。&&实验原理是将外周血液或分离的单个细胞与适量的植物血凝素(PHA)混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：转化的淋巴细胞/(转化的淋巴细胞十未转化的淋巴细胞)×100%。'/>
14．常用于鉴定和检测T细胞的表面分化抗原有哪些?B细胞表面抗原和受体有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:(1)常用于鉴定和检测T细胞的表面分化抗原有CD2、CD3、CD4、CD8和CD25。(2)B细胞的表面抗原有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等。(3)B细胞表面有膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体等，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。<input name='Answer_10117_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='(1)常用于鉴定和检测T细胞的表面分化抗原有CD2、CD3、CD4、CD8和CD25。(2)B细胞的表面抗原有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等。(3)B细胞表面有膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体等，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。'/>
15．从PBMC中分离淋巴细胞的方法有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:从PBMC中分离淋巴细胞的方法有：(1)贴壁粘附法；(2)吸附柱过滤法；(3)磁铁吸引法；(4)Percoll分离液法。<input name='Answer_10118_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='从PBMC中分离淋巴细胞的方法有：(1)贴壁粘附法；(2)吸附柱过滤法；(3)磁铁吸引法；(4)Percoll分离液法。'/>
16．何谓淋巴细胞活力?如何进行检测?答案：显示答案&&&&正确答案:淋巴细胞活力是指活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比。活力的测定通常使用的方法是台盼蓝染色法。该染料是一种阴离子型染料，不能透过活细胞细胞膜，故活细胞不染色，死亡细胞呈蓝色，观察计数200个细胞，计算不着色细胞的百分率及代表细胞的活力。
17．NK细胞有哪些重要功能?常用的检测方法有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:NK细胞主要功能是非特异性直接杀伤肿瘤细胞的功能，常用来检测NK细胞功能的方法有：①酚释法；②放射性检查法；③荧光分析法。
18．粘附分子可分为哪几类?主要有哪些功能?答案：显示答案&&&&正确答案:(1)粘附分子可分为6类：①免疫球蛋白超家(immunoglobulin&superfamily，IgSF)；②整合素(integrin)家族；③选择素(selectin)家族；④钙粘附素(cadherin)家族；⑤其他粘附分子⑥粘蛋白样家族。(2)粘附分子的主要功能为：①作为免疫细胞识别中的辅助受体和协同活化信号；②介导炎症过程中的细胞与血管内皮细胞粘附；③参与淋巴细胞归巢。<input name='Answer_10121_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='(1)粘附分子可分为6类：①免疫球蛋白超家(immunoglobulin&superfamily，IgSF)；②整合素(integrin)家族；③选择素(selectin)家族；④钙粘附素(cadherin)家族；⑤其他粘附分子⑥粘蛋白样家族。(2)粘附分子的主要功能为：①作为免疫细胞识别中的辅助受体和协同活化信号；②介导炎症过程中的细胞与血管内皮细胞粘附；③参与淋巴细胞归巢。'/>
19．抗原提呈细胞主要通过哪些方式捕获抗原?答案：显示答案&&&&正确答案:抗原提呈细胞可通过吞噬作用、胞饮作用以及受体介导的内摄作用捕获抗原。
20．溶血空斑试验和Ig定量测定在B细胞功能测定时有什么区别?答案：显示答案&&&&正确答案:主要区别是：溶血空斑实验是一种体外检测单个B细胞分泌Ig的功能状态，Ig定量测定能分析体液免疫状态，了解的是B细胞的整体功能。
21．简述利用磁性微球分离淋巴细胞的原理。答案：显示答案&&&&正确答案:磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行处理，核心外包裹高分子材料(聚苯乙烯、聚氯乙烯等)，可结合不同的生物大分子物质(抗原、抗体、核酸等)，若微球表面包被有免疫配基则称为免疫磁珠(immunomagnetic&bead，IMB)，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成细胞-抗体-磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞将产生明显的差别。可以采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞则将先被洗脱出来，再将该柱移出磁场，与磁珠结合的细胞也将被洗脱出来，达到分离的目的。
