细胞培养技术(细胞培养,染色体,配制,培养液)
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[细胞培养技术(细胞培养,染色体,配制,培养液)] 相关疾病：胚胎丢失妊娠感染癌症(cancer)绝经后骨质疏松肿瘤腹水染色体障碍智力障碍唐氏综合征一、细胞培养基本概念
　　细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
　　在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。 关键词:[染色体 细胞培养 配制 培养液 秋水仙素 无菌 吸管]…
一、细胞培养基本概念
　　细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
　　在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
二、细胞培养的环境
　　细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
　　1、无污染环境
　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
　　2、恒定的温度
　　维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
　　3、气体环境
　　气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。
　　细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。
　　4、细胞培养基
　　培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
　　（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
　　（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。
三、细胞培养设施和基本条件
　　1、实验室设计
　　细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
　　2、常用设施及设备
　　（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
　　（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
　　（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。
　　 （4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
　　（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
　　3、培养器皿
　　细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。
　　（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。
　　（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。
　　（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。
　　（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。
　　（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。
　　（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
四、培养细胞形态
　　体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
　　1、成纤维型细胞
　　在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
　　2、上皮型细胞
　　此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
　　3、游走型细胞
　　本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。
五、培养细胞形态分析
　　培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
六、培养用品的清洗与消毒
　　目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿，清洗的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。
　　（一） 清洗
　　在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
　　1、玻璃器皿的清洗
　　组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。
　　（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（5）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。
　　（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。
　　（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。 清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 63
B）次强清洗液 120 200 1000 （C）弱清洁液 100 100 100
　　清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。
　　（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。
　　2、胶塞的清洗
　　细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。
　　3、塑料制品的清洗
塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。
　　（二）消毒
　　细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。
消毒方法分为三类： （A） 物理灭菌法（紫外线、湿热、过渣等）。 （B） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）。 （C） 抗生素(antibiotic)。
　　（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。
　　紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射也进行实验操作。
