国药鉴别:常用贝母类药材鉴别方法概况 常用药材鉴别
Time： 15:35:34
作者：楼招欢
【关键词】& 药材
&&& 关键词：贝母；鉴别方法&&& 贝母系百合科（Liliaceae）植物的干燥鳞茎，为临床化痰止咳的常用中药材。贝母类药材来源复杂，品种繁多，地区用品各不相同，这使得贝母商品混杂；另外，由于贝母资源短缺，商品价格较高，一些不法分子用其他类似的药材混充贝母销售，市场上出现了众多的混淆品。正确鉴别区分贝母的正伪，是保证临床用药安全、有效的关键。实际生产、使用中所用的鉴别方法主要可分为传统鉴别方法和现代鉴别方法两大类。前者包括基源和性状鉴别；后者包括显微鉴别、理化鉴别、色谱法、光谱法等鉴别方法。现将它们分述如下。&&& 1基源和性状鉴别&&& 贝母类药材按作用不同可分为川贝母类、浙贝母类以及湖北贝母等其他种类。它们科属接近，外形相似，但因基源不同，性状也各有特点，可据此对它们进行区分。实际工作中药材的性状鉴别主要从药材的形状、大小、表征、颜色、质地、断面、气、味等十个方面来考虑［1～8］。为便于实际工作借鉴，现将已有报道的常见贝母类药材及常见伪品的基源和性状列举如表1。&&& 2显微鉴别&&& 贝母类药材的性状较相似不易区分，但其显微特征有较大的区别，如粉末的颜色；淀粉粒的形状、大小；脐点的形状、位置；层纹的有无、形状以及种间在鳞叶上（内）表皮细胞的形状、大小和垂周壁角质栓的有无、形状、大小、排列等方面有一定的区别；这些均可作为鉴别特征，列举如表2［9～13］。表2贝母类药材的显微鉴别名称〖〗粉末颜色〖〗淀粉粒形状〖〗脐点〖〗层纹〖〗鳞叶上（内）表皮细胞特征松贝青贝〖〗白色〖〗广卵形、长圆形或不规则圆形〖〗点、短状、人字、马蹄状，多位于较小端〖〗层纹细密〖〗表皮细胞类长方形，周壁微波状弯曲。螺纹导管，直径2～26 μm炉贝〖〗〖〗广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形〖〗人字状、星状或点状〖〗层纹明显〖〗螺纹及网纹导管，直径可达64 μm浙贝母〖〗类白色〖〗淀粉单粒广卵形、椭圆形,直径6～56 μm〖〗多呈点状或裂缝状，也有飞鸟状、马蹄状的，均位于较小端〖〗可见偏心形的层纹〖〗表皮细胞类多角形或长方形，垂周壁呈连珠状增厚；角质层向内凸出形成颗粒状角质栓。细小螺纹导管东贝〖〗〖〗卵形、卵圆形、蚌状卵、长椭圆形〖〗〖〗〖〗表皮细胞长方形或多角形，周壁微波状弯曲，呈含珠状增厚湖北贝母〖〗淡棕黄色〖〗广卵形或长椭圆形〖〗脐点明显，点状、人字或裂缝状〖〗层纹明显细密〖〗表皮细胞垂周壁呈连珠状增厚。草酸钙结晶棱方形、颗粒状簇状平贝母〖〗类白色〖〗单粒，三角形、贝壳形、三角状卵形〖〗脐点裂缝状、点或人字状，位较小端；多脐点单粒见伊贝母〖〗〖〗单粒，广卵形、卵形、贝壳形，三角状卵形〖〗点状、人字形或短缝状〖〗层纹明显〖〗表皮细胞类长方形，含细小草酸钙方晶，螺纹及环纹导管米贝母〖〗〖〗灯泡状、卵形、不规则广卵形、贝状卵形、类三角形〖〗脐点明显；点状、短缝状，人字状、马蹄状、三叉状，多位于较小端〖〗层纹隐约可见一轮贝母〖〗多数糊化〖〗卵状圆形、卵状长圆形、圆多角形、广卵形、贝壳形或长圆形〖〗脐点明显；点、短缝状，人字、马蹄状、星状或十字状，多位于较小端层纹极明显&&& 3理化鉴别&&& 有些贝母在一定条件下有其特有的荧光反应，可将此作为鉴别特征；现将常用贝母类药材在紫外灯365 nm下的荧光反应列举如表3［14～15］。