22．试述混合淋巴细胞培养(MLC)的试验方法。答案：显示答案&&&&正确答案:MLC的试验方法：①将分离的反应细胞(通常是患者的淋巴细胞)与刺激细胞(通常是供者或已知的标准细胞)配成1×10/ml浓度的悬液；②各加0.2ml到反应管；③37℃、5%CO，培养5～6d；④涂片染色，观察并计数转化的淋巴细胞。<input name='Answer_10125_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='MLC的试验方法：①将分离的反应细胞(通常是患者的淋巴细胞)与刺激细胞(通常是供者或已知的标准细胞)配成1×10/ml浓度的悬液；②各加0.2ml到反应管；③37℃、5%CO，培养5～6d；④涂片染色，观察并计数转化的淋巴细胞。'/>
23．检测B细胞抗体分泌功能的方法有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:B细胞抗体分泌其功能检测方法有：(1)检测血清中各抗体水平；(2)反向溶血空斑试验；(3)酶联免疫斑点试验。<input name='Answer_10126_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='B细胞抗体分泌其功能检测方法有：(1)检测血清中各抗体水平；(2)反向溶血空斑试验；(3)酶联免疫斑点试验。'/>
24．何谓分离细胞的阳性选择法和阴性选择法?答案：显示答案&&&&正确答案:凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法叫阳性选择法；而选择性去除不要细胞，仅留下所需细胞的方法叫阴性选择法。
25．对淋巴细胞的计数和功能检测意义有何不同，在反映免疫功能上各有什么优缺点?答案：显示答案&&&&正确答案:淋巴细胞计数主要是T、B细胞及其亚群计数，通过计数可了解T、B细胞的数量与比值是否正常。淋巴细胞数量正常并不等于其功能正常，T、B淋巴细胞对抗原、丝裂原的刺激能否发生增殖反应是判定功能是否正常的一个检测标准。如淋巴细胞受丝裂原等物质刺激后能发生增殖反应即发生母细胞化，则说明其功能正常。NK细胞的功能是否正常，以能否杀伤靶细胞来判定。由此可知，计数是对物质基础的定量，功能检测是对物质功能的定量，要把各种免疫细胞及亚群的数量与比值，各种免疫细胞功能的测定结果等进行综合分析后，才能判定机体的免疫功能是否正常。
26．细胞免疫的生理功能有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:细胞免疫应答的效应方式主要有细胞毒作用和迟发型超敏反应，可表现出如下的生理功能：抗感染效应、抗肿瘤效应、同种排斥效应。
27．简述细胞因子的免疫学检测法的原理?答案：显示答案&&&&正确答案:细胞因子均为蛋白质或多肽，具有较强的抗原性，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。
28．与B细胞识别、粘附及活化有关的CD分子主要有哪些?简述其结构特点、配体识别与功能的关系。答案：显示答案&&&&正确答案:与B细胞识别、粘附及活化有关的CD分子及其结构特点、配体识别及与功能的关系如下:(1)CD79a/CD79b：CD79a和CD79b通过二硫键组成异二聚体，与mIg以非共价键相连，组成BCR复合物，其胞浆区的ITAM可结合B细胞内信号分子中SH2结构域，从而介导BCR途径的信号转导。(2)CD19：CD19分子胞膜外区结构属IgSF成员，是CD19/CD21/CD81信号复合物中的一个成分，其胞浆区较长，可与多种激酶结合，促进B细胞激活。(3)CD21：又称CR2或EB病毒受体。CD21分子胞膜外区属于补体调控蛋白结构域，胞浆区具有多个PKC和蛋白酪氨酸激酶磷酸化位点，CD21与配体iC3b和C3d相结合，能增强B细胞对抗原的应答，此外，CD21也参与免疫记忆过程。(4)CD80/CD86：CD80和CD86通过其胞膜外区V样结构域可与其配体CD28和CD152(CTLA-4)结合，为T细胞TCR-CD3活化途经提供重要的协同刺激信号。(5)CD40：CD40分子胞膜外区富含半胱氨酸重复序列，B细胞上CD40与T细胞上的CD40L结合能提供B细胞所需的协同刺激信号，是诱导B细胞再次免疫应答和生发中心形成的必需条件。<input name='Answer_10131_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='与B细胞识别、粘附及活化有关的CD分子及其结构特点、配体识别及与功能的关系如下:(1)CD79a/CD79b：CD79a和CD79b通过二硫键组成异二聚体，与mIg以非共价键相连，组成BCR复合物，其胞浆区的ITAM可结合B细胞内信号分子中SH2结构域，从而介导BCR途径的信号转导。