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官方公共微信血型血清学部分名词解释；红细胞抗原抗体反应主要类型；1．凝集反应；2．沉淀反应；3．溶血反应；抗人球蛋白试验--IgG不完全抗体的Coombs；人红细胞表面抗原与不完全抗体结合（常是IgG类抗；抗人球蛋白试验--需要补体和抗补体的Coombs；一些抗体与相应抗原反应需要在补体存在时，才能出现；Coombs试验分类为直接Coombs试验和间接；直接Coombs
血型血清学部分名词解释
红细胞抗原抗体反应主要类型
1．凝集反应
2．沉淀反应
3．溶血反应
抗人球蛋白试验--IgG不完全抗体的Coombs试验
人红细胞表面抗原与不完全抗体结合（常是IgG类抗体），即不完全抗体致敏红细胞由于该不完全抗体分子量小或和其两个Fab段扩张角度小，不能使相邻红细胞桥联，红细胞仍是分散状况，不出现肉眼可见的红细胞凝集现象。在反应体系中，加入针对该抗体的抗体，即抗抗体，该抗抗体Fab段结合红细胞上不完全抗体Fc段，出现肉眼可见的红细胞凝集现象，该试验称之抗人球蛋白试验。也称Coombs试验，该抗抗体称之抗人球蛋白抗体或Coombs抗体。
抗人球蛋白试验--需要补体和抗补体的Coombs试验
一些抗体与相应抗原反应需要在补体存在时，才能出现肉眼可见凝集反应，如Duffy抗体，与一些补体直接反应，而另一些需要只有在补体存在时才出现血凝反应
Coombs试验分类为直接Coombs试验和间接Coombs试验。
直接Coombs试验：红细胞在体内被致敏，即红细胞在体内已结合了抗体。直接加入抗抗体（Coombs抗体），红细胞发生凝集。
间接Coombs试验：红细胞在体外被致敏，即红细胞膜在体外试验时结合不完全抗体，然后加入抗抗体（Coombs抗体），红细胞发生凝集。
Coombs试验的应用
直接抗人球蛋白试验：
1. 对新生儿溶血病（HDN）胎儿（婴儿）红细胞检测
2. 输血反应
3. 其它溶血性疾病
间接抗人球蛋白试验：
1. 检测体内不规则抗体
a. 妊娠妇女
c. 受血者或有过输血史的人
d. 交叉配血试验
2. 对已发现抗体鉴定
3. 对一些血型抗原的检测，如Ｄ弱型，Kell. Duffy. Kidd 和其它血型检测。
抗体和免疫球蛋白（Antibodies and Immunoglobulins）
抗体是与特异性抗原结合的免疫球蛋白。所有的抗体是免疫球蛋白，但是不具有与抗原特异性结合功能的免疫球蛋白不是抗体，即不是所有的免疫球蛋白都是抗体。
抗体的Fab段是与抗原特异性结合的部位；抗体本身又可作为抗原被其特异性抗体所结合，该结合部位称抗原决定簇，为免疫球蛋白分子的遗传标志。根据不同的遗传标志，可将免疫球蛋白分子的抗原决定簇分为同种型、同种异型和独特型三类不同的血清学类型。抗体的Fc段可以决定抗体同种型的类和亚类，以及同种异型的Gm抗原性。不只是Fc段，抗体分子其它部位都可能作为抗原决定簇（遗传标志），如抗体的可变区的同种型标志ＶH ,Vκ,Vλ群和抗体的个体基因型，即独特型抗原决定簇。
抗体类、亚类
抗体类别，亚类属于免疫球蛋白折同种异型标志。
类：根据免疫球蛋白重链恒定区（CH）抗原决定簇不同，可由特异性抗体将其分为γ，α，μ，σ,ε相应免疫球蛋白分别是IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。
亚类：根据各类免疫球蛋白重链恒定区的抗原特异性的差异以及二硫键位量和数目的不同，某类免疫球蛋白再分为亚类。如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA可分为IgA１和IgGA2；IgM可分IgM1和IgM2亚类。
完全抗体和不完全抗体
在适当的介质（液体、凝胶等）中，能够与相应特异性抗原出现肉眼可见的免疫反应（凝集反应、沉淀反应或溶血反应）的抗体，称之完全抗体；在适当介质中，不能出现肉眼可见的免疫反应的抗体被称之不完全抗体。IgM类抗体一般是完全抗体，IgG 类抗体一般是不完全抗体，但IgG类抗体并不都是不完全抗体，一些IgG抗体与其特异性红细胞抗原结合，也出现肉眼可见的凝血反应或溶血反应。
完全抗体和不完全抗体分类一般指抗体的免疫反应性质，即以能否出现肉眼可见免疫反应而区分。
规则和不规则抗体
人体内产生的抗体一般都是外来的自身体内不存在的抗原所免疫，产生的抗体，称这规则抗体。如体内抗体的特异性是针对自身体内已有的抗原，该类抗体称之不规则抗体。对ABO血型，Ａ型人只有抗Ｂ，Ｂ型人只有抗Ａ，Ｏ型人有抗Ａ，Ｂ，ＡＢ型人没有抗Ａ和抗Ｂ，这些抗体为规则抗体；如果Ａ型人有抗Ａ，Ｂ型人有抗Ｂ，ＡＢ型人出现抗Ａ或／和抗Ｂ，血型血清学确定的ABO血型，如抗原弱表达的Ａx型人，这些抗体为不规则抗体。可能出现的抗Ａ。Ｄ表型阳性人体内出现的抗Ｄ抗体，抗体如果经研究确定了该抗体是针对该人红细胞表面所缺乏的Ｄ抗原表位（该Ｄ阳性红细胞是Ｄ抗原表位部分缺失型）则该抗Ｄ是规则抗体。应强调，只有在免疫遗传学，在抗原分子水平已经确定了是Ｄ抗原表位部分缺失型人所产生的抗Ｄ之时，将该抗体，明确为规则抗体，但是在临床上发出Ｄ抗原表型，阳性人出现抗Ｄ在对其详细深入研究之前，首先将其作为不规则抗体。
规则抗体和不规则抗体分类的根据是免疫遗传学基本理论，即抗体产生的一般规则。
意外抗体和非意外抗体（Unexpected antibodies and expected antibodies）
在临床血型血清学工作中发现的ABO血型不规则抗体，Ｄ血型阳性人出现的抗Ｄ（不论是否已经确定其是Ｄ抗原表位不完全型），以及具有获得型Ｂ型红细胞的人检测出的抗Ａ等，都称之意外抗体。意外抗体包括了在临床血型血清学检测中遇到的所有异常?意外&抗体。反之，正常的，规则的抗体均为非意外抗体。
意外抗体和非意外抗体，分类主要指临床血型血清学检测中遇到的异常、&意外&的抗体或者是正常的规律性抗体。Ｄ阴性人血清中检出抗Ｄ抗体，不将其称为意外抗体，因对Ｄ阴性人，应预料到并高度注意其血清中可能有抗Ｄ抗体。
免疫抗体和自然发生的抗体（Immune antibodies naturally occuring antibodies）
同种异体抗原刺激所产生的血型抗体称免疫抗体（Immune antibodies）。在妊娠输血时，如Ｄ抗原阴性抗原孕妇被胎儿Ｄ阳性红细胞免疫产生的抗Ｄ，Ｄ阴性人输入Ｄ阳性血产生抗Ｄ或ABO血型不相容性输血产生的ABO抗体都是免疫抗体。免疫抗体中大部分是IgG类抗体，也有少部分是IgM类抗体等，即免疫抗体不等于就是IgG抗体。自然发生的抗体，是未有明确血型抗原刺激，即无输血、妊娠和输用血液制品即往史的人所产生的抗体，如Ａ型人血清中抗Ｂ，Ｂ型人抗Ａ，Ｏ型人抗Ａ,Ｂ。但已清楚，血型自然抗体产生是人在与自然界多糖抗原物质接触中，以及人肠道中细菌抗原刺激所产生的抗体，因此更正确地称之为自然产生的抗体(Naturally occuring antibodies）而不称之天然抗体。免疫抗体和自然发生的抗体之区分主要根据其产生原因是否有明确的抗原刺激。
临床有意义抗体和无意义抗体
ABO血型、Rh血型不相容输血或胎母血型不相容妊娠等情况产生的ABO、Rh血型抗体，能够引起输血反应或新生儿溶血病，这类抗体都是临床有意义抗体，凡是在临床上能发生同种异体免疫反应，如溶血，血细胞减少等病症的血型抗体，都是临床有意义抗体。而对于有些血型系统，如Ｐ血型，即使是该血型不相容性输血或妊娠，可能产生Ｐ血型同种异体抗体，但并不发生溶血性输血反应和新生儿溶血病，此类抗体，称之临床无意义抗体。临床无意义抗体，指的是一般规律，在一般情况不产生同种异体血型免疫反应，但是个别情况，对少数病例可能产生病症，甚至严重的输血反应或新生儿溶血病，如ＭＮ血型，抗体一般情况是无意义抗体，但对某些人则是临床有意义抗体。故临床上不能将这些抗体绝对地称之临床有意义抗体或无意义抗体。
因为血型抗原抗体、数目众多。一方面不是所有血型抗体都有临床意义，另一方面不可能，也无必要检测所有血型。如果在血型血清学常规检测中应用更为敏感的方法，其结果是很难找到完全相容的血液进行输血，这可能是血型检测始终应用血凝方法，而未能应用更为敏感的同位素检测、酶联免疫检测方法的原因。微柱凝胶免疫检测技术本质是血凝试验，其提高的敏感性对临床检测工作是恰到好处。今天在世界上先进国家，MGIA技术已经是成为临床血型血清学检测常规工作，在我国已经有条件，也应该成为临床检测常规。
包含各类专业文献、专业论文、文学作品欣赏、应用写作文书、生活休闲娱乐、58血型血清学部分名词解释等内容。　
　临床检验基础名词解释大全_医学_高等教育_教育专区。名词解释1.血常规 CBC:全血细胞...65.正向定型:用已知的特异性标准血清检查红细胞的未知血型抗原称为~ 66.反向... 　血型血清学是整个远程教育项目的一部分,远程教育是为...2. 3. 4. 解释抗原和抗体。 解释初次免疫反应与...这种抗血清按术语可称之为 高效价抗 AB 或高效价... 　卫生统计学名词解释_医学_高等教育_教育专区。1.总体...如人类的 AB0血型,以人为观察单位,结果分为 A 型...如测定某人 群某血清学反应,以人为观察单位,结果可... 　实验诊断学复习题第一章 名词解释: 1 实验诊断:是指医生的医嘱通过临床实验室...标准血清及标准红细胞鉴定 ABO 血型结果 答:用标准血清及标准红细胞鉴定ABO血型... 　一、名词解释: 名词解释: 1、参数 6、医学参考值...A 脉搏 B 血型 C 肺活量 D 红细胞计数 E 血压 ...血清学滴度资料最常用___ 表示其平均水平。 B 中位... 　检验名词解释1_医学_高等教育_教育专区。检验名词解释...血型 26.晨尿 27.随机尿 28.镜下血尿 29.乳糜...抗血清不凝集者称 V 型菌;Vi 抗原部分丧失,既可... 　022血型血清学培训测试题_医学_高等教育_教育专区。全国采供血机构,人员岗位培训...阳性对照始终是抗球蛋白试验的一部分 E、以上都是 40、患者用血选择应该是: ... 　输血前的血型血清学试验,通常包括( d ) A ABO、Rh 定型, B 抗体筛选和鉴定...(10 分) 三、名词解释 1.组织相容性抗原: :诱发移植排斥反应的抗原被称为... 　鉴定人 ABO 血型,常采用: A.直接凝集试验; B.间接凝集试验; C.单向免疫扩散...抗血清的免疫沉淀反应,临床上鉴定 M 蛋白最常用的方 法是: 二、名词解释 1....血型血清学部分名词解释_百度文库
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血型血清学部分名词解释
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&&血型血清学
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版权所有& CopyRight , , All Rights Reserved病毒学复习总结及名词解释汇总
病毒学复习总结（格式有点乱）：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 第一章& 病毒概述