表3贝母类药材的理化鉴别样品〖〗颜色粉末〖〗川贝〖〗亮蓝紫色〖〗平贝〖〗闪蓝或翠蓝色〖〗浙贝〖〗亮淡绿色〖〗东贝〖〗亮蓝色〖〗松贝〖〗淡蓝色乙醚提取物〖〗湖北贝母〖〗亮蓝色〖〗珠贝〖〗蓝色此外，还有用沉淀反应来鉴别浙贝母［1］以及通过用两相滴定法测定生物碱的含量的不同来区分不同基源、产地的川贝母等［19］。&&& 4色谱法贝母类药材因基源、产地的不同，其所含的成分也会随之变化。据此，我们可采用适宜的方法提取主要成分，分别制成其相对应的对照品，经薄层色谱法来观察样品和对照品是否具有相同的斑点，从而进行区别［17～19］。对川贝类还可以利用其样品的总皂苷水解物的特殊薄层斑点来与浙贝进行鉴别［20］。&&& 5吸收光谱法&&& 不同种类药材所含的不同成分在光谱中会产生不同的吸收，而含量不同其吸收强度也随之改变。现代吸收光谱法在贝母类药材的鉴别中也得到了广泛应用，如用一阶导数光谱倒吸收峰的显著差异来鉴别湖北贝母、浙贝、川贝等［20］；根据紫外光谱中(203.0±2) nm处是否有最大吸收来可以判断东贝母的真伪［21］；湖北贝母、浙贝、川贝等紫外吸收光谱有明显的差别［22］，可以据此对这些贝母进行区分；对于川贝、珠贝、小东贝之间的区别，则可通过傅里叶变换红外光谱法的吸收光谱的外貌特征及吸光度值进行判断［23］。以上两种方法操作相对简便，实际较常用。此外，根据贝母的水或酸浸液在醋酸氨-醋酸底液条件下，在dE/dt-E曲线上出现切口和图形的不同（位移、扩缩）［24］以及在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳池中蛋白质区带图谱的不同［25］可对不同贝母样品进行区分。填充X-射线粉末衍射法［26］、柱裂解气相色谱［27，28］及对微量元素灰关联度的测定［29］等方法也应用于浙贝、川贝等不同种以及同种野生与栽培品之间的区别。&&& 6讨论&&& 贝母类药材的基源和性状鉴别经多年的积累已较完善；显微鉴别也较为成熟，在实际工作可直接应用；理化鉴别中荧光鉴别的工作做的较多，只是有的种间的荧光较相似，有时难以区别；化学特征性反应如沉淀反应、显色反应等报道的很少，这方面可做进一步的研究；根据贝母类药材所含的生物碱不同，光谱法、色谱法等现代技术已在贝母的鉴别中得到广泛的应用，这些方法能精确的进行定性、定量，不足之处是有的方法如高效液相色谱法，它对样品的前处理要求严格，操作不太方便。此外，近来出现的毛细管电泳法未见报道，可做尝试。&&& 参考文献：&&& ［1］李家实.中药鉴定学，第1版［M］.上海：上海科学技术出版社，.&&& ［2］赵宇萍，平忠明.松贝及其伪品鉴别［J］.时珍国医国药，):230230.&&& ［3］谭焕萍，马宝生，王玉生.贝母的商品规格及伪品鉴定［J］.时珍国医国药，):400400.& &&& ［4］唐生斌，唐小鹏.贝母类药材的性状鉴别［J］.中药材，):321324.& &&& ［5］唐小鹏，唐生斌，魏艳阳.川贝母混淆品的基源和性状鉴定［J］.中国药业.):6466.