(2)CD19：CD19分子胞膜外区结构属IgSF成员，是CD19/CD21/CD81信号复合物中的一个成分，其胞浆区较长，可与多种激酶结合，促进B细胞激活。(3)CD21：又称CR2或EB病毒受体。CD21分子胞膜外区属于补体调控蛋白结构域，胞浆区具有多个PKC和蛋白酪氨酸激酶磷酸化位点，CD21与配体iC3b和C3d相结合，能增强B细胞对抗原的应答，此外，CD21也参与免疫记忆过程。(4)CD80/CD86：CD80和CD86通过其胞膜外区V样结构域可与其配体CD28和CD152(CTLA-4)结合，为T细胞TCR-CD3活化途经提供重要的协同刺激信号。(5)CD40：CD40分子胞膜外区富含半胱氨酸重复序列，B细胞上CD40与T细胞上的CD40L结合能提供B细胞所需的协同刺激信号，是诱导B细胞再次免疫应答和生发中心形成的必需条件。'/>
29．简述测定巨噬细胞胞内和胞外酶的意义。答案：显示答案&&&&正确答案:单核-吞噬细胞含有多种胞内和胞外酶，胞内酶能杀灭、消化、销毁已被吞噬进入细胞内的异物；胞外酶则可在细胞外进行物质代谢，供给营养和能量。测定这些酶的活性是衡量巨噬细胞功能的实用指标，对于判定巨噬细胞的功能具有重要意义。
30．简述NBT试验的原理及临床意义。答案：显示答案&&&&正确答案:硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验：本法用以检测中性粒细胞的胞内杀菌能力，由于中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加，磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氧化脱氢，此时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成点状或块状甲簪颗粒并沉积在胞浆内。临床意义：(1)NBT还原试验可检测中性粒细胞的胞内杀菌能力；(2)为疾病的鉴别指标，如：全身性细菌感染时NBT阳性率明显升高，而病毒感染时，NBT阳性率反而下降。正常人外周血中性粒细胞NBT阳性率约为10%；全身性细菌性感染NBT试验阳性率明显升高；病毒感染时，NBT试验阳性率一般在10%以下；器官移植术后细菌感染伴发热，NBT试验阳性率升高；器官移植术后排斥反应伴发热，NBT试验阳性率正常。<input name='Answer_10133_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验：本法用以检测中性粒细胞的胞内杀菌能力，由于中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加，磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氧化脱氢，此时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成点状或块状甲簪颗粒并沉积在胞浆内。临床意义：(1)NBT还原试验可检测中性粒细胞的胞内杀菌能力；(2)为疾病的鉴别指标，如：全身性细菌感染时NBT阳性率明显升高，而病毒感染时，NBT阳性率反而下降。正常人外周血中性粒细胞NBT阳性率约为10%；全身性细菌性感染NBT试验阳性率明显升高；病毒感染时，NBT试验阳性率一般在10%以下；器官移植术后细菌感染伴发热，NBT试验阳性率升高；器官移植术后排斥反应伴发热，NBT试验阳性率正常。'/>
31．简述荧光激活细胞分离仪的工作原理。答案：显示答案&&&&正确答案:荧光激活细胞分离仪(fluoresecence&activated&cell&sorter，FACS)主要由4部分组成：①细胞流动系统和气压流速控制系统；②激光系统；③检测和信号处理系统；④细胞分选系统。其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排列成行，流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每个小滴最多含有一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。
32．NK细胞的功能有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:NK细胞即自然杀伤细胞，其功能主要包括：(1)自然杀伤靶细胞：NK细胞的主要作用是杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，与Tc细胞不同，这种杀伤不需要TCR识别靶细胞上的抗原，也不需要识别靶细胞上的MHC分子，因此可以在靶细胞暴露的早期行使杀伤功能，不需要事先的抗原致敏，所以称为自然杀伤。(2)细胞因子活化的杀伤作用：NK细胞的杀伤活性可通过某些细胞因子(例如IL-2)的诱导而显著增强，这样的细胞称为淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)。用LAK细胞治疗肿瘤是颇有潜力的一种生物疗法。