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乙酰肝素酶抑制剂的研究进展
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肝素酶抑制剂对食管癌移植瘤中uPA VEGF蛋白表达的影响
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肝素酶与肿瘤转移
来源：青年人()&更新时间： 16:07:24 &【字体： 】
　肿瘤细胞实现扩散、转移，与免疫细胞趋向炎症反应区一样，必须首先穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。该屏障主要由两种成分构成：一是结构蛋白，包括胶原、层粘素、纤维结合素和玻璃体结合素等；二是糖氨聚糖，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate protoglycan，HSPG）。HSPG主要由一个蛋白核心和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）侧链组成［1］。起初认为，结构蛋白的破坏是肿瘤细胞转移的决定性步骤，因此，在过去的10多年中，研究兴趣大多集中在底物为结构蛋白的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）上［2］。事实上，糖氨聚糖作为细胞外基质和基底膜的另一主要成分，其相应水解酶应具有不可忽视的作用。最近，随着肝素酶基因得以克隆，相继获得一些令人振奋的实验结果，肝素酶在肿瘤细胞穿越血管壁，实现扩散、转移过程中的关键作用才受到人们广泛关注。
　　一、肝素酶的基因克隆及蛋白结构
　　自1979年Klein等首次报道一种降解HS的葡糖苷酸内切酶(endoglucoronidase)后，在一系列组织细胞中测得该酶活性。尽管过去的20年中有关纯化肝素酶的报道较多［3］，但结果并不理想，直到1996年，Vlodavsky的研究小组［4］才从人胎盘和肝癌细胞系中纯化到相对分子质量约为50 000的肝素酶，使得肝素酶基因克隆成为可能。他们利用其氨基酸序列信息从人胎盘cDNA文库中分离到全长为1 758 bp的人肝素酶cDNA，并以其cDNA为探针，从人基因组DNA文库中分离到肝素酶基因［5］。人肝素酶基因位于染色体4q 21.3，大小约为40 kb，含有12个外显子、11个内含子。该基因高度保守，人与小鼠、大鼠的同源性均为80%左右［5-8］。　　几乎在同时，Hulett等［8］、Toyoshima等［9］和Kussie等［10］3个小组分别从人血小板和SV40转化的胚胎成纤维细胞系中也纯化到相对分子质量约为50 000的肝素酶蛋白，并利用与上述相似的方法分离到人肝素酶全长cDNA，其开放阅读框架及其核苷酸序列与Vlodavsky的研究结果完全相同。　　现已知道，完整的人肝素酶cDNA编码一个由543个氨基酸残基组成的蛋白前体，相对分子质量为61 192［5，8］。专一性蛋白酶可将肝素酶前体在glu157-lys158处水解，切除N端157个氨基酸残基后，从而形成一个由C端386个氨基酸残基组成的活性很强的成熟蛋白，相对分子质量约为50 000。而前酶经水解激活是参与细胞外基质蛋白降解及细胞浸润的酶类的共同特征。前体多肽链有2个疏水区和一个亲水区，亲水性最强点位于N端第160氨基酸残基附近，使这一区域易于暴露，便于被蛋白酶水解。Fairbanks等［11］的研究表明，肝素酶蛋白其实是一个由2条多肽链通过非共价结合的异2聚体，相对分子质量分别为8 000和50 000，它们共同来源于肝素酶蛋白前体。人肝素酶共有6个糖基化位点，肝素酶前体经糖基化后相对分子质量约为65 000，其糖基化与否对于酶活性并无明显影响。
　　二、肝素酶的分布及活性