病毒学(virology) ：研究病毒(virus)的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。
研究病毒学的意义：有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业。
病毒学发展简史：一、发现时期& &1935二、化学时期（病毒结晶）（）三、细胞水平时期（1940S- 1960S)电镜、噬菌体研究、细胞培养四、分子病毒学研究时期（1953&&）病毒核酸、蛋白质、逆转录酶、基因功能
病毒研究的发展趋势：一、重要病毒性疾病的预防和控制二、功能基因组学和功能蛋白组学的研究三、Prion 的分子生物学四、DNA疫苗、RNAi疫苗的研究五、病毒分子病理学研究以病毒与宿主的相互作用为研究对象；研究病毒与一定发育分化水平的靶细胞的关系；分子水平研究与细胞水平、机体水平研究相结合。&
细胞生物三原界：真核生物原界；真细菌原界；古生菌原界
一． 病毒的特点和定义1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。 一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成&&核蛋白分子2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。 朊病毒甚至仅由蛋白质构成3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。 例如: 利福平可抑制痘病毒复制
病毒的定义：病毒是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。 一类超显微的非细胞生物，每种病毒只有一种核酸；它们只能在活细胞内营专性寄生，靠其宿主代谢系统协助来复制核酸，合成蛋白质等组分，然后再进行装配而得以繁殖。在离体条件下，它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。&&
二． 病毒的起源：病毒或其遗传物质从它的前身大分子中独立出来并进行自主复制和进化的时候
三个学说：1.退化性起源学说；2.起源于细胞DNA或RNA某种成分；3.起源于具有自我复制能力的最原始分子
1、退化性起源学说&寄生物的退化形式 细胞内寄生物在进化过程中丢掉了复杂的代谢系统，仅留下最重要的代表生命本质的核酸分子。中间过程：麻风杆菌(leprosy bacillus)、Rickettsia、Chlamydia等，线粒体、叶绿体等的起源
两个阶段：产生独立复制的DNA质粒&编码寄生物亚细胞结构的基因突变，形成衣壳蛋白
2、起源于细胞DNA或RNA某种成分 在细胞发生和分化过程中，某一核酸片段脱落发展成为一种独力传递信息而又借助于细胞器的遗传实体&&细胞的最简单寄生物& (与质粒、转座因子、mRNA等相关)（1）胞质遗传体的游离DNA留下的细胞器的精华；（2）在基因编码的亚细胞结构中，经过随机突变，形成病毒外壳蛋白v& DNA病毒&&起源于质粒或转移因子v& RNA病毒&&起源于自主复制的mRNAv& 逆转录病毒&&起源于反转座子retron
3、起源于具有自我复制能力的最原始分子
小RNA分子可进行复制和进化的三个基本反应：
核糖核酸酶活性
自我拼接去掉内部的核酸序列（核酶）
作为引物合成核酸
过程：(1)、RNA的形成与复制&(2)、进行RNA&蛋白介导的一系列反应&(3)、产生DNA（DNA稳定&遗传物质）
三． 病毒的进化（感染&&病毒生存的基本方式）
病毒进化的复杂性在于：
小，常规进化生物学研究方法难以移植到病毒进化上；
演化史中基本没有&化石&或&遗体&；
进化随机性，病毒的每一步演变都在一定的概率下发生
病毒与机体互作的进化关系：
病毒及其识别细胞受体能力的进化（病毒）
病毒与宿主免疫系统互作的进化（宿主个体）
病毒在群体感染过程中的进化& （宿主群体）
病毒存在的基本方式
&&病毒是以quasispecies（带有物种性质的群体） 形式存在于宿主体内。病毒以居群(population)的形式存在，而不是以均一的形式存在。
病毒变异的基本方式
变异是病毒进化的基础，以整数倍的核苷酸、密码子或核酸节段变异.
病毒和宿主的核酸相互组合，快速扩大病毒核酸的多样性.
病毒进化的基本特征
1.&&&&&& 新病毒不断产生，而且基本上是从另一种宿主的病毒演化而来。
2.&&&&&& 新病毒产生后，在新的宿主以较快的速度变异分化。
3.&&&&&& 新病毒稳定后的毒力大多处于中等水平。
4.&&&&&& 病毒变异既有随机性，又受一定选择压力而呈现一定的方向性和稳定性。
5.&&&&&& 病毒各个基因以及基因的各个部分在进化上具有不同的进化特征。
病毒进化的根本目的增加病毒的多样性。病毒是沟通分子进化理论与传统进化理论的桥梁
新病毒不断产生的原因:：
1.&&&&&& 生态条件改变
2.&&&&&& 病毒变异（基因漂移，遗传重组、基因突变）
3.&&&&&& 宿主改变
四． 病毒的宿主范围病毒几乎可以感染所有细胞生物，并具有宿主特异性。
病毒性病害因果关系
Koch&s postulates：Isolation（分离）&Pure culture（纯培养物）&Inoculation（接种）&Re-isolation（重新分离）
Rivers 法则（病毒）1、特定病毒与疾病有联系，分离出病毒2、培养3、证明培养物的滤过性4、在原始寄主或细胞中产生类似病害5、重新分离出同一种病毒人类病毒血清学证据：特异抗体有规律地出现
第二章&& 病毒的结构及化学组成
病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。
一、毒粒的形态结构
壳体或衣壳（capsid）：包围着病毒核酸的蛋白质外壳，由蛋白质亚基(capsomer)按对称的形式、有规律地排列而成，是病毒毒粒的基本结构。螺旋对称壳体；二十面体对称壳体；双对称结构若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称（icosahedral symmetry）结构。具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体(tailed phage),其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。
核壳(nucleocapsid)：病毒的蛋白质壳体和病毒核酸(核心)构成的复合物，又称核衣壳。
裸露毒粒(naked virion)：仅由核衣壳构成的病毒颗粒。如: TMV、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等一些简单的病毒毒粒。
包膜(envelope)：有些病毒核衣壳包裹着的一层脂蛋白膜，它是病毒以出芽(budding)方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。
病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。
刺突(spike)：包膜或核衣壳上的突起。流感病毒的包膜上有两个主要突起物，即血凝素(haemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)，由包膜内突出至包膜外。在包膜内表面还存在有基质蛋白
冠状病毒有两种包膜糖蛋白突起均横穿病毒包膜：膜蛋白(M)和S蛋白。
M糖蛋白只有N端糖基化的一小部分暴露在包膜外，大部分(85％)位于包膜中。M糖蛋白在包膜内侧能与病毒核衣壳相互联系；
S糖蛋白与流感病毒的HA有相似之处;
某些冠状病毒还有第三种突起:血凝素&脂酶（HE）
冠状病毒的S糖蛋白可以结合宿主细胞膜上的糖蛋白受体，诱导感染细胞融合，HE糖蛋白则有血凝和酯酶活性。
包膜上的脂质分子如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、神经鞘磷脂(SM)主要位于脂质双层膜的外层。磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)则主要位于脂质双层膜的内层&&&&&&&&&&&&&&Vaccinia virus 痘苗病毒在病毒中体积最大，光学显微镜下勉强可见。
病毒的群体形态
包涵体inclusion包括病毒的聚集体；病毒的合成部位；病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质；非病毒性包涵体
噬菌斑plaque
空斑plaque和病斑：单层动物细胞培养；单层动物细胞受肿瘤病毒感染
枯斑lesion
二、毒粒的化学组成
毒粒包含：核酸；蛋白质；脂类；碳水化合物。病毒颗粒在化学上表现为核蛋白
1、 病毒的核酸t 核酸是病毒的遗传物质；t &一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA
多分基因组：不同颗粒
分段基因组：同一颗粒
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 单链DNA（ss DNA）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 双链DNA（ds DNA）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
病毒核酸&&&&&&&&&&& 单链RNA（ss RNA）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& & 双链RNA（ds RNA）
鉴定DNA：代谢抑制法（不适于逆转录病毒）加入F Cl Br等卤代胸腺嘧啶的类似物，若不能复制，为DNA
单链病毒核酸可按照它的极性（polarity）或意义（sense）进行分类
有某些病毒的RNA是双意(ambisense)& 即部分为+,部分为-&
2、病毒的蛋白质
非结构蛋白：病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。
结构蛋白：构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白；包膜蛋白存在于毒粒中的酶
病毒结构蛋白的主要生理功能：1）构成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破坏；2）决定病毒感染的特异性: 与易感细胞表面存在的受体具特异性亲和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；3）决定病毒的抗原性：能刺激机体产生相应的抗体；4）构成毒粒酶: 或参与病毒对宿主细胞的入侵（如T4噬菌体的溶菌酶等），或参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如逆转录酶等）；5）& 吸附作用：可作为virus attachment protein(无包膜的病毒)6）& 血凝作用：凝结血红蛋白