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关注中医园微信号中药有效成分分析的新方法新技术研究--《复旦大学》2012年博士论文
中药有效成分分析的新方法新技术研究
【摘要】：本论文以寻找中药有效成分为出发点,以色谱、质谱技术为基础,尝试探索中药研究的新方法和新技术。建立了以提取手段、色谱质谱联用技术、基于细胞模型的活性成分筛选技术互相搭配的分离分析手段用于中药有效成分的提取、分离、筛选和鉴定；同时,针对中药复方方剂的配伍比例进行了优化探索,并采取先分解再组合的实验思路建立基于中药复方叠加效应的有效成分筛选方法,并搭建了两维色谱体系用于分离复方中药中的复杂成分,从而实现了在综合考量中药多组分、多靶点、多效应特点上的较为全面的活性物质分离鉴定；此外,以基质辅助激光解吸飞行质谱(MALDI-TOF-MS)为出发点,通过采用新基质成功实现了高通量的中药化合物筛选及长链脂肪酸富集；在此基础上,将MALDI-TOF-MS筛查扩展到了固定酶抑制剂的高通量筛查,从而扩宽了高通量MALDI-TOF-MS技术的筛查范围。相关研究工作及成果的摘要如下：
第一章文献综述部分充分描述了中药的丰富内涵,突出了中药有效成分在中药质量筛查中的重要性,以及探索中药药效机理对于药物筛选与研发的必要性；介绍了色谱技术作为一种现代高效分离工具在中药研究方面的发展与应用；阐述了针对中药有效成分研究的各种提取技术,围绕中药多组分、多靶点、多效应等特点展开的数学实验思考,以及对于中药有效成分筛查的体外生物模型研究方法；同时,详细描述了在化合物分离鉴定方面发挥重要作用的多维色谱、质谱技术,概述了当前应用于中药分离的多维色谱模式以及在中药研究中逐渐展露身手的质谱鉴定技术。从中药的提取预处理、到数学思维综合考量、到多维色谱高效分离、到生物模型科学筛分、到质谱技术高通量鉴定等多种化学生物技术相互结合的方式,对于中药有效成分的分析具有十分重要的意义。通过描述该研究的基本思路和进展状况,阐明了本课题选题及研究的学术意义和技术背景。
第二章将提取、分离、筛选、鉴定技术互相搭配,从而实现对中药有效成分的分离分析。以中药半枝莲为分析样本,探索不同提取方法对于其中有效成分-野黄芩苷的提取效率。通过纳升级的色谱＼质谱联用模式来定性鉴定和定量测量经过红外提取后的半枝莲中的成分野黄芩苷。同时,红外提取的各个过程各个实验参数都进行了优化,从而验证了该提取方法的可靠性及高效性。同时,通过与其他几种提取方法,例如常规的加热回流方法、超声提取方法、微波提取方法等进行比较可知,红外提取能够获得更高的提取效率。同时,中药半枝莲在纳升级色谱质谱联用模式下得到了有效分离。通过参照野黄芩苷标准品的色谱保留时间及质谱结构信息,即可以快速准确的确定半枝莲中野黄芩苷的相关信息,从而实现高效定性鉴定。此外,通过建立野黄芩苷标准曲线从而获得相应的定量信息,进而得到较为满意的方法有效性、线性以及检测限。结果显示,该方法在0.6至20ng mL-1范围内线性良好,相关系数(R2)为0.9973,检测限(LOD)为0.5ng mL-1(S/N=3)。
第三章将中药复方作为分析对象,以探索复方配伍合理性,考量复方药效叠加作用以及分析复方中药复杂组分为出发点,通过提取优化、生物检测细胞模型、两维色谱分离及高效准确质谱鉴定等技术,尝试从更为全面的角度来分析纷繁复杂的中药有效成分。首先,从探究复方方剂的配伍比例合理性出发,针对特定的中药复方方剂(该方剂由三种单味药),在结合细胞生物筛查效果的基础上,进行方剂配伍比例值的优化探索；其次,鉴于中药各个组分之间的药效叠加效应,从整体着眼,根据先分解再组合的思想重新进行细胞增殖生物筛查,进而从更为全面的角度对有效成分进行筛查；然后,以紫杉提取液为实验对象,继续按照先分解再整合的实验思路对其中的有效成分进行筛查,根据实验结果,紫杉醇被确定为其中的有效成分,从而验证了这一筛选方法的有效性；最后,将亲水色谱柱和反相色谱柱相结合,搭建两维色谱分离系统,经过验证,该系统具有更好的正交性和更高的峰容量,继而将此两维色谱分离体系与细胞模型、质谱鉴定相结合,从而实现高通量的药物筛选,对于药物研发及药物筛查具有重要意义。