　　在许多正常组织细胞中，均可测得肝素酶活性，但其主要分布在胎盘、脾脏、血小板以及中性粒细胞、单核细胞、活化T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞内。　　Northern印迹分析表明，在非免疫组织中，2.0 kb大小的肝素酶mRNA仅在胎盘表达，在心脏、脑、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏以及胰脏不表达［8］。此外，在胎盘还检测到4.4 kb大小的mRNA，虽然在其他组织中也能检测到，但表达很低［8］。上述2种mRNA形式均可在脾脏、淋巴结、胸腺、外周血白细胞、骨髓及胎肝等免疫组织中检测到，外周血白细胞表达最高，其次是脾脏、淋巴结、骨髓和胎肝，而胸腺表达最低。2种mRNA形式在上述免疫组织中的表达水平相似，提示它们可能来自于同一基因。Southern印迹分析表明，人肝素酶基因是一个单拷贝基因。因此，4.4kb mRNA可能是一个剪接变异体，而不是一个相关基因的产物，或并不存在一个与肝素酶蛋白密切相关的家族。　　大量实验证明，肝素酶并不是糖氨聚糖内切酶(endoglucosaminidase)，而是一种葡糖苷酸内切酶, 是目前已确定的HSPG降解酶，其活性与HSPG 降解产物之间呈明显直线关系［12］。现有资料显示，糖苷键是肝素酶的水解位点，而肝素酶识别底物则需要底物至少含有2-O-硫酸基团［13］。降解产物末端为葡萄糖醛酸则是其最有力的证据［3］。　　肝素酶前体与成熟肝素酶之间可能并不象许多人所认为的只是酶原和酶的关系。将全长cDNA重组到CHO细胞中，可见大部分50 000蛋白和小部分65 000蛋白表达，而且2者均有活性，只是后者的单位活性比前者低近100倍。而昆虫细胞表达的65 000重组酶的特异性活性至少低1 000倍［5］。肝素酶可被胰蛋白酶和尿激酶灭活，但不能被组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶灭活［14］。该酶的最适pH值为5.1，在酸性条件下稳定，而在生理pH值下很快发生可逆性失活。　　肝素酶基因的调控序列至今尚未得到鉴定，肝素酶在生理、病理情况下表达的调控机制及其影响因素均不清楚，相信随着研究的深入，这些问题将会逐步被阐明。
　　三、肝素酶的生物学功能
　　附着于细胞表面或存在于细胞外基质中的HSPG，通过HS侧链与细胞外基质中的许多蛋白质、生长因子、细胞因子、酶等相互作用，并通过生长因子受体促进信号转导，从而影响许多细胞功能，如细胞粘附、分化和增生。已有较多资料表明，肝素酶参与许多正常生理活动，例如，通过辅助细胞滋养层细胞浸润及新生血管生成，促进胎盘形成；通过辅助脂蛋白脂酶释放，调节脂肪代谢过程；对于前B和B淋巴细胞离开骨髓并在外周淋巴器官中循环具有促进作用；由于HS具有抗凝作用，肝素酶还可能参与出凝血反应的调节过程；肝素酶在创伤愈合、组织修复中也有重要作用。　　肝素酶在免疫细胞中广泛存在，对于白细胞迁移，从而在炎症反应中发挥抗炎功能具有促进作用。在毛细血管，HSPG主要存在于内皮下基底膜，支撑着血管内皮，稳定毛细血管壁结构。因此，HS水解对于血细胞渗出血管起着决定性作用。水解HSPG的肝素酶则有助于免疫细胞穿出血管壁，到达炎症反应区。此外，肝素酶可能具有粘附因子功能，辅助T淋巴细胞与血管内皮细胞、细胞外基质粘附。如果肝素酶辅助自身免疫性T淋巴细胞穿出血管壁，将导致自身免疫性疾病发生，如自身免疫性脑脊髓炎。细胞外基质中的HS通常抑制动脉平滑肌增生，但是，在动脉粥样硬化斑块形成过程中，可能来自于浸润白细胞的肝素酶清除抑制性HS，于是平滑肌细胞增生、移行，随之动脉粥样硬化形成。
　　四、肝素酶与肿瘤转移密切相关