本章要点l& 病毒的结构组成及其功能l& 病毒粒子的对称方式
第三章& 病毒的增殖
病毒的特点：严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。
病毒的增殖方式&&复制replication
复制过程：病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。
复制周期（replicative circle）或称复制循环：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。
用于病毒复制研究的实验系统噬菌体&&细菌培养系统。优点：易培养、易控制；噬菌斑、易观察；生长快，周期短动物病毒&&动物细胞培养系统植物病毒&&动植物原生质体培养系统
一步生长曲线（one step growth curve）1939年，Max Delbruck & Emory Ellis：该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学的建立1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清3、将上述混合物大量稀释4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线
噬菌体复制（繁殖）的三个阶段：1、吸附期：游离的噬菌体吸附到宿主细胞2、潜伏期：从噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的最短时期3、裂解期：随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值&&取培养物直接测定病毒数量____将培养物过滤去细胞后测定病毒数量__.__.__将细胞裂解后测定病毒的数量，前期可将培养物先离心去上清以消除未吸附病毒的影响
裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。
隐蔽期（eclipse period）：在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生的。
一步生长曲线（one step growth curve）：以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒&细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。
病毒侵染寄主细胞的过程
1、吸附 adsorption/attachment可逆吸附：无特异性（非细胞颗粒也可吸附），随机碰撞而接触（静电引力或氢键）不可逆吸附：特异性，启动病毒感染的第一阶段，病毒表面蛋白与细胞受体的结合VAP (virus-attachment protein)与细胞受体receptor间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。
病毒吸附蛋白VAP：一般由病毒的衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起充当。如：T偶数噬菌体&&噬菌体尾部的尾丝蛋白φx174噬菌体&&二十面体衣壳五邻体顶上的纤维突起H蛋白无包膜动物病毒如腺病毒&&二十面体衣壳上的五邻体纤维、多瘤病毒&&VPl（衣壳蛋白有VPl、VP2和VP3）有包膜动物病毒&&病毒包膜上的糖蛋白突起，如副粘病毒&&HN糖蛋白、流感病毒&&血凝素(HA)糖蛋白、HIV&&gp120 糖蛋白、弹状病毒&&G 糖蛋白、疱疹病毒&&gpB糖蛋白流感病毒的吸附只与HA有关，而与NA无关
流感病毒包膜上血凝素(HA)分4个区1. 细胞受体结合区：流感病毒的VAP与宿主细胞表面糖蛋白受体的唾液酸结合，这是HA的主要功能．其受体结合位点位于三聚体的顶端，形似一个裂缝或小口袋。它是病毒包膜糖蛋白HA与细胞受体相互作用的分子基础。2. 融合区： HA蛋白具有促膜融合的活性，但HA只有经蛋白酶切割产生HA1和HA2后才具有融合活性。3. 跨膜区：& 在靠近HA分子的羧基端大约有25个AA残基组成非极性区即HA的跨膜区4. 膜内区：& HA分子羧基端最后10个AA在病毒包膜内表面。
影响病毒吸附的环境因素：l& 噬菌体数量： 每一敏感细胞所能吸附相应噬菌体的数量m.o.il& 温度: 一般来说．在0~37℃范围内温度越高、病毒吸附效率也越高
温度越高，VAP与细胞受体间的碰撞次数愈多，吸附机会越大
温度越高．细胞膜中脂质分子的运动越快，其中蛋白质分子的迁移也更加频繁，受体分子更容易与病毒粒子产生多价结合l& 离子：只有在一定的阳离子环境条件下，病毒粒子才能吸附细胞，如Na+、K+可使脊髓灰质炎病毒、腺病毒、流感病毒产生最大量的吸附，2价阳离子Ca2+、Mg2+则能促进噬菌体吸附l& pH：pH的高低能够引起病毒粒子和细胞表面基团电荷的改变（5~10）l& 其他：某些糖基分子可与细胞受体相互作用，对病毒产生竞争性结合抑制．如单糖分子可以抑制人肠道病毒的血凝作用
2、 侵入penetration/injection侵入(内化)，一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同
&注射式injection&&&& 有尾噬菌体
&细胞内吞endocytosis&& 动物病毒
&膜融合fusion&&&&& 有包膜的病毒
&直接侵入 &&&&&&&&部分动物病毒、无包膜病毒、植物病毒
直接侵入：(1)& 部分病毒粒子可直接侵入&&& 如脊髓灰质炎病毒、腺病毒。(2)& 许多无包膜病毒通过VAP与细胞受体结合后，其宿主细胞膜的流动性引起病毒衣壳蛋白重排和构型变化，细胞膜上可能有水解酶，导致病毒粒子释放核酸进入细胞质，病毒衣壳仍留在细胞膜外。实际上将病毒侵入和脱壳融为一体。(3)& 其他特殊方式：尚未发现植物病毒有特异性细胞受体，通过微伤口或自然孔口、细胞间的胞间连丝，或昆虫的口器侵入细胞。&许多病毒并非仅有一种侵入方式，可能几种侵入方式并存
有尾噬菌体，注射方式将噬菌体核酸注入细胞：吸附&尾钉固着&尾鞘收缩&尾管穿入&DNA注入通过尾部刺突固着于细胞；尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；
自外裂解（lysis from without）：如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但噬菌体并未增殖，这种现象称为自外裂解（lysis from without）。
动物病毒：
①&& 接穿过细胞膜的移位方式
②&& 毒粒包膜与细胞质膜的融合
③&& 细胞的内吞功能
植物病毒：通过人为或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movement protein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。?
3、脱壳 uncoating病毒侵入后，病毒的包膜和/ 或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的
4、病毒大分子的合成 (replication）半保留不连续复制；全保留复制模式：多数dsRNA病毒病毒基因组的复制与表达存在着强烈的时序性：早期蛋白：中期mRNA聚合酶、更改蛋白质等中期蛋白：DNA聚合酶、晚期mRNA聚合酶等晚期蛋白：头部蛋白、尾部蛋白、装配蛋白、溶菌酶等
病毒的基因组类型及复制表达途径&
逆病毒复制：&
逆病毒复制过程1：１、进入细胞；２、反转录& 在反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成DNA，然后再形成线形dsDNA;３、整 合& DNA拷贝整合到宿主基因组中；４、转 录& 病毒DNA转录形成病毒mRNA和子代病毒RNA;５、壳体化&& 在细胞质中产生核衣壳；６、出 芽&& 粒子在细胞质膜处以出芽方式放出.&
逆转录酶& reverse transcriptase主要是一种DNA聚合酶，表现出三种酶活性：①以RNA为模板合成DNA(反转录)；②以DNA为模板合成DNA;③RNA酶H活性(降解RNA:DNA杂交链中的RNA链)
反转录酶在进行DNA合成时需要的引物是特异的细胞内tRNA．
用作引物的tRNA的类型依病毒种类而不同，是从以前的宿主细胞带入病毒粒子的。如：Rous sarcoma(肉瘤) virus使用色氨酸tRNA。&
5、病毒的装配、成熟与释放
装配(assembly)：亦称形态发生(morphogenesis)新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒
成熟（maturation）：涉及病毒粒子的结构变化（蛋白构型），抗原差异
释放release：成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外病毒的释放标志病毒复制周期结束Eg：丝杆噬菌体（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装。有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的有包膜的动物病毒是在从宿主细胞核芽出或细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒Eg TMV的装配：RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。
二& &病毒的非增殖性感染
增殖性感染（productive infection）感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。
非增殖性感染（non productive infection）感染由于病毒、或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。
病毒的非增殖性感染
1、 流产感染（abortive infection）l& 依赖于细胞的流产感染：如病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞(nonpermissive cell)，将导致流产感染l& 依赖于病毒的流产感染:由基因组不完整的缺损病毒(defective virus)引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环。
2、 限制性感染（restrictive infection）因细胞的瞬时允许性产生，导致:(1)& 病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；(2)& 一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。