第四章以基质辅助激光解吸飞行质谱(MALDI-TOF-MS)为出发点,将石墨烯和氧化石墨烯用作MALDI基质,来鉴定传统中药化合物。由于石墨烯和氧化石墨烯的表面积较大,从而避免了MALDI离子源与真空系统的污染。同时,由于石墨烯优异的电学、热学以及机械性能使得MALDI-TOF-MS可以在浓度为100nM时达到稳定的分析,且免除背景噪音干扰。实验采用当归和半枝莲做为检测样本,将当归中的阿魏酸(m/z194)、半枝莲中的野黄芩苷(m/z462)及汉黄芩素(m/z284)作为检测的目标化合物。实验表明,这两种MALDI基质对于中药中组分的不同浓度不具有歧视效果。此外,石墨烯和氧化石墨烯还可以作为样品的吸附剂展示其富集功效,从而使被测物的检测限获得较大幅度的降低。实验表明,这种MALDI-TOF-MS方法具有简单灵敏、快速经济、以及高通量等突出特点,可以为中药快速质量筛查提供新的技术手段。
此外,还将石墨烯和氧化石墨烯用于富集长链脂肪酸。将5种长链脂肪酸,即十二烷酸(C12)、十四烷酸(C14),十六烷酸(C16),十八烷酸(C18)和二十烷酸(C20),用作为代表性样本。由于石墨烯或氧化石墨烯较大的表面积和强烈相互作用,这5种长链脂肪酸被石墨烯和氧化石墨烯有效富集,实现了高通量的检测。同时,本方法还可以成功用于低浓度下检测实际生物样品中的5种长链脂肪酸样本,从而证明了这种MALDI-TOF-MS方法可以实现简单灵敏、快速经济并且高通量的检测长链脂肪酸。
第五章则在上述MALDI-TOF-MS检测技术的基础上,将这种高通量筛查技术用于酶抑制剂的筛选中,该筛选由固定酶磁性碳球和以氧化石墨烯为基质的MALDI-TOF-MS结合完成。首先,将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定于3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GLYMO)修饰的磁性碳球上,该固定酶磁性碳球具有高效的酶活性和稳定性,并可以将酶从底物和产物中有效分离出来。固定化乙酰胆碱酯酶AChE的效率则通过固定酶磁性碳球和样品底物之间的反应加以验证,而后续的定量分析底物乙酰胆碱和产物胆碱则通过基于氧化石墨烯为基质的MALDI-TOF-MS方法完成,该MALDI-TOF-MS方法没有背景干扰。乙酰胆碱的检测限LOD是0.25fmol/μL,在0.5至250fmol/μL范围内有良好的线性值(R2=0.9998)。而胆碱则在0.05至15pmol/μL内有很好的线性(R2=0.9994)和低检测限LOD(0.15fmol/μL)。在标准曲线的浓度范围内有良好的准确度和精确度。共有8种化合物(4种已知乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂和4种没有乙酰胆碱酯酶AChE抑制效果的对照化合物)用此方法进行验证,所得结果证明该高通量筛分方法可以大大推动日常酶抑制剂筛选的进程。
总体而言,本论文围绕中药有效成分研究为核心,以色谱、质谱技术为基础,着重发展新方法和新技术。首先,建立了包含提取、分离、筛选、鉴定的操作技术方法；其次,围绕中药复方这一复杂体系,着重优化复方配伍比例值,探索基于复方药效叠加作用基础上的有效成分筛选方法,建立两维色谱分离模式以实现更为全面的中药复方分离分析；同时,将MALDI质谱技术成功用于中药分子检测及长链脂肪酸富集,从而为高通量的中药质量筛查提供新的技术基础；最后,固定酶抑制剂的高通量MALDI检测的实现,大大拓宽了该MALDI质谱检测新技术的应用领域,具有极大潜力。本论文以色谱质谱等现代仪器手段为基础,结合生物模型,着重发展中药有效成分分离分析的新方法新技术。以高效灵敏、准确可靠的分离、筛选、鉴定中药中的有效成分为目标,发展了包含提取手段、分离鉴定、基于细胞模型的活性成分筛选、高通量中药化合物鉴定等新技术和新方法,为中药有效成分的分离分析提供了较为全面的研究方法。这些新方法和新技术的发展对于中药有效成分的分离分析十分重要,有利于中药的质量筛查及物质基础探索。这些针对中药有效成分分析的新方法和新技术的建立,有利于不断的在中药研究领域挖掘出更多的创新型解决方案。
【关键词】：
【学位授予单位】：复旦大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R284【目录】：
摘要8-12Abstract12-17第一章 文献综述17-41 1.1 中药有效成分研究概述17-21
1.1.1 引言17-19