　　免疫组织化学研究表明，肝素酶在转移的恶性肿瘤细胞中普遍存在，而且在乳腺癌、结肠癌、肝癌等高转移性肿瘤细胞中，其表达水平往往很高。Hulett等［8］发现，在高转移的鼠腺癌细胞系中肝素酶mRNA高水平表达，而在低转移和不转移的细胞系中只有极少量表达。Vlodavsky等［5］测试其活性，发现高转移潜力的肿瘤细胞比低或无转移潜力的肿瘤细胞高达4～10倍。而该小组的转基因实验结果则更有说服力：将肝素酶cDNA分别转入无转移潜力的鼠淋巴瘤和低转移潜力的黑素瘤细胞系中，结果实验组细胞均获得了高转移潜力，经静脉接种体内，发现肺部瘤灶增加4～5倍。而将肝素酶 cDNA导入Eb细胞（无转移潜力的淋巴瘤细胞系），使其表达高水平的肝素酶 mRNA，然后种植小鼠体内，结果对照组与转染组发生肝转移的情况存在显著差异：大体标本和显微镜检查均发现转染组有明显转移灶，而对照组仅显微镜检查发现转移细胞存在于肝窦、肝门和肝血管腔内。比较其存活时间，对照组的所有小鼠存活均超过4周，而转染组的4周死亡率为50%，其中90%死于34 d内。　　肝素酶可通过降解HSPG，与蛋白水解酶协同作用，破坏、改变细胞外基质和基底膜结构，促进肿瘤细胞侵袭、转移。肝素酶还通过促进HS结合性生长因子或细胞因子释放，间接促进肿瘤细胞转移［1,5,8,15,16］。（1）HSPG不仅作为bFGF的辅受体，介导受体成为2聚体及信号转导，而且充当bFGF在细胞外基质中的储存池。肝素酶通过将具有高度活性的HS-bFGF复合体从储存在细胞外基质和肿瘤微环境中释放出来，促进肿瘤细胞、内皮细胞和成纤维细胞增生迁移，间接诱发肿瘤血管生成反应；（2）肝素酶促进释放尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物，二者使纤溶酶原激活，纤溶酶除具有活化MMPs作用外，还具有促进HS结合型活性bFGF释放的功能；（3）肝素酶可能促进释放组织特异性生长因子，参与肿瘤细胞转移的器官组织特异性选择。
　　五、肝素酶的临床应用前景
　　尽管肝素酶基因及蛋白结构直到最近才被了解，但由于早在10多年前人们就注意到它与肿瘤转移之间的密切关系，研究者一直在寻找肝素酶抑制剂，试图用来控制肿瘤转移。随着肝素酶检测手段的发展，寻找相应抑制剂的研究已初见成效。其中硫酸化寡聚糖复合物PI-88（sulfated oligosaccharide phosphomannopentaose sulfate）和硫酸海带多糖(laminarin sulfate)作为抗肿瘤药物颇有临床应用前景。实验表明，PI-88抑制大鼠高度浸润性腺癌的生长达50%、抑制淋巴道转移40%、抑制血道转移90%、降低肿瘤新生血管形成30%。目前PI-88已进入临床试验［17］。而硫酸海带多糖可有效抑制肝素酶活性和肿瘤转移，对于抑制肿瘤细胞增生和原发性肿瘤生长也有一定作用［18］。此外，由于肝素酶活性与白细胞迁移进入炎区有关，抑制肝素酶活性也可能成为治疗炎症性疾病的一个新策略。可以预料，随着肝素酶基因克隆成功，将会吸引更多人力、物力竞相参与寻找新型有效的抑制剂，用以抑制转移性肿瘤细胞及免疫系统活性细胞脱离循环，抵达靶器官的能力。这不仅对于恶性肿瘤的治疗将产生深刻影响，而且对于解决另一类医学难题，如风湿性关节炎、过敏性哮喘、系统性红斑狼疮以及同种移植排斥反应等也会带来新方法。　　肝素酶还可作为一项检测指标，用于肿瘤和自身免疫性疾病的早期诊断、病程评估、疗效观察和预后预测。有研究表明，肿瘤病人血中肝素酶活性高于正常人2倍以上。此外，在肿瘤转移病人尿液中可检测到肝素酶，而在正常人尿液中检测不到。这可能是肝素酶破坏了肾小球基底膜屏障，其选择通透性受到破坏而使肝素酶出现在尿液中的结果。
（本文编辑：齐文安）
作者单位：朱忠政（200438 上海第二军医大学东方肝胆外科医院）殷正丰（200438 上海第二军医大学东方肝胆外科医院）吴孟超（200438 上海第二军医大学东方肝胆外科医院）
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（收稿日期：）
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