　　（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。
常用物品消毒压力及时间：
　　培养液、橡胶制品、10磅10分钟；
　　布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。
　　上两种是最常见的物理消毒方法。
　　（3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。
　　（4）抗生素(antibiotic)消毒：确切应记成抗生素(antibiotic)灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。
七、绒毛染色体制备
　　绒毛来源于胚胎的中胚层，最早的初级干绒毛出现于孕三周初，孕8周左右是绒毛发育最旺盛时期。目前国内外绒毛取材多选于8-9周。研究资料表明，绒毛取样不影响胚胎的发育及胎盘的功能。但取样的失败可导致胚胎丢失而终止妊娠。
绒毛取样前者首先要检查阴道分泌物以判别阴道的洁净度，防止取样导致宫内感染。其次需做B超检查，一是确定胚胎大小，二是确定胚芽有无心血管搏动，三是确定胚芽在子宫内的位置，用以判别取材时间，是否取材及取样器进宫的角度及深度。
　　1、 实验材料
妇科阴道冲洗物品、绒毛取样器、5ml注射器、培养皿、小镊子、5ml离心管、甲酸、柠檬酸钠、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、载玻片等。
　　2、 培养液配制
秋水仙素10ug/ml 1ml
　　3、 操作过程
　　（1）1‰新洁而灭冲洗阴道，用卵圆钳固定子宫颈，根据妇查及B超提示选择角度及浓度探性插入绒毛取样器，当有弹性阻挡感且深度符合B超所示时，抽出取样器内芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此时，注射器内可见有血性液体流进；
　　（2）取一干净培养皿，内加PRNI 1640 5ml，内含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取样器，将所吸出物注入培养皿内，并用1640冲洗注射器及取样器，混匀。置培养箱30-40分钟；（3）挑选发育良好的绒毛放入另一小培养皿中，用预温37℃的0.075M。KCL与10%柠檬酸钠1∶1混合液漂洗两次。（4）用眼科小剪剪碎绒毛，再将2滴秋碱加入上途漂洗低渗液低渗30分钟；（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，预固定，1000rpm8分钟，弃上清液；（6）加新鲜配制的3∶2固定液3ml；固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；（8）离心后，加所余体积的60%冰乙酸，打匀，2分钟后加等量甲醇，打匀，2000rpm8分钟，弃上清液。（9）3m1 3∶1甲冰固定液过夜，冰水制片；（10）80℃考片2小时，自然冷却。（11）G分带处理，观片。
八、羊水细胞培养
　　羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞，可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。目前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术，妊娠12-30周的羊水细胞均可培养成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析，最佳孕周为16周左右。因此时羊水增长快，羊水中细胞较多，细胞培养易于生长，而且不易损伤胎儿。国内多数选择的穿刺时间在妊娠的第16-30周。国外现已较多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠时间大致计算（1ml/w）。资料表明，穿刺病例的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。
　　1、实验材料
2,5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。
　　2、培养液配制
　　F-12 85%
　　小牛血清 15%
　　双抗 100u/ml
　　小瓶贮藏 4-8℃
　　3、操作过程
　　A（盖玻片培养法）
　　（1）采样：选择妊娠13-14周妇女，在无菌条件下抽取羊水5ml，立即注入无菌离心管中；（2）收集：离心分离细胞，1000rpm10分钟，去上清，留0.5ml，轻打混匀；（3）接种：30mm培养皿中放盖玻片1张，每片滴混匀的细胞液1-2滴，置培养箱内培养30-60分钟；（4）培养：取出后从盖玻片外加培养液2ml，静置培养48小时后观察细胞生殖状况并定时换液，5-10天后，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；（5）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小时；（6）低渗：倒掉培养液，加预温37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃温育30分钟，镜下可见胀大的羊水细胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液预固定；（7）固定：倒掉低渗液，加5ml固定液固定30分钟以上，反复3次；（8）干燥：将附有细胞的盖玻片斜放于培养皿中，置80℃烤箱处理2-3小时；（9）胶片：将附有细胞的盖玻片用树脂胶封固于玻片上，正面朝外，小心细胞破坏；
　　B（常规培养法）
（1）—（2）相同于盖玻片培养法；（3）接种：将混匀的羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内，平均10ml羊水细胞收集的细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。（4）培养：酒精灯火先封口，静置培养48小时后观察细胞贴臂及生长情况，5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长；（5）终止培养：同A法；（6）细胞收集：将培养液倒入一干净离心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，轻轻摇动，使培养瓶底面完全接触消化酶，然后用弯头吸管吹打，待细胞全部脱落后加前培养液终止胰蛋白酶消化。用吸管移细胞悬液于离心管中。rpm10分钟，弃上清，留细胞沉虑。若一次消化不彻底，可反复消化；（7）低渗及预固定：加预温37℃KCL溶液10ml，37℃温育30分钟，加0.5-1ml新鲜配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定，用气泡吹打细胞使其混匀。（8）固定：用新鲜配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分钟。固定液加入时沿管壁缓慢加入；（9）制片及干燥：用绒毛制片；
（10）分带处理。
九、入外周血淋巴细胞培养
　　在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。
　　1、实验材料
　　2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