3、潜伏感染（latent infection）在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，受染细胞也不会被破坏。潜伏感染的另一个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变&&恶性细胞。
烈性噬菌体（virulent phage）感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lytic cycle）。
温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象说明：在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在(如P1噬菌体)。l& 整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）l& 细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称溶源性细菌（lysogenic bacteria）l& 在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。l& 溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环
溶源性感染对细胞的影响溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。
(1) 免疫性被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有&免疫性&，即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。
(2) 溶源转变溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性，例如白喉杆菌只有在含有特定类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素，引起被感染机体发病。原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表形改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变(lysogenic conversion)。
λ噬菌体的基因组
dsDNA，总长度为48502bp。
DNA分子的两端、各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。
控制λ噬菌体复制转录的基因：
①头部基因&编码头部与包装蛋白的基因(A-F)
②尾部基因&编码尾部蛋白(z-J)
③重组基因&int, xis, exo, red, gam等基因与识别位att& ，其功能是行使整合、重组和切割
④正调控基因&N和Q，N为抗转录终止基因，Q为抗终止子基因，Q蛋白为晚期正调控因子
⑤负调控基因&CI、CII、CIII和cro
⑥DNA合成基因&O、P基因
⑦裂解基因&S、R基因
λ噬菌体的基因组： （4个基因簇）调节区(regulation)重组有关的区域(recombination)复制区(replication)结构基因区(包括头、尾、装配和裂解有关的基因)
λ基因组有三个调节基因&&N、Cro和QN蛋白抗终止子t1，tR1和tR2Q蛋白抗终止子tR4cro蛋白对CI和Cro基因的转录起负调控作用
λ噬菌体的的溶源性反应
溶源化有关的有三个基因&&CI、CⅡ和CⅢCⅢ蛋白使CⅡ蛋白稳定；CⅡ/CⅢ蛋白能使CI基因启始转录；CI蛋白是λ阻遏物，能使与复制成熟和裂解等有关的基因都不转录，使λ噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体的溶源途径CI蛋白的调控作用：CI蛋白也称为λ阻遏蛋白，是一种酸性蛋白，PR操纵子最终被CI阻遏物所抑制，导致 CⅡ蛋白的合成停止，在处于原噬菌体状态时．其CI蛋白的合成一直维持低速率状态。cro蛋白作为一种阻遏蛋白、抑制溶原状态的建立当环境因素及宿主的遗传背景或目前尚不清楚的因素使CⅡ蛋白比Cro蛋白相对浓度低时，Cro蛋白阻止CI转录，不产生λ阻遏物，使λ的其他基因可以转录，当产生的Q蛋白的量达到使PR2转录完成时、进行裂解循环途径。
说明：λ噬菌体究竟是进入溶原途径，还是溶菌途径，主要受cro和CI蛋白表达水平的调控，而CI蛋白的合成又同CⅡ的活性有关。
λ噬菌体的的溶源性反应
l& 早期基因表达，产生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶对gpcII的降解。
l& gpcII的积累促使阻遏蛋白CI的表达
l& 阻遏蛋白CI的积累导致噬菌体基因转录的终止，形成原噬菌体。
l& 早期表达的gpcro与cI的竞争最终确定λ噬菌体是进入溶源状态，还是进入裂解循环。（gpcro表达得早，但与基因组的结合能力较cI弱）
阻遏蛋白cI的同样可以抑制其它新侵入的λ噬菌体的表达，从而使溶源性细菌具有&免疫性&阻遏蛋白CI在一般情况下通过自身的转录激活保持低水平的表达，但有时种种原因转录水平下降，会偶尔导致溶源性噬菌体进入裂解循环（10-5~10 - 2）。
外界因素如紫外线可引起宿主染色体的破坏，宿主产生应急反应合成具有DNA重组活性的RecA蛋白，导致CI的被降解，噬菌体进入裂解循环。诱发裂解是检查是否存在溶原性细菌的有效方法&
病毒的一步生长曲线及其作用；
病毒增殖的一般过程，不同种类病毒增殖过程特点；
病毒的基因组类型及复制表达途径；
病毒的非增殖性感染类型、特点及有关概念。&
第四章& 病毒分类和命名
了解病毒分类的现状&&&& 病毒分类与其它微生物分类的区别&&&& 病毒分类的主要依据
一、病毒分类与命名的沿革国际病毒命名委员会(ICNV，International Committee for Nomenclature of Virus)国际病毒命名委员会(ICNV)改为国际病毒分类委员会(ICTV, 1973) ；第三届国际病毒学代表大会， ICTV报告特点：
从实际工作出发，首先按宿主分五大类：
寄生于一种以上寄主
只寄生于脊椎动物
只寄生于无脊椎动物
只寄生于细菌
只寄生于植物
病毒的化学组成、形态结构、生理生化仍是重要依据；
增加了科、属、种、群名词的词源；
设立七个小组委员会。
1951年第五届国际微生物学会（SCNV）把早期分类学上的生物学特性，特别是症状学特性降到相对次要的地位
PCNV推荐病毒分类的8条标准（（1963年国际微生物学命名委员会病毒分会））：1、核酸的类型、结构和分子量；2、病毒粒子的形状和大小；3、病毒粒子的结构；4、病毒粒子对乙醚、氯仿等脂溶剂的敏感性；5、血清学性质和抗原关系；6、病毒在细胞培养上的繁殖特性；7、对除脂溶剂以外的理化因子的敏感性；8、流行病学特征。
二、关于病毒密码程式cryptogram&
三、病毒分类进展及最新分类系统
动物病毒分类等级&&科、属、种
植物病毒&&组、亚组、种
将所有已知的病毒，根据核酸的类型分为八大类群:
DNA病毒&&ssDNA病毒
DNA病毒&&dsDNA病毒
DNA与RNA逆转录病毒
RNA病毒&&dsRNA病毒
RNA病毒&&负链、ssRNA病毒
RNA病毒&&正链、ssRNA病毒
裸露RNA病毒
另增设亚病毒因子(subviral agent)95年以前植物病毒不设目95年采用科、属、种分类系统1991年ICTV第5次报告设1个目：&&&&&&&&&&&&& 单分子负链RNA病毒目&& Mononegavirales1999年第7次分类报告：认可的病毒约4000种，设3个目不是所有病毒都必须隶属某个目，在没有适当目的情况下，科可以是最高的病毒分类等级
病毒最新分类系统：1999年第7次分类报告：3个目、64科、233属
有尾噬菌体目caudovirales&&&&&&&&&&&&&&&&& 3科&&& dsDNA
单分子负链RNA目mononegavirales&& &&&&&&&4科&& -ssRNA
套病毒目nidovirales&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &2科&& +ssRNA
未确定目& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&55科
未确定目、科（独立属）&&&&&&&&&&&&&&&&&& 29属&& &亚病毒感染因子：subvirus&&& &&&&&&&& 卫星病毒 satellites类病毒& viroids&&& 2科朊病毒 prions
病毒种的概念：
&&&&&&&& 一个基本分类单元，一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其接近，与同属内其它物种有明显差异的菌株的总称。
病毒命名的一般规则：病毒命名不是采用Linnaeus创立的双名法．
地名、人名(如Rous、EB)
症状或病理特征(如花叶、登革热、脊髓灰质炎)
病毒粒子形态(如弹状、丝状、纺锤状)
宿拼字、字母、数字(如T4)v& 1、分类和命名应是国际性的．并普遍适用于所有病毒；v& 2、国际病毒分类系统采用目(order)、科(family)、亚科(sub family)、 属(genus)、种(species)分类阶元；v& 3、ICTV不负责病毒种以下的分类和命名，病毒种以下的血清型、基因型、毒力株、变异株和分离株的名称由公认的国际专家小组确定；v& 4、人工产生的病毒和实验室构建的杂种病毒在病毒分类上不予考虑，它们的分类由公认的国际专家小组负责；v& 5、分类阶元只有在病毒代表种的特性得到充分了解和在公开出版物上进行过描述，以致于明确了它们的分类地位，并使其分类阶元与其他类似的分类阶元相区别时，才能确定；v& 6、当病毒种有明确的科、而分属末确定时，这一病毒种在分类学上称为该科的未确定种(unassigned species)。
病毒的命名：词尾：&&&&&& 属名：-virus&&&&&& 科名 -viridae&& 亚科名-virinae&&&&&& 目：-virales&&&&&& 类病毒： -viroid&&&&&&&&&&&&&&&&& Tobamovirus
按规范的分类学惯例，病毒目、科、亚科、属的认可名称，均用斜体印刷，名称的第一个字母需大写
种的名称用斜体印刷，第一个词的首字母需大写，除专有名词或专有名词的一部分之外，其他词首字母一律不大写。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Tobacco mosaic virus