(3)抗体依赖的杀伤作用：NK细胞表面有IgG的Fc受体(CD16)，因此可通过抗体的媒介活化NK细胞，杀伤抗体包被的靶细胞，这种特殊的活性称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。<input name='Answer_10135_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='NK细胞即自然杀伤细胞，其功能主要包括：(1)自然杀伤靶细胞：NK细胞的主要作用是杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，与Tc细胞不同，这种杀伤不需要TCR识别靶细胞上的抗原，也不需要识别靶细胞上的MHC分子，因此可以在靶细胞暴露的早期行使杀伤功能，不需要事先的抗原致敏，所以称为自然杀伤。(2)细胞因子活化的杀伤作用：NK细胞的杀伤活性可通过某些细胞因子(例如IL-2)的诱导而显著增强，这样的细胞称为淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)。用LAK细胞治疗肿瘤是颇有潜力的一种生物疗法。(3)抗体依赖的杀伤作用：NK细胞表面有IgG的Fc受体(CD16)，因此可通过抗体的媒介活化NK细胞，杀伤抗体包被的靶细胞，这种特殊的活性称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。'/>
33．细胞因子测定的临床应用原则是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:细胞因子的一个最大特点就是功能的多样性和组织细胞的非特异性，这也就决定了其测定的临床应用必须要考虑细胞因子的来源以及测定方法的应用。其原则如下：①应使用多种方法测定；②测定标本的选择适当；③同时测定多种细胞因子。
34．简述酶组化法的基本原理?答案：显示答案&&&&正确答案:酶标记抗特异性粘附分子的抗体与处理好的组织切片标本反应后，如组织细胞存在相应的粘附分子，则酶标记抗体即可与其结合，再加入颗粒性底物显色。
35．试述细胞因子的生物学检测法原理，常用的方法有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:细胞因子的生物学检测法是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，由于各种细胞因子具有不同的生物活性，因此可选择某一细胞因子独特的生物活性，对其进行检测。生物学检测法又称为生物活性检测法，可分为以下几类：细胞增殖法、靶细胞杀伤法、细胞因子诱导的产物分析法、细胞病变抑制法等。该法比较敏感，并能直接测定生物学功能，属于一种最可靠的方法，是科研部门最常用的技术，需要长期培养依赖性细胞株，步骤繁杂，影响因素多，是这一方法的缺点。
36．试述T细胞的主要表面分子及其特征。答案：显示答案&&&&正确答案:T细胞的主要表面分子有：①T细胞抗原受体(TCR)，可表达所有成熟T细胞表面是T细胞识别蛋白质抗原的特异性受体；②CD3分子，表达于全部T细胞表面，可与TCR分子以非共价结合形成一个TCR-CD3复合受体分子，具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用；③CD4和CD8分子，是细胞与细胞之间相互作用的粘附分子；④CD28分子，为最重要的协同刺激受体分子；⑤CD2分子，是细胞间粘附分子，也是信号传导分子，可使T细胞活化，它不依赖于TCR途径，是T细胞活化的第二途径；⑥极迟活化分子(VLA)，可与细胞外基质配体分子相结合，为T细胞活化提供协同刺激信号；⑦细胞因子受体；⑧CD44和CD45分子，CD44分子为一种归巢受体，CD45对各种活化途径有重要调节作用。
37．以cDNA探针为例，核酸探针技术包括那些程序?答案：显示答案&&&&正确答案:质粒DNA的提取；靶DNA的分离；靶DNA的标记；待测样品Mrna的提取；标记Cdna探针对待检样品的杂交：放射自显影或显色分析。
38．简述T细胞介导的细胞毒试验原理及其常用方法。答案：显示答案&&&&正确答案:T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性，凡致敏T细胞再次与相应靶细胞抗原相遇，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。该试验的原则是选用适当的靶细胞，常用可传代的人肿瘤细胞如人肝癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温育一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤的情况。常用的方法有：①形态学检查法：淋巴细胞与肿瘤细胞混合温育后，以瑞氏染色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率；②同位素法：一般采用I-UdR掺入法或Cr释放法，以细胞毒指数或Cr释放法表示T细胞的细胞毒活性。<input name='Answer_10141_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性，凡致敏T细胞再次与相应靶细胞抗原相遇，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。