　　2、培养液配制
　　无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：
　　RPMI %
　　小牛血清 10%
　　PHA（自制） 0.1ml 3%
　　肝素 10u/ml 2%
　　双抗 100u/ml（选择）
　　分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
　　3、操作过程
　　（1）采样接种：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；（2）培养：置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以促进细胞生长增殖；（3）抑止分裂：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。（4）终止培养：从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml尖底离心管中，尽量收集培养细胞。2000rpm8分钟。（5）低渗处理：弃上清液，加入预温37℃的0.075MKCL8ml，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（6）预固定：取出低渗中尖底离心管，轻轻加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。800-1000rpm8-10分钟；（7）固定：弃上清液。加入新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。rpm10分钟，反复2-3次；（8）制片：使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。留离心后沉淀细胞，加新鲜配制的固定液，制成细胞悬液，取1-2滴滴片，用于轻轻吹开。刻号后清理刻号污物，置80℃烤片2小时；（9）收片：待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。
十、植物油凝素的制备
　　植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。
　　（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
　　 （B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。
十一、组织培养细胞染色体制备
　　组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤(malignant tumor)细胞株，且呈贴壁生长，仅小数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂(cell division)率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以积水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。
　　1、 实验材料
　　培养液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度离心管，直吸管及弯头吸管，培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。
　　2、 培养液配制
　　培养液 85-95%
　　小牛血清 5-15%
　　双抗（选择） 100u/ml
　　3、 操作过程
（1）培养细胞：选择处于指数生长期、用大瓶培养的80-90%汇合单层培养细胞；
（2）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液，置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期；（3）聚集细胞：
　　（A） 摇动法：
　　可利用分裂中期细胞变圆与底物附着不牢特点，此时可持培养瓶，左右反复横向水平摇动，可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；
　　（B） 消化法：
　　将培养液倒入离心管内，给培养瓶内加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右摇动，便培养瓶底壁面完全接触消化酶，稍后用弯头吸管吹打，待细胞完全脱落后，加入3-5ml前培养终止消化。用吸管移入装有培养液的离心管内2000rpm10分钟。弃上清液，留沉淀细胞；
（4）低渗处理：给沉淀细胞加顶温的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均匀，在温箱中静置20-30分钟；
（5）预固定：向低渗处理适当的离心管中加新鲜配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管轻松吹打调匀，此措施能起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
（6）固定：800-1000rpm10分钟，弃上清液加新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入时要沿管壁慢慢加入，后轻轻吹打，封口后室温静置30分钟以上，反复三次；
（7）制片：末次离心后，倒掉上清液，留沉淀细胞，加新鲜配制固定液0.5ml左右，混匀后冰片制片，其它同外周血方法。
十二、胸腹水细胞染色体制备
　　在恶性肿瘤(malignant tumor)的胸腹水中有大量的分裂期细胞，其中多以非整倍体细胞存在，并含有各种标记染色体。
　　1、 实验材料
　　2.5%碘精、75%酒精、无菌棉球、镊子20-22号无菌腰穿包、50ml离心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片等。
　　2、 操作过程
（1）采样：选择有胸或腹水患者，在无菌条件下，轻腹穿刺或于手术取胸或腹水20-50ml；
（2）培养：立即加入秋水仙素培养，最终浓度为0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培养箱内4-6小时；
（3）低渗及后期制作羊水细胞。
十三、染色体制备体会
　　1、 培养基PH浓度、小牛血清量及培养箱温度的恒定是培养成功关键；
2、秋水仙素适量、适宜的处理时机和时间，是获得良好、足够分裂相的条件。分裂相的多少和染色体形态及带型处理良好与否均受其影响。3、低渗处理是获得分散良好的分裂相关键步骤，低渗过度或不足都会造成染色体形态不良的结果。在低渗处理时期细胞十分娇嫩，并且表面发粘，低渗细胞混匀时，吹打要适宜，避免细胞破碎及粘团，另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部，避免细胞丢失。 4、固定技术是制备良好分散的染色体的重要步骤。若染色体分数不良，可适当加大冰乙酸含量，其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷，但过量会造成染色体形态变化和影响分带结局。染色体形态不良与固定液速度有关，加第1次固定液过快或打过快，可造成飘带样染色体； 5、固定液每次使用必须新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定效果。6、滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步。首先要载玻片要非常干净，否则会影响染色体的分散和分带效果。其次是滴片的距离、滴加量多少、制片的方式都会影响染色体分期效果。 7、烤片：是染色体制备中最后一步技术。烤片的温度、时间与染色体形态和分带有关。不宜温度过高和烤片时间过长。