病毒种的鉴别：主要依据下列7个特征：v& 基因组序列的相关性；v& &天然的宿主范围；v& &细胞和组织的嗜亲性；v& &致病和细胞病变特点；v& &传播方式；v& &生理生化性质；v& &抗原特性。
第五章& 病毒的遗传与变异
本章要点：
了解病毒突变体的类型
病毒之间的遗传互作与非遗传互作
遗传和变异是生命的基本特征遗传：亲代与子代之间的形态结构与生理机能的相似性变异：亲代与子代之间、子代各个体之间的差异性
遗传能保持物种的相对稳定，维系生物界的平衡；
变异则可能导致新的生物品种出现，孕育生物界的进化。
一、病毒遗传变异的物质基础：病毒的核酸病毒的遗传是相对的，变异是绝对的
二、病毒的变异
（一） 病毒突变体株系strain：同一病毒的不同系或分离物&型&type：同一病毒的不同血清型变种：与原始野生型株系不同的病毒突变体mutant分离物isolate
病毒突变的类型：从突变引起的遗传信息的意义改变来看，可分为：
synonymous/missense/nonsense mutation从突变效应背离或返回到野生型这2种方向上讲，可分为：
正向突变forward 和回复突变reverse mutation从突变带来的表型改变来看，可分为：
形态突变体、致死突变体、条件致死突变体和生化突变体(anxotroph/resistance)等从引起突变的原因来看，可分为：
spontaneous mutation，induced mutation
病毒突变的类型：
spontaneous mutation（自发突变）
在没有任何已知诱变剂存在的条件下，一些病毒在子代中产生高比例的突变体
在基因组为RNA的病毒中，自发突变率高得多(10-3~10-6)，原因是RNA复制酶中缺少校正阅读活性
induced mutation（诱导突变）利用自然界各种物理或化学诱变剂处理野生型病毒能够诱发突变，提高病毒群体中的突变率。
体外诱变剂：对病毒的静态核苷酸进行化学修饰，使其在后面的复制中碱基配对发生改变，导致同型碱基置换和异型碱基颠换，如亚硝酸、羟胺、烷化剂等
体内诱变剂：作用于代谢活跃的核苷酸，为碱基类似物或插入剂
动物病毒几种突变体：
蚀斑突变体plaque mutant
寄主范围突变体 host range mutant
抗药性突变体 drug resistance mutant
抗原突变体 antibody resistance mutant
回复突变体 revertant
无效突变体null mutant:1个基因完全失活
温度敏感突变体temperature-sensitive
无效突变体中病毒的一个基因完全失活，一般来说，核苷酸任何形式的改变都能产生无效突变体表型。不管是大的插入、缺失、无意义读框移位突变必然产生null突变体表型。部分突变体保留完整的功能蛋白片段。作用：确定必需基因
ts突变体是一种条件致死突变体。由误义突变产生，即突变体某个基因的核苷酸序列发生变化，在高温条件下(非允许温度)，该基因编码的蛋白质不能形成或不能维持它的功能构型，在允许温度(低温)条件下，这一蛋白质能形成功能构型，允许突变体增殖。允许温度下产生的蛋白质或粒子可能不耐热，ts突变可辅助鉴定突变体蛋白，或显示某一蛋白质是结构蛋白。
突变的概念：病毒核酸中基因组（遗传信息）发生遗传变异，而不是由于外来的其它病毒或生物体遗传物质的介入所引起的变异
位点突变point mutation温度敏感变种（temperature sensitive, ts)、空斑大小变种、酶缺陷变种、热适应变种等 （多效作用pleiotropism)
缺失突变deletion mutation基因组的一部分丢失，有可能失去独立繁殖能力，甚至致死性
突变的结果有时导致病毒不能生存，如ts变种：
&& 在较低温度下多肽结构稳定，功能正常，在较高温度时结构变化，易被细胞蛋白酶降解。应用：减毒疫苗
多效作用Pleiotropism :几个明显不相关的表型效应由单个基因所决定。
缺失突变deletion mutation缺陷性干扰（病毒）颗粒（defective interfering particle,&& DI particle)
在某些条件下，如细胞培养中接种大剂量病毒并连续传代，易感细胞被感染后只产生少量有感染性的病毒粒子，而大量病毒粒子的基因组不完全，成为DI 颗粒。
具有普遍性，几乎所有RNA病毒各科和大多数DNA病毒各科都有发现
对同源的完全病毒有干扰作用，这种现象在理论和致病作用中都很重要。
DI颗粒产生的一些特征：1、接种量过大,m.o.i 高,DI颗粒增加，完全病毒减少2、DI颗粒的产生受宿主细胞种类控制3、基因组不完全，有片段缺失4、与完全病毒形态无差异，沉降系数相近5、必须在完全病毒存在时才能增殖6、干扰同源病毒完整粒子的生成机理尚不清，核酸链短，复制快，竞争强7、与病毒的持续性感染密切相关，可减轻发病，减少死亡，更可能引起慢性带毒感染
m.o.i (multiplicity of infection):每一敏感细胞所能吸附的相应病毒的数量
病毒突变的分子机制
3、病毒突变的分子机制取代substitution&&&&&&&& 一个核苷酸被另一个核苷酸所取代增加-缺失addition-deletion&&&&&&& 一/几个（或一对）核苷酸增加或缺失重排rearrangement&&&&&&& 代表一个或几个基因的多核苷酸片段连接顺序与原来的不同&蛋白质结构变化
（二）病毒之间的遗传互作
1、遗传重组
重组是混合感染中病毒基因组之间的物理作用
根据基因组的结构分为3种：
（1）分子内重组 intramolecular recombination通过核酸断裂与重接：（单一分子基因组病毒）
（2）重配reassortment多分体病毒在混合感染中，来源于不同亲本病毒的基因组片段可能重新组合：
(3) 拷贝选择重组(copy-choice recombination)&&& 在部分具单一分子基因组RNA病毒中, RNA聚合酶选择性地连接到静止模板链上进行RNA子代链的合成。仍属于分子内重组,但不涉及核酸分子的共价断裂
基因重组的类型(按重组病毒的种类分)：（1）活性病毒间的基因重组（2）灭活病毒间的基因重组（3）活性病毒与灭活病毒间的基因重组（4）病毒与细胞间的基因重组
交叉复活cross reactivation:一株活性病毒与另一株相关但具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞,由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性病毒重组体,又称标记拯救marker rescue。
2、 复感染复活multiplicity reactivation
现象：以同一株灭活病毒大量感染敏感细胞时，有时会产生活的感染性病毒。
原因：在灭活过程中，遭受破坏的病毒基因组部位不同，发生所谓的致死性变异，虽然单独地说，这些病毒都已灭活，但在用它感染大量敏感细胞时，由于取长补短，恢复了原毒株灭活前的所有基因结构而发生复活。理论上，灭活病毒感染组培细胞、或灭活疫苗（用紫外线、羟胺、原黄素等不太强的灭活剂时）都存在这种可能。
（三）病毒之间的非遗传互作病毒基因产物之间的互作& 两种病毒感染同一细胞时，除可发生基因重组外、基因产物（蛋白质）的作用也可使产生的后代呈现表型变异1、表型混合phenotypic& mixing&& 2、互补作用complementation&& 3、加强作用enhancement4、干扰作用interference&& 5、互不干扰
1、表型混合 phenotypic& mixing在某些具有共同特点（如衣壳类型或出芽方式）的2种病毒混合侵染中，子代的表型具有双方亲代的特征，而基因型无变化。出现转壳现象。
转壳现象：混合感染产生的子代病毒是一种病毒的基因组完全被另一种病毒的外壳蛋白包裹，暂时性。
2、互补作用 complementation同种或异种的许多病毒颗粒在混合感染同一细胞时，也可能发生：一种病毒的增殖促进另一病毒增殖，甚至为另一种病毒增殖所必需。如腺病毒与腺联病毒的关系。可发生于同种病毒的不同株系之间；异种病毒之间；活病毒与灭活病毒之间。互补作用与基因重组不同，不涉及任何病毒核酸的交换，可能一个病毒提供给另一病毒不能产生的基因产物，使后者能在混合感染的细胞中增殖。
应用:互补试验可发现病毒结构中的功能单位及其与表型的关系。
3、 干扰现象 interference干扰现象发生于不同的病毒间、同种病毒的不同毒株间；甚至同种的灭活病毒与活病毒之间；
可能机理：（1）细胞膜上的病毒受体被第1种病毒破坏，使第2种病毒不能吸附；（2）第1种病毒封锁了第2种病毒mRNA的转译；或第1种病毒的核酸复制酶使第2种病毒的基因组丧失功能；（3）DI颗粒（Defective Interfering particle)；（4）干扰素(interferon, INF)
4、加强作用enhancements
在某些混合感染中，1种病毒可以增强第2种病毒的增殖
见于2种互不相关的病毒间；偶见于同种病毒的两个变异株之间
机理：2病毒的基因互作或1种病毒激活1种酶，促进另一病毒对细胞的穿透。
5、互不干扰
两种不同的病毒侵入同一宿主细胞，可各自独立繁殖，各自产生特征性的感染。
如犬肾细胞培养可同时被犬瘟热病毒与犬肝炎病毒感染。
缺陷病毒 defective virus在自然界中存在一些天生的缺陷病毒，它们在任何条件下都不能独立繁殖，必须依靠另一种病毒提供某些必需物质。后者称辅助病毒helper virus，前者称卫星病毒satellite virus它们之间具有天然的协作关系如：腺联病毒&&腺病毒Rous肉瘤病毒&&禽白血病病毒(提供囊膜糖蛋白）HDV&&HBV
DI颗粒是缺失突变的不完全病毒颗粒
三种具有生物活性的缺陷病毒基因组
整合缺陷基因组(integrated defective genomes)&&&& 整合缺陷基因组在宿主细胞中通过转导，活化，失活，染色体断裂，染色体重排等方式产生感染表型变化
卫星病毒(satellite virus)&&& 卫星病毒需要与之无关的其他病毒基因产物才能复制，部分与它的辅助病毒基因组有同源性，但大多数具有独特的基因组序列。
依赖辅助因子的缺陷干扰病毒(helper-dependent defective interfering virus)
DI病毒具有三个特征：缺陷性&&基因有损伤干扰性&&干扰标准辅助病毒或其他同源病毒的增殖富集性&&耗费其它病毒而富集自己
（四）病毒的变异现象病毒突变的表现型：噬菌斑形态plaque mutants寄主范围温度敏感性：一类对高温表现敏感的突变体低温敏感性无义突变：终止突变(UAG& UGA& UAA)缺失突变: 如DI颗粒生化特征：药物抗性、毒力变化对钝化剂的敏感性、使蛋白或核酸电泳迁移率变化等其他性状变异现象：毒力变异：细胞水平、机体水平、生物群体水平抗原变异：免疫原性、抗原结构、结合力培养性状变异：蚀斑、空斑形态和性质对理化因素抵抗力的变异：对温度、射线、化学剂的感受性等
适应性变异自然条件下不感染或不易感染的异种动物/细胞的适应性变异强毒株&&新宿主症状轻&&连续传代&&新宿主症状重（往往对原宿主的 毒力降低成为弱毒株）