该试验的原则是选用适当的靶细胞，常用可传代的人肿瘤细胞如人肝癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温育一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤的情况。常用的方法有：①形态学检查法：淋巴细胞与肿瘤细胞混合温育后，以瑞氏染色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率；②同位素法：一般采用I-UdR掺入法或Cr释放法，以细胞毒指数或Cr释放法表示T细胞的细胞毒活性。'/>
39．简述细胞因子测定的意义和复杂性。答案：显示答案&&&&正确答案:细胞因子的测定在免疫学、细胞和分子生物学的基础研究，揭示某些疾病的发生发展机制，以及某些疾病的诊断及治疗指导上具有重要的应用价值。其测定方法可根据针对的细胞因子表达分泌的阶段的表型测定及分泌后的功能测定而分为分子生物学测定方法、免疫测定方法和生物学测定方法三大类。三种方法之间相互关联，互为补充，但不能完全替代。细胞因子的种类较多，在体内表现为一个高度复杂的细胞因子网络，相互作用以使机体免疫系统得到控制和维持。故而一种细胞因子常具有功能多样性，不同细胞因子的功能相互之间可能会有重叠。因此，对于特定的细胞因子的测定，单纯依靠功能测定特异性较差，常需要采用上述多种方法综合分析。
40．细胞因子有何生物活性?其共同特性有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:(1)细胞因子是一大类蛋白质或小分子多肽，其生物活性表现在多个方面：调节免疫应答、介导炎症反应、促进造血功能、抗病毒作用、参与全身的神经-内分泌-免疫网络调控等。(2)细胞因子的共同特性概括如下：①多源性：一种细胞因子可由多种细胞产生，诱导细胞因子产生的因素也多种多样；②细胞因子的生物学效应具有多效性、重叠性、拮抗效应和协同效应。③高效性：细胞因子具有微量强效的特点，与内分泌激素的效果相似；④速效性：对激发因素的反应很迅速；⑤短效性：细胞因子基因的转录时间不长，而且细胞因子的半衰期很短，所以作用时间短暂；⑥细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用；⑦网络性：各种细胞因子的生物学活性相互关联，一种细胞因子可以诱导其他细胞因子的产生，也可以抑制其他细胞因子的分泌，形成一个网络，共同调节机体的免疫功能及生理平衡；⑧低分子量：绝大多数细胞因子是低分子量(10～60kD)的多肽或糖蛋白；⑨细胞因子通常以非特异方式发挥作用，即细胞因子对靶细胞作用无抗原特异性，也不受MHC限制。<input name='Answer_10143_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='(1)细胞因子是一大类蛋白质或小分子多肽，其生物活性表现在多个方面：调节免疫应答、介导炎症反应、促进造血功能、抗病毒作用、参与全身的神经-内分泌-免疫网络调控等。(2)细胞因子的共同特性概括如下：①多源性：一种细胞因子可由多种细胞产生，诱导细胞因子产生的因素也多种多样；②细胞因子的生物学效应具有多效性、重叠性、拮抗效应和协同效应。③高效性：细胞因子具有微量强效的特点，与内分泌激素的效果相似；④速效性：对激发因素的反应很迅速；⑤短效性：细胞因子基因的转录时间不长，而且细胞因子的半衰期很短，所以作用时间短暂；⑥细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用；⑦网络性：各种细胞因子的生物学活性相互关联，一种细胞因子可以诱导其他细胞因子的产生，也可以抑制其他细胞因子的分泌，形成一个网络，共同调节机体的免疫功能及生理平衡；⑧低分子量：绝大多数细胞因子是低分子量(10～60kD)的多肽或糖蛋白；⑨细胞因子通常以非特异方式发挥作用，即细胞因子对靶细胞作用无抗原特异性，也不受MHC限制。'/>
41．简述细胞因子测定的临床应用。答案：显示答案&&&&正确答案:①特定疾病的辅助诊断；②评估机体的免疫状态，判断治疗效果及预后；③临床疾病的治疗应用；④临床疾病的预防应用。
42．简述检测B细胞增殖能力的两种常用试验。答案：显示答案&&&&正确答案:检测B细胞增殖能力的两种常用试验有：(1)不同刺激物诱发增殖试验。抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养1～3d后加3H-TdR，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝计细胞增殖或用DNA特异性染色观察细胞内DNA或RNA的分化程度。(2)葡萄球菌诱导试验。葡萄球菌CowenI株(SAC)表面富含SPA，将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cpm值，葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转用化能力成正比。