1.1.2 色谱技术在中药有效成分分离方面的应用19-21
1.1.3 其他技术在中药研究方面的应用21 1.2 中药有效成分提取与活性组分高通量筛分21-26
1.2.1 中药提取技术的进展21-23
1.2.2 数学运算在中药研究中的应用23-25
1.2.3 中药活性物质高通量体外筛选生物模型25-26 1.3 多维色谱技术应用研究26-29
1.3.1 多维色谱技术筛查意义26-28
1.3.2 多维色谱平台在分离复杂中药组分中的研究应用28-29 1.4 质谱技术研究进展29-31
1.4.1 高通量质谱技术探讨29-30
1.4.2 质谱技术在小分子物质鉴定中的应用30-31 1.5 本论文研究思路31 参考文献31-41第二章 色谱质谱在红外提取半枝莲中有效物质筛选的应用41-59 2.1 前言41-42 2.2 实验42-45
2.2.1 化学品和试剂42
2.2.2 标准品溶液42
2.2.3 优化红外提取参数42-43
2.2.4 红外提取与传统提取方式的效率比较43-44
2.2.5 纳升色谱质谱分离分析44
2.2.6 借助纳升色谱质谱技术分析半枝莲中野黄芩苷的红外提取效率44-45
2.2.7 细胞培养45
2.2.8 细胞增殖检测45 2.3 结果与讨论45-54
2.3.1 优化红外提取条件45-48
2.3.2 红外提取和其他提取技术比较48-52
2.3.3 红外提取法提取半枝莲中野黄芩苷52-53
2.3.4 半枝莲中活性组分的高通量歸选53-54 2.4 本章小结54 参考文献54-59第三章 复方中药的有效成分分离分析59-97 3.1 探索复方中药配比的合理性59-65
3.1.1 引言59-60
3.1.2 实验部分60-63
3.1.3 结果与讨论63-65 3.2 基于复方药效叠加作用的有效成分筛查65-70
3.2.1 引言65
3.2.2 实验部分65-67
3.2.3 结果与讨论67-70 3.3 紫杉提取液中有效成分筛查70-76
3.3.1 引言70-71
3.3.2 实验部分71-72
3.3.3 结果与讨论72-76 3.4 基于两维色谱、生物检测技术与质谱鉴定技术的筛选模式76-88
3.4.1 引言76
3.4.2 实验部分76-79
3.4.3 结论与讨论79-88 3.5 本章小结88 参考文献88-97第四章 基于石墨烯/氧化石墨烯为MALDI基质的高通量中药鉴定97-133 4.1 MALDI高通量中药鉴定97-111
4.1.1 引言97-98
4.1.2 实验98-100
4.1.3 结果与讨论100-111 4.2 石墨烯和氧化石墨烯：富集长链脂肪酸的2种理想选择111-126
4.2.1 引言111-112
4.2.2 实验部分112-114
4.2.3 结果与讨论114-126 4.3 本章小结126 参考文献126-133第五章 以氧化石墨烯为MALDI-TOF-MS基质的酶抑制剂筛选133-157 5.1 引言133-134 5.2 实验部分134-137
5.2.1 化学品及反应试剂134-135
5.2.2 制备GLYMO功能化磁性碳球135
5.2.3 将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定于GLYMO功能化磁性碳球135
5.2.4 样品处理135-136
5.2.5 基质制备以及MALDI点靶136
5.2.6 MALDI-TOF-MS分析136-137
5.2.7 方法验证与标准曲线绘制137
5.2.8 乙酰胆碱酯酶(AChE)分析137 5.3 结果与讨论137-150
5.3.1 氧化石墨烯作为MALDI-TOF-MS基质表现探索137-139
5.3.2 定量方法可靠性以及标准曲线139-143
5.3.3 GLYMO功能化磁性碳球的制备与表征143-144
5.3.4 将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定于GIYMO修饰的磁性碳球上144-146
5.3.5 乙酰胆碱酯酶(AChE)固定的磁性碳球表现146-150 5.4 本章小结150 参考文献150-157附录157-159致谢159-160
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