适应性变异原理：宿主细胞的选择性结果病毒对不易感宿主的适应如流感病毒有甲乙丙三个型，其中甲型中有15个HA亚型、9个NA亚型，各个型之间往往不能相互免疫。
二、病毒变异的研究方法
（一）病毒纯化&1、蚀斑（空斑）分离法&2、病斑分离法&3、终点稀释法选取组织&&消毒&&酶解&&洗涤&&培养单层细胞&&接种病毒&&保温培养&&空斑观察&&单斑再分离
病毒高倍稀释，如每一稀释度接种5管细胞培养物：如10-7 全有病斑；10-8中3管有病斑； 10-9全无病斑则10-8管为终点，有条件地认为是一个或少数几个病毒颗粒的后代。广泛用于毒株的纯化和变异株选育
（二）、获得变异株的途径1、从自然变异中选取2、温度诱变3、辐射诱变：紫外线、X射线、r射线4、化学诱变&（1）碱基替代：5-溴尿核苷、氨基嘌呤等&（2）作用核酸：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂
（三）、病毒的遗传指标1、病毒颗粒的形态；2、抗原构造及血清学性状；3、蚀斑或空斑的大小和性状；4、致细胞病变的特征；5、病原性（包括感染范围和毒力）；6、对理化因素的抵抗力；7、对干扰素的敏感性
植物病毒的遗传指标：1、血清学反应；2、交叉保护作用；3、传播方式；4、寄主范围；5、症状类型；6、对理化性状的稳定性
病毒基因功能的研究方法
互补试验&& 用成对病毒突变体混合感染，一种病毒为另一种病毒提供了其必需但又缺陷的基因产物，从而促进其增殖，或者两种病毒互为对方提供所必需的基因产物，能促进双方的增殖。互补过程中，感染病毒的基因型都没有改变。
利用分离基因研究病毒基因功能
用克隆序列进行互补试验
转染后的瞬时表达
病毒表达载体
由于一些病毒可以感染动物和人类的特异组织细胞，利用这些病毒构建外源基因表达载体，用于人类一些特殊疾病的基因治疗，前景诱人。
病毒载体提供了一个病毒或细胞基因进入哺乳动物细胞的极好工具。
优点：能引导多拷贝目的基因进入几乎每个培养细胞。动物病毒载体既能稳定地表达基因，也能瞬时表达基因。
经常用于瞬时表达的病毒载体主要来源于裂解性病毒，如：乳多空病毒、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒等
本章重点：
1、亚病毒的类型，各有何特点？
2、了解朊病毒的研究进展，常见的朊病毒病。
3、研究亚病毒的意义
4、有关名词
第六章&& 亚病毒感染因子Subviral agents
真病毒Euvirus: 至少有核酸和蛋白质两种组分&瑞士学者T.O.Diener1971年发现马铃薯纺锤形块茎病的病原是一种只有侵染性小分子RNA而无蛋白质的感染因子，称为类病毒(viroid)&&PSTV(Potato spindle tuber disease, PSTD)。
类病毒是一个裸露的闭合环状RNA分子，它能感染寄主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症。类病毒的分子量小，仅为最小RNA病毒的十分之一，约10万Da类病毒是共价闭合的单链环状RNA分子，大小为246-399个核苷酸。所有的类病毒RNA没有mRNA活性，不编码任何蛋白
PSTV的结构&长50nm的棒状dsRNA分子，由2个互补的半体组成，一个含179个核苷酸，另一个含180个核苷酸，两者间有70%的碱基以氢键方式结合，形成122个碱基对，整个棒状结构中有27个内环，最大的螺旋含8个碱基对，最大的内环含有12个核苷酸。
类病毒的分类目前ICTV公布的类病毒有27种，分为2个科、7个属：1、马铃薯纺锤形块茎类病毒科&& 5属2、 鳄梨白斑类病毒科&& 2属
类病毒病诊断和鉴定
Koch&s& postulates1、在病体中找不到细胞和体细胞的致病因子，可机械摩擦或昆虫媒介传染2、检测小分子核酸5S~7S,区别于植物的RNA&&&&&&&&& PAGE 浓度5%、10%、20% (一般病毒2%）3、接种&&& 电泳带酚抽提液接种敏感寄主4、提纯
类病毒的提纯&
类病毒致病性机理：
类病毒RNA分子直接干扰寄主细胞的核酸代谢
类病毒也能结合到前mRNA的识别位点上，干扰mRNA的加工
类病毒的+RNA 和-RNA还能作为寄主基因组DNA模板的竞争者，与依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ结合，使之指导类病毒的复制，破坏了mRNA的合成。
类病毒复制：
类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶
健康植物中含两种类型的RNA合成系统：1、依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅰ、 Ⅱ 和Ⅲ&&&&& 2、依赖于RNA的RNA聚合酶v& 类病毒RNA在分子内的高度碱基配对和G:C含量，使其非常象DNA分子，寄主的依赖于DNA的RNA聚合酶可能以其作模板合成类病毒的RNA
类病毒复制的滚环理论：+RNA&-RNA寡聚物&+RNA寡聚物（类病毒的前提）&裂解成+RNA单位长度的线性贩子&（经过末端修饰）共价闭合环状分子。环状类病毒进入宿主细胞后：首先以(+)链类病毒为模板转录生成多个单位长度的(-)链复制中间体，其(-)链复制中间体有两种可能的命运：
先被切割，再环化：(-)链复制中间体先被切割生成单位长度的线状(-)链分子，再自我环化，然后以环化(-)链为模板转录出多个单位长度的(+)链复制中间体，再进一步修饰和连接，形成具有感染性的单体环化的类病毒分子；
先转录，再被切割修饰：多个单位长度的(-)链复制中间体直接转录生成(+)链复制中间体的模板，然后剪接修饰。鳄梨白斑类病毒ASBVd(+)链和(-)链复制中间体中均发现有锤头样核酶结构，因此推测ASBVd可能是采取第一种复制途径，而PSTVd可能是利用第二种复制途径。
类病毒的起源
推测、设想：1、原始生命形态非生命&类病毒&病毒&原始细胞&&2、起源于寄主核酸存在于细胞核，与寄主核酸同源性高3、起源于病毒核酸缺失编码外壳蛋白的基因，RNA噬菌体核酸复制
类病毒病的防治：1、综合防治：避病、防侵染、培育无病种苗、防治传播介体2、抗病品种3、药剂：微量元素ZnSO4、H3BO3、CuSO4 等4、弱毒株保护
二、朊病毒prion
阮病毒病的特征：人和哺乳动物朊病毒病的潜伏期特别长．一般为数月乃至数10年时间，病程进行缓慢，由朊病毒感染中枢神经系统所产生的病理学特点为：① 神经原、神经轴索、星状细胞、树枝细胞呈进行性空泡化② 神经胶质增生；③ 细胞外淀粉样变性蛋白沉积，形成光镜下可见的病理学特征&如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝(scrapic-associated fibril，SAF)CJD则表现为淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)，其实质均为传染性朊病毒蛋白的团块。
朊病毒蛋白(prion protein, PrP)朊病毒在电镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm(一般为125-150nm)，杆状颗粒不单独存在，总是呈丛状排列，其大小和形状不一，有的丛含有多达100个杆状颗粒。朊病毒蛋白(PrP)是由一种分子量为33-35kD的正常细胞蛋白prpc发生构型转变形成的，由于它类似于羊搔痒因子，故又称为prpsc 。几点说明：prpsc是prpc 的异构体，2者的一级结构和分子量大小完全相同。prpsc在蛋白酶解作用下切去N端序列，可生成prpsc 27-30kD。prpsc 27-30kD是一种蛋白酶抗性蛋白(proteinase-resistant protein)，该蛋白能够聚合成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白。正常的prpc与prpsc之间在构型上的差异主要表现为α螺旋含量减少，β折叠的含量增加。侵染性的朊病毒的单体含有3个或少于3个prp 分子，而杆丛聚合体可能含多到105个prp分子，其半感染剂量(ID50)介于10-100个杆状体。朊病毒的分子量为27-30 kDa。提纯的朊病毒用刚果红染色，在光学显微镜下可看到许多无定形结构，大小为1-20μm。Prp具两种形式prpc 和prpsc。来源于同一个基因，宿主染色体基因编码，人的prp基因定位于20号染色体的短臂上。
PrPc的生理功能prpc是一种细胞膜结合的糖蛋白，但通过膜内陷可进入细胞内，通常位于细胞内的prpc是可溶性蛋白。
在神经系统中的可能作用：
参与神经系统功能的维持
通过抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤，PrPc通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性
参与淋巴细胞的信号转导&
参与核酸代谢
PrPC可能具有调整程序细胞死亡的功能
PrP27~30是羊搔痒症致病因子证据：1、核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学因子处理2、用生化方法与搔痒因子共纯化，其浓度与传染力在正相关3、 PrP27~30的分解动力学与传染性相同4、亲和层析纯化的PrP27~30具有传染性5、用中和抗体中和PrP27~30其传染性消失
Prp 构型变化导致蛋白质性质变化&
prp功能：& 学习和长期记忆的保持所必须&&&&&&&& CJD、GSS痴呆&&这些功能的丧失
朊病毒蛋白的传染过程：
少量PrPSc与细胞PrPc结合后，以PrPSc为模板，使PrPc发生明显的构象改变而转变为PrPSc；
PrPSc传染扩增，最后使PrPc全部转变成不溶性的PrPSc；脑组织形成淀粉样斑块直至死亡；
PrPc转变成PrPSc后造成PrPc缺失，使得：
神经细胞SOD酶活性下降，从而对超氧化物等所造& 成的氧化损伤的敏感性增加
神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综合导致神经细胞死亡变性
PrPSc分子通过形成长纤维的方式破坏正常的脑组织。
朊病毒蛋白质的构象转变假说：
&&&&&&&& 1、&种子&模型
&&&& &&&prpsc 充当&种子&, prpc单体构象比prpsc更稳定
在没有&种子&存在时，固有的PrPC和极少量PrPsc单体之间发生快速的可逆性构象变化。
当条件适宜时，PrPsc分子之间可互补缔合而变得稳定。从而使平衡式向PrPsc方向反应，直至形成一稳定的&种子&。
这个&种子&可通过互相粘着而继续生长，最后碎裂成小的感染单位。
此模式能解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病。已有科学实验支持。
2、重折叠模式&& 模板介导的转换过程
依靠催化PrPc或一个不稳定的中间体的重排来提高转换，以形成更稳定的PrPsc构象。