<input name='Answer_10145_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='检测B细胞增殖能力的两种常用试验有：(1)不同刺激物诱发增殖试验。抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养1～3d后加3H-TdR，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝计细胞增殖或用DNA特异性染色观察细胞内DNA或RNA的分化程度。(2)葡萄球菌诱导试验。葡萄球菌CowenI株(SAC)表面富含SPA，将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cpm值，葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转用化能力成正比。'/>
43．细胞因子的生物学测定优缺点有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:优点：①灵敏度高，较免疫测定方法敏感，可达pg水平；②测定的是细胞因子的生物活性。其缺点是：①特异性差；②测定操作繁琐；③易受干扰。
44．免疫测定方法用于细胞因子检测优缺点有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:(1)主要优点是：①特异性高。使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；②测定操作简便，无须维持依赖性细胞株。(2)主要缺点是：①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比；②测定结果与所用的抗体的来源及亲合力有很大关系，使用不同来源和亲合力的单抗，对同一标本测定得到的结果可能不同；③测定下限不如生物活性测定方法，一般约为100pg；④如标本中存在细胞因子的可溶性受体，其可能会影响特异抗体对细胞因子的结合；⑤标本中存在的各种细胞因子结合蛋白如自然存在的抗细胞因子抗体、血清中可结合细胞因子的载体蛋白如血清白蛋白和α2-巨球蛋白等有可能对细胞因子免疫测定产生干扰。<input name='Answer_10147_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='(1)主要优点是：①特异性高。使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；②测定操作简便，无须维持依赖性细胞株。(2)主要缺点是：①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比；②测定结果与所用的抗体的来源及亲合力有很大关系，使用不同来源和亲合力的单抗，对同一标本测定得到的结果可能不同；③测定下限不如生物活性测定方法，一般约为100pg；④如标本中存在细胞因子的可溶性受体，其可能会影响特异抗体对细胞因子的结合；⑤标本中存在的各种细胞因子结合蛋白如自然存在的抗细胞因子抗体、血清中可结合细胞因子的载体蛋白如血清白蛋白和α2-巨球蛋白等有可能对细胞因子免疫测定产生干扰。'/>
45．ELISA用于细胞因子测定优缺点有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:ELISA方法的优点是特异、简便、可同时测定大量标本、易于标准化以及实验废弃物易于处理等，是目前临床上最常用的细胞因子免疫测定方法。其缺点是，测定的是细胞因子的免疫反应性，而不是细胞因子的生物活性。因此，不具生物活性的细胞因子前体分子、分解片断、聚合物以及其与结合蛋白或可溶性受体的结合物，ELISA方法仍可以测到。
46．Ig&Fc受体可分为哪几类?主要有哪些功能?答案：显示答案&&&&正确答案:Ig&Fc受体的类型及其功能如下：(1)FcγR：①FcγRⅠ：又称为CD64，是高亲和力IgG&Fc受体。功能是介导ADCC，清除免疫复合物，促进吞噬作用，促进吞噬细胞释放IL-1、IL-6和TNF-α等介质；②FcγRⅡ：又称为CD32，是低亲和力IgGFc受体。功能是介导吞噬作用和氧化性爆发。CD32中的FcγRⅡ-B介导免疫抑制作用；③FcγRⅢ：又称为CD16，是低亲和力IgGFc受体。功能是传递活化信号，介导吞噬和ADCC作用。(2)FcαR：又称为CD89。功能是介导吞噬细胞的吞噬作用、超氧产生、释放炎症介质以及发挥ADCC作用。(3)FcεR：①FcεRⅠ：是高亲和力IgEFc受体。功能是介导Ⅰ型超敏反应；②FcεRⅡ：又称为CD23，是低亲和力IgEFc受体。功能是参与IgE合成的调节。<input name='Answer_10149_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='Ig&Fc受体的类型及其功能如下：(1)FcγR：①FcγRⅠ：又称为CD64，是高亲和力IgG&Fc受体。功能是介导ADCC，清除免疫复合物，促进吞噬作用，促进吞噬细胞释放IL-1、IL-6和TNF-α等介质；②FcγRⅡ：又称为CD32，是低亲和力IgGFc受体。功能是介导吞噬作用和氧化性爆发。CD32中的FcγRⅡ-B介导免疫抑制作用；③FcγRⅢ：又称为CD16，是低亲和力IgGFc受体。功能是传递活化信号，介导吞噬和ADCC作用。(2)FcαR：又称为CD89。功能是介导吞噬细胞的吞噬作用、超氧产生、释放炎症介质以及发挥ADCC作用。(3)FcεR：①FcεRⅠ：是高亲和力IgEFc受体。功能是介导Ⅰ型超敏反应；②FcεRⅡ：又称为CD23，是低亲和力IgEFc受体。功能是参与IgE合成的调节。'/>