能解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病。点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量，同时加快它转换成PrPsc的速率。
但此模型还无科学实验支持。&& 淋巴结是传播少量朊病毒到神经系统的关键所在
致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发现 有一种蛋白可能是朊病毒中关键蛋白，裂解感染性蛋白生成&种子&片段，然后侵袭脑组织致宿主迅速死亡。传播过程中还存在另一关键步骤&&朊病毒复合物的裂解片段的存在。朊病毒复制需要有热休克蛋白(Hsp104)参与 ，可能具有这种蛋白&粉碎机&的功能。
疯牛病(Mad cow disease)即牛海绵状脑病 BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy)
一、来源与分布：1985年英国农场牛群，比利时、法国、德国、意大利、加拿大、日本等
二、易感动物：小白鼠、羊、猪、猫、羚羊、金丝猴、猕猴等，但不感染仓鼠
三、传播途径：垂直传播、被污染的饲料经口腔传染。常见的传染源：骨、肌肉、肉骨粉、脏器、淋巴结、唾液、血液等
四、病原：用BSE患牛脑组织匀浆接种小白鼠，症状相似分布于中枢神经系统，其次存在于脾、淋巴结，肠、唾液腺中浓度高，肌肉和血液中较低，粪便、尿液中很少对高强度理化灭活处理有很强抵抗力，经核辐射仍可存活，普通烹调温度、消毒、冷冻和干燥均无灭活作用，对强酸强碱抵抗力强，对福尔马林、紫外线不敏感，121℃耐30min，用2-5%次氯酸钠处理24h才灭活
五、临床症状：1、行为变化：恐惧、神经质、狂暴、具攻击性2、姿势和运动异常：后躯运动失调、站立困难、头部和肩部肌肉震颤抽搐、倒地不起3、感觉变化：对声音、气味和触摸过敏
离群、不安、体温偏高、体质下降、产奶量减少、呼吸频率高、震颤、倒地不起、死亡& 发病几个星期&&12个月；潜伏期2&8年（4-5）；牛：22个月&&17岁（3-5年）
六、病理变化1、脑灰质呈空泡变性2、神经元消失3、原胶质细胞肥大
朊病毒消毒方法和朊病毒病的防治：
病原因子136℃高压蒸汽消毒1h
1~2mol/L NaOH 处理1h以上
5 mol/L以上的NaClO溶液消毒2h
960ml/L的乙酸溶液浸泡1h以上（固定组织的甲醛100ml/L对病料消毒不彻底）
焚烧病畜及产品
培养抗病家畜（利用蛋白质构象变化的机理）
人类朊病毒病：人的朊病毒病可分为传染型、遗传型和散发型三种形式l& 传染型&&朊病毒在人群中水平传播
Kuru病:主要局限于巴布亚新几内亚的Fore族人群，传播途径与食人肉习俗有关,症状与羊搔痒病相似
医原性CJD:通过接受CJD患者捐献的器官或静脉注射污染有朊病毒的人生长激素传播l& 遗传型&&家族性CJD、FFI和GSS，由生殖细胞突变形成l& 散发型&&大多数CJD和部分GSS，其致病机制可能与体细胞突变或PrP的自发性构型改变有关l& 除此之外，在英国和法国还发现一种变异型CJD，可能是由牛朊病毒传染给人所引起的1、& 库鲁病（kuru)/震颤病；2、克雅氏病（CJD)；3、格斯综合症（GSS)；4、新型克雅氏病（vCJD)5、5、传染性病毒痴呆病（早老性痴呆病） (Presenile Dementia)；6、致死性家族失眠病(Fatal Familial Insomnia, FFI)
库鲁病（kuru)亚急性传染性海绵状脑病小脑共济失调、震颤&&丧失运动能力，伴有构音障碍，患者100%死亡。潜伏期4~30年新几内亚东高原Fore人陋习&&吃尸脑流行区有3万多人/1000英里2发病成年女:男5 : 1&&&&&&& 男 : 女 2~3& :& 1高原温度（水沸点） & 95 ℃
克雅氏病（CJD) 100%死亡全球分布，我国有发生(潜伏期可长达30年)感冒样症状&&精神异常，痴呆、小脑共济失调、昏迷伴有肺部感染死亡病程 ：数月~1年（平均5个月）散发型90%、遗传型10%医源型少：污染的医疗器械、组织移植、注射脑垂体源激素（生长素、促性腺素等）&&&
新型克雅氏病（vCJD)临床：忧虑、抑郁、进行性神经异常&&小脑& 综合症，健忘、痴呆肌阵挛或舞蹈病，无CJD脑电图异常。病理：海绵状脑
三、卫星病毒satellites
在植物病毒中，有些病毒含有两种相关的病毒颗粒:& 一种是较大的病毒颗粒，另一种是较小的病毒颗粒&& &这两种病毒颗粒之间的抗原性完全不同;&& &它们的RNA核苷酸序列也无同源性;&& &小病毒颗粒RNA的侵染与复制必需依赖于大病毒颗粒
将这种小病毒颗粒称为卫星病毒，大病毒颗粒称为辅助病毒helper virus。&&&&&&& Satellite Tobacco necrosis virus( STNV)&&&&& 16.8nm/28nm
比较不同卫星病毒，发现它们都有下列性质：
单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制（基因组有缺陷）
非辅助病毒复制所必需，可抑制辅助病毒的复制
卫星病毒的RNA能够编码自身的外壳蛋白，其外壳蛋白与辅助病毒没有血清学关系
卫星病毒RNA与辅助病毒基因组RNA核苷酸序列无同源性
卫星RNA是伴随病毒复制的低分子量（300~ 400b)线状小RNA，不能独立复制,完全依赖于特定辅助病毒, 它与病毒RNA无序列同源性。CMV的卫星RNA：335个核苷酸组成，复制依赖于辅助病毒，但又干扰辅助病毒RNA的复制，降低病毒的致病能力，并改变寄主植物的症状表现。既是侵染病毒的RNA，又是亚病毒之一。卫星RNA能作为黄瓜花叶病毒病的生防因子
ICTV已将卫星核酸分为：
单链卫星DNA：番茄卷叶病毒卫星DNA
双链卫星RNA：啤酒酵母M病毒卫星RNA
单链卫星RNA：CMV卫星RNA等
病毒卫星RNA致弱病毒机理：一、抑制病毒及其基因组复制CMV为三分体RNA基因组病毒，含：&RNA-1（3900b）RNA-2（3400b）&&& 侵染性所必须RNA-3（2193b）另含有亚基因组RNA-4(1027b)，&&&& 其卫星RNA称RNA-5（335b）
&研究单独卫星RNA对病毒复制的影响（1）去除卫星RNA的CMV（电泳洗脱,多次单斑分离，纯化）（2）表达卫星RNA的转基因植株
卫星RNA对CMV复制的影响
&转卫星基因和未转化（对照）的烟草和番茄幼苗接种不含卫星RNA的CMV后(用病汁液定量接种藜)：表达卫星RNA的斑点数只相当于对照的8.5%~23.7%
测定卫星RNA量与病毒RNA量烟草分别接种&& 含卫星RNA的CMV&& 不含卫星RNA的CMV用3H尿嘧啶核苷酸标记&& 提取总RNA后&& PAGE分离，分别测定RNA量，结果：接种含卫星RNA的CMV处理&&卫星RNA含量高接种不含卫星RNA的CMV处理&&病毒RNA含量稳定
卫星RNA大量积累，而病毒基因组RNA复制受抑
卫星RNA对病毒基因组RNA的体外复制有抑制作用
二、抑制外壳蛋白进入叶绿体
病毒致病机理：1、病毒外壳蛋白(CP)的致病作用2、CMV-CP可进入完整的离体叶绿体3、CMV-CP抑制离体叶绿体光系统Ⅱ※&& 卫星RNA干扰CMV-CP、番茄不孕病毒 (TAV) CP进入叶绿体
卫星RNA对其它病原物的生物学效应1、卫星RNA抑制类病毒&&&&& 卫星RNA直接作用于PSTVd复制过程2、卫星RNA致弱的CMV诱导植物产生对&&&&&& 真菌病害的抗性&&&&&& 黄瓜霜霉病& 为对照发病率20%~30%&& 卫星dsRNA诊断：温度梯度（30~70℃）电泳核苷酸序列有1~2个核苷的突变也可在变性图谱和转变温度上反应出来
DI颗粒、卫星病毒、卫星RNA、类病毒性质的比较a: 因缺失部位而有所不同，脊髓灰质炎病毒DI RNA能复制但不被壳体化b: STMV基因组的3&端与辅助病毒有序列和结构的相似性c: 某些嵌合的卫星RNA与其辅助病毒基因组有广泛的3&序列同源性
依赖辅助病毒复制
特异性外壳壳体化
辅助病毒外壳壳体化
抑制辅助病毒复制
与辅助病毒序列同源性
在体内和体外RNA的稳定性
亚病毒研究提供的启发：1、传染病病原物的种类远未穷尽2、类病毒和朊病毒病害防治研究和实践证明，病毒的基因组愈小愈简单，它所引起的病害的防治越困难(对紫外线（260nm）的抵抗力比一般病毒高倍）3、可复制的致病基因组大小的下限也未穷尽4、生物大分子无疑是分子生物学研究的主要对象，但生物小分子也不容忽视
第七章&& 昆虫病毒
本章重点：了解昆虫病毒的特点及其应用
根据&Virus taxanomy1999&，昆虫病毒可分为7个科:1、杆状病毒科（Baculoviridae） 核型多角体病毒属（Nucleopolyhedrovirus）颗粒体病毒属（Granulovirus）2、呼肠孤病毒科（Reoviridae） 质型多角体病毒属（Cypovirus）3、痘病毒科（Poxviridae）昆虫痘病毒亚科（Entomopoxvirinae）4、细小病毒科（Parvoviridae）浓核病毒亚科（Densovirunae）5、虹彩病毒科（Iridoviridae）虹彩病毒属（Iridovirus）6、弹状病毒科（Rhabdoviridae）西格马病毒属（Sigmavirus）7、微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Entervirus）
昆虫病毒的类型：
DNA病毒&&dsDNA病毒，包括:& ①杆状病毒科；②多分DNA病毒科；③痘病毒科；&&& ④泡囊病毒科；⑤虹彩病毒科。
DNA病毒&&ssDNA病毒．包括细小病毒科。
DNA和RNA反转录病毒，包括：& ①前病毒科； ②变位病毒科。
RNA病毒&&dsRNA病毒，包括: ①呼肠孤病毒科：②二分RNA病毒科
RNA病毒&&ssRNA病毒，包括: ①微RNA病毒科；②野田村病毒科；③T4病毒科
昆虫病毒的一般特性：
(1)大多数昆虫病毒能形成包含体，病毒粒子封闭在包含体中,包含体的主要成分是蛋白质。
包含体的特性：v& 在许多有机溶剂中不溶解（酒精、乙醚、氯仿、苯和丙酮），对蛋白酶抗性强，但它们溶解于碳酸钠、氢氧化钠、氨的水溶液中。v& 在自然条件下比较稳定，落到土壤中的包含体病毒能保持活性多年v& 对高温敏感，对阳光和紫外线也缺乏抵抗力，一般的消毒剂也可使包含体病毒失活。
重点！根据包含体在寄主细胞中的部位，分为：²& 核型多角体病毒(NPV，nuclear polyhedrosis virus)：寄生在寄主细胞核内，包含体内含有多个杆状病毒粒子。²& 质型多角体病毒(CPV,cytoplasmic polyhedrosis virus)：寄生在寄主细胞质中，包含体内含有多个球状病毒粒子。²& 颗粒体病毒(GV，granulosis virus)：在感染的细胞核里和细胞质里均可发育形成。多为椭圆形，也有肾形。每个包含体一般仅含一个杆状病毒粒子。 ²& 无包含体病毒 ：如昆虫浓核病毒，感染病毒的宿主细胞核膨大，核内物质呈浓密、丰盈现象。²& 昆虫痘病毒（Vagoiavirus）:椭圆形与纺锤形包涵体存在于细胞质内，但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的.
(2) 昆虫病毒主要是通过口器感染
(3) 有些昆虫是植物病毒的介体，一般对介体昆虫无害
(4)昆虫病毒可用于害虫的生物防治
昆虫病毒的优缺点：（1）宿主特异高& 能杀灭害虫，而不影响害虫的天敌，引起主要害虫的再猖獗与次要害虫上升等可能性较小；（2）不会污染环境，对人畜安全& 昆虫病毒是自然界本来存在的，特别杆状病毒（核型多角体病毒与颗粒体病毒）对河虾、牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物也无任何中毒性、致病性或异常变态反应；（3）后效作用明显& 不仅病虫本身就是病毒生产的&小工厂&，而且有些情况下，病毒还可经卵传染，杀灭次代害虫，化学农药无此特点。（4）生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广
昆虫病毒的应用：
昆虫病毒可用于害虫的生物防治
²& 中科院武汉病毒所研究成功"生物导弹"新技术，防治松毛虫获得成功。²& 利用卵寄生赤眼蜂特有的行为特点，结合昆虫病毒流行病学规律，通过卵寄生蜂将经过高新技术处理的强毒力病毒制剂传递到靶害虫卵表面，使初孵幼虫罹病死亡。²& 既能有效地控制害虫大发生，又可以保护天敌，不污染环境，对人畜安全无害。
生物导弹介绍：t&& 以卵寄生蜂为媒介传递病毒防治害虫,用柞蚕卵来繁殖赤眼蜂,并将研制的适应赤眼蜂携带的病毒剂型均匀地雾化喷洒在柞蚕卵表面。当赤眼蜂咬破壳从蚕壳爬出来时,每个蜂身上可粘上数百个病毒。赤眼蜂能迅速准确地找到害虫卵作为寄生卵,贴近害虫卵壳的同时,病毒粘到卵壳上,使害虫种群发生病毒性流行病。t&& 只用5枚生物导弹就可控制一亩地范围的松毛虫流行;持续期长,一次防治多年受益。t&& 实施方法简单：将半个火柴盒大小的&生物导弹&挂在树木一人高处。
昆虫病毒生产过程饲养昆虫&病毒感染&收集病毒
杆状病毒(Baculovirus)
有包膜的超大双链闭合环状DNA病毒 (135k bp)
分类上独立为杆状病毒科(Baculovidae),分3个属：&& 多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)&& 颗粒体病毒属(Granulovirus)&& 非包埋杆状病毒属(Nonoccluded Baculoviruses)
目前至少从600多种昆虫和其他无脊椎动物中发现各种病毒的感染&&调节种群密度
感染病毒的幼虫形成大量包含体，扩散、传播
杆状病毒有宿主专一性，对脊椎动物、植物完全不感染&&应用安全
主要见于昆虫体内，是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多，且实用意义最大的。
主要应用:&& 作为载体，表达外源基因;&& 作为杀虫剂，有效地控制农业害虫的发生，并且对环境不造成污染。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedorosis Virus, AcMNPV)研究得最深入。
杆状病毒的形态特征：&& 包含体：核多角体、颗粒体&& 病毒粒子:有包膜、产生2种：芽生型bubed（早期）和包埋型occluded（晚期）
杆状病毒的病理学特征：&& 宿主仅限于节肢动物&& 动作迟缓、食欲减退、虫体肿胀，轻触即破，流出浓汁（无臭），倒悬而死。&& 可入侵中肠组织、进入血淋巴及其他组织&& 从感染到死亡需5~7d。
昆虫杆状病毒表达载体系统 Baculovirus Expression Vector System，BEVS
80S初，国外学者发现多角体蛋白基因（polh)的强启动子及晚期大量表达的特性，Smith等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞表达系统，表达了人β干扰素。
从此，以杆状病毒作为载体，在昆虫细胞或虫体内表达外源基因，形成了BEVS 。早期的BEVS有很多不足，如：
&重组率较低
&操作周期长
&产物不易纯化等短短20多年时间里，随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入，杆状病毒表达系统迅速发展，不断完善，已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越来越重要的作用。
通常BEVS由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以下几步：
先将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列（flanking secquence)， 构建成转移载体；
把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组，再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。
最后空斑纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化所表达的外源蛋白。
优势（与细菌、 酵母、 哺乳动物细胞表达系统相比）：
多角体基因启动子下的超高表达效率；
表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性；
可同时表达多个外源蛋白，来源遍及动物、植物、细菌真菌和病毒；
能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；
蛋白产物易从无血清的培养上清中纯化，无内毒素污染；
生物安全性高，对植物和脊椎动物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱。
第八章& 病毒学研究方法简介
本章要点：病毒学研究的主要技术与原理
生物安全实验室
P1实验室&&研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；
P2实验室&&研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩；
P3实验室&&研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多；
P4实验室&&全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。
病毒学研究的主要方法：
生物学特性测定:在寄主上的反应&&症状、传播等
病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法
光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况
免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体
分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等
一、生物学特性测定：
在寄主上的反应：寄主范围、症状表现、传播方式等
病毒的理化性质：病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等
病毒接种方法：注射接种、病毒组织培养技术；植物病毒&&汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁&& 接接种、菟丝子接种法等
巨细胞病毒感染细胞的典型&猫头鹰眼&样核内包涵体
鸡胚接种：
卵黄囊接种：用5~8d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒
羊膜腔：用12~14d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离
尿囊腔：用9~12d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等
绒膜尿囊膜：用10~12d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒
二、病毒的分离与培养
&&& 要证明某种疾病是某一感染因子所引起．则必须满足Rivers法则：① 从患病者体内分离出病毒；② 在实验动物或寄主细胞中可以培养；③ 证明这种培养物具有滤过性；④ 在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；⑤ 能重新分离出病毒。
病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。
病毒分离(virus isolation)是诊断病毒感染的&金标准&(goldstandard)。
标本采集和运送：时间：发病早期部位：视发病规律和病程而定运送：立即送检 4℃ 保存或-70℃（长期保存）& 不泄漏、传播、填写详细标签分离与鉴定
（一）& 病毒的纯化与提纯一般纯化方法
动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法
植物病毒的纯化：
如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；
如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。
混合感染的病毒分离：1、根据病毒的性状、选择不同的寄主或根据病毒钝化温度和稀释终点的差异，如：&&&&&&&&&&&&& PVX&在千日红上引起局部病斑&&&&&&&&&&&&& PVY&在酸浆草上形成局部病斑，蔓陀罗对PVY免疫&&&&&&&&&&&& TMV 钝化温度90℃以上&&&&&&&&&&&& CMV钝化温度在60~70℃ （汁液接种前高温处理&.)2、& 虫媒传染： PVX不可由虫媒传， PVY可由桃蚜传。不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短3、果树等木本植物病毒，如找到草本寄主和传毒虫媒可用草本寄主纯化、繁殖、分离
病毒纯化中的必要参考属性：1. 稀释限点(dilution end point, DEP)抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度2. 钝化温度(thermal inactivation point, TIP)&& 病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露10min而达到完全钝化3. 体外存活期(L)病毒在抽提液中放在20~22℃条件下，能保持多少时间的侵染力。4. 沉降系数与分子量沉降系数S在20℃下1达因的引力场中的沉降的速度（cm/s)&& 常用1000&，植物病毒在50~几千S
（二）& 病毒提纯的原理
1、破碎寄主细胞低速离心(g，5~15min)去除较大的组分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体(内质网膜的小碎片)等较难去除。
2、提纯病毒的原理（1）大多数病毒的外面主要由蛋白质组成（2）病毒的大小、形状和密度适合在大约40000g重力下沉降
（三）病毒提纯的技术
常用试剂：1、适当的缓冲剂：保护病毒，不变性，如磷酸盐、硼酸盐、Tris-HCl等（种类、浓度）2、还原剂：防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶，如巯基乙醇/ 酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸3、溶剂：蛋白质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清，如正丁醇、氯仿、乙醚等4、鳌合剂： EDTA等，可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团聚和多元酚氧化5、其他添加剂：活性碳、膨润土& 吸附除去核粒和色素等
技术：1、差速离心和密度梯度离心
差速离心：交替使用高速和低速离心高速离心（g）使病毒沉淀，取沉淀低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清
密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离蔗糖10%~40%& CsCl等2、沉淀法：简便快速但粗糙易变性盐析法：硫酸铵浓度达30~50%饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀：加醋酸或盐酸丙酮沉淀：浓度达40~70%聚乙二醇沉淀：浓度达4~8%乙醇沉淀：浓度达20%& 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸铵沉淀3、吸附法：磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素4、酶处理：许多病毒抗蛋白酶和核酸酶5、有机溶剂萃取：有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：6、电泳法：普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等7、柱层析法：吸 附：用离子交换或吸附法；分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱8、抗血清处理：针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白；加病毒的抗血清形成病毒&抗体复合物
植物病毒提纯举例
硫酸铵沉淀法：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&超速离心法：&动物细胞培养包括动物培养、鸡胚培养、组织培养&&组织培养&&&
病毒学研究的主要方法：
生物学特性测定:在寄主上的反应&&症状、传播等
病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法
光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况
免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体
分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等
三、病毒的光镜与电镜观察法用光学显微镜观察寄主组织切片、包含体。
浓缩标本有以下几种方法：
超速离心& 离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h．沉淀的样本用灭...
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