47．CD分子和粘附分子及其单克隆抗体在临床医学中有何应用性?答案：显示答案&&&&正确答案:CD分子和粘附分子及其单克隆抗体在临床中的应用是：(1)阐明某些疾病的发生机制：例如CD4分子是HIV的主要受体，HIV通过CD4分子结合，选择性地感染CD4细胞，使其破坏，从而导致AIDS。GpⅡb/Ⅲa基因缺陷可导致Glanzmann血小板无力征，患者血小板活化、凝集障碍，易发生出血。异构型CD44分子的表达或VLA-2等粘附分子表达增加，与某些肿瘤的转移和恶变有关。(2)在疾病诊断中的作用：例如，应用抗CD的单克隆抗体检测外周血CD4/CD8细胞比值和CD4细胞的绝对值，对AIDS的辅助诊断和判断病情有重要作用。此外，抗CD的mAb也可用于白血病、淋巴瘤的免疫学分型及辅助诊断。(3)在疾病治疗和预防中的应用：通过输注CD分子的mAb(如抗CD3的mAb)或某些粘附分子的mAb以去体内T细胞或阻断免疫细胞间相互作用，降低体内免疫应答水平，达到防治移植排斥反应和延长移植物存活的目的。另外，抗CD分子mAb与某些毒素交联形成的免疫毒素，可用于B系白血病和淋巴瘤的治疗。<input name='Answer_10150_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='CD分子和粘附分子及其单克隆抗体在临床中的应用是：(1)阐明某些疾病的发生机制：例如CD4分子是HIV的主要受体，HIV通过CD4分子结合，选择性地感染CD4细胞，使其破坏，从而导致AIDS。GpⅡb/Ⅲa基因缺陷可导致Glanzmann血小板无力征，患者血小板活化、凝集障碍，易发生出血。异构型CD44分子的表达或VLA-2等粘附分子表达增加，与某些肿瘤的转移和恶变有关。(2)在疾病诊断中的作用：例如，应用抗CD的单克隆抗体检测外周血CD4/CD8细胞比值和CD4细胞的绝对值，对AIDS的辅助诊断和判断病情有重要作用。此外，抗CD的mAb也可用于白血病、淋巴瘤的免疫学分型及辅助诊断。(3)在疾病治疗和预防中的应用：通过输注CD分子的mAb(如抗CD3的mAb)或某些粘附分子的mAb以去体内T细胞或阻断免疫细胞间相互作用，降低体内免疫应答水平，达到防治移植排斥反应和延长移植物存活的目的。另外，抗CD分子mAb与某些毒素交联形成的免疫毒素，可用于B系白血病和淋巴瘤的治疗。'/>
48．试述细胞表面粘附分子的测定有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:酶免疫组化法；荧光免疫法；流式细胞仪测定法；时间分辨荧光免疫测定法；酶免疫法。
49．简述巨噬细胞吞噬功能检测的临床意义。答案：显示答案&&&&正确答案:(1)巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于某些免疫缺陷病和各种肿瘤，恶性肿瘤病人(如食管癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌等)的吞噬百分率常在45%以下，吞噬指数也下降。(2)可作为机体抗肿瘤能力的指标。(3)可作为肿瘤疗效判断的参考指标，当手术切除肿瘤，或放疗、化疗后病情好转，吞噬率及吞噬指数可回升。<input name='Answer_10152_JDTEST__问答题' type='hidden' id='Answer' value='(1)巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于某些免疫缺陷病和各种肿瘤，恶性肿瘤病人(如食管癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌等)的吞噬百分率常在45%以下，吞噬指数也下降。(2)可作为机体抗肿瘤能力的指标。(3)可作为肿瘤疗效判断的参考指标，当手术切除肿瘤，或放疗、化疗后病情好转，吞噬率及吞噬指数可回升。'/>
50．常用于分离免疫细胞群的原则是什么?答案：显示答案&&&&正确答案:常用于分离免疫细胞群的原则：①根据细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬细胞的能力；②按照细胞的表面标志，包括表面的抗原和受体加以选择性分离。
51．B细胞的主要表面分子有哪些?答案：显示答案&&&&正确答案:B细胞膜主要表面分子有：①B细胞抗原识别受体(BCR)，能识别可溶性蛋白质抗原分子，它识别的表位是构象决定簇；②Fc受体，可结合免疫球蛋白Fc段是检测B细胞的一种方法；③补体受体(CR)；④细胞因子受体(CKR)；⑤丝裂原受体；⑥主要组织相容性抗原(MHC)；⑦B细胞分化抗原(CD分子)。
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