十四、染色体实验技术分析
染然体分裂指数低：患者处于非常时期（感染期、放、化疗期）：
培养基营养成份不良；
培养基PH偏低或偏高；
PHA过量或不足；
小牛血清质量不高；
小牛血清数量偏低或过高；
培养温度不稳定； 培养箱温度偏低；
秋水仙素处理时间过短；
离心时间或速度不足；
制备过程损失过大。
染色体形态不理想：受检者处于非常时期；
小牛血清质量不高；
培养箱温度不恒温；
秋水仙素量不当；
低渗时间不理想；
低渗温度过高；
离心速度过高；
固定液加速过快；
固定混匀手法过重；
吹片技术不良。
染色体形态偏长： 培养基PH偏酸；
秋水仙素量偏低；
秋水仙素处理时间偏短；
染色体形态偏短： 培养基PH偏碱；
秋水仙纱处理量过量；
秋水仙素处理时间过长。
染色体分带不良： 血液状况不良；
培养基营养成分不良；
小牛血清质量不高；
小牛血清数量不当；
培养箱培养温度不良；
秋水仙素处理量过高；
PHA量过高；
低渗处理时间或温度不良；
胰酶质量不良；
染色液质量不良；
染色技术不良；
分带技术不佳。
染色背景不良： 培养细胞生长不良；
低渗处理技术不良；
离心过程尘染；
分带技术不良；
染色技术不良；
染色液尘染；
载玻片处理不干净； 制片过程尘染；
存片环境不干净。
培养失败： 培养中损失；
血源质量不良；
培养中感染；
小牛血清污染；
培养箱温度失控；
PHA过期或过量；
秋水仙素失效；
低渗失败；
离心机失误。
标本损失： 培养中损失；
制备中损失；
分带中损失；
保存中损失；
十五、染色体分带技术
染色体显带技术是在显示染色体基础上发展起来的技术，其优点是能显现染色体本身更细微的结构，有助于更准确地识别每条染色体及染色体异常疾病。染色体分带技术能适用于各种细胞染色体标本。
染色体显带是沿着整条染色体的长轴，能显现出着色深浅不同、横向走的带型。目前认为染色体显带现象是染色体结构所致。但用特殊方法处理后，再用染料染色，则带型更加清晰，随显带方法不同，显现出的带型的特点也不一样，这说明带的出现与染料的特异结合相关。人类染色体能显现出近2000个G带，这些带再融合成一般显微镜下可见的850条左右的高分辩染色体带型或350条带左右的常规带型。
常见的几咱显带方法：
（一）、G带
也称为G显带，是最常用的显带方法，具有操作简便、经济及标本能长期保存等优点。
1、Giemsa原液的配制：
（1）称3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少许丙三醇研磨，研磨越细越好；
（2）将研细的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶内，丙三醇的总量为250ml，用一定量甲醇洗干净研磨器。
（3）摇匀，置60℃水浴锅24小时或37℃温箱72小时，经常摇动。
（4）取出冷却后，加甲醇总量至250ml混匀，密封棕色瓶备用。贮藏时间越长，染色效果越好。
2、实验材料：
中期染色体标本；
0.9%氯化钠注射水；
3%tris液体；
0.25%胰蛋白酶；
Gremsa染色液；
立式染缸；
定时器或时针；
镊子及纱布；
3、操作程序：
（1）消化液配制：取0.9%氯化钠注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶盐水消化液，加4-5滴tris液调PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴锅中备用；
（2）染液配制：取立式染缸，加蒸馏水500ml，加3滴tris液调PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管调匀备用； （3）漂洗液：取立式染缸一个，内加蒸馏水备用；
（4）试消化：待消化液温度在37℃左右时，取同批标本较多者标本1张，分二节或三节进行消化，每节相差十五秒左右，从45秒或60秒开始增减。取出后先在纱布或吸水纸上直立除去带出胰蛋白酶，后置蒸馏水染缸内漂洗，取出后，标本斜面朝上，刮去染色缸内染液上浮膜，沿槽插入，每分钟移动1次，染色3-5分钟。
（5）洗片：从染色缸中取出标本玻片，自来水冲洗，取刻编号面朝上用纱布干净玻片背部染色，稍干，高倍镜下观片，确定分带与染色时间。
（6）分带：取4张待分带标本玻片，细胞面朝左侧按顺序插入37℃的消化液中，消化时间较试消化选择时间延长5-10秒钟，取出每片间隔时间约10秒钟左右。
（7）消化及染色调整：每次消化完一批标本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化时间不变。同样，每次染色一批标本后加Giemsa染色液2-3滴，调匀，每次染色时间不变；
（8）Giemsa染色调整：若Giemsa染色标本偏红，说明染色液偏酸，可加tris数滴调蓝，若Gremsa染色标本偏蓝则说明tris加多了；
（9）保存：将分好带的及观察中的标本及时收集于玻片盒内保存，防止细胞涂面灰尘污染及擦损。
注意：Giemsa消化染色过程中，有两个重要的环节，一是胰酶消化环节，消化不足带不出现，消化过度染色体变得膨胀和不着色，必须把握好胰酶浓度、消化时间和消化温度；二是预处理或老化环节，对消化和带型清晰度有很大影响，其中80℃2小时热处理，是简便易行和效果较好的办法。
（二）姐妹染色单体分化染色
姐妹染色单体差别染色可使中期染色体显示深浅不同的两条单体，能借以观察姐妹染色单体互换（SCE）现象。SCE是两条染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互换而表现出来一种现象。即是细胞分裂(cell division)是DNA同源重组的结果。SCE既是一种无害的变化（有生理波动），也可受射线、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映细胞的损伤与修复状态。
在细胞培养过程中，加入一定是的5-溴脱氧尿苷（BudR ）,当细胞在DNA复制过程时，BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此，当细胞处于第二个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BudR的DNA链构成，而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低，故对染色剂亲合力低，在用Giemsa染色时其单体着色浅，只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。
2、BudR贮存液的配制：
BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
然后加蒸馏水至 5ml
即成1000ug/ml的贮存液，因BudR遇光会发生分解，贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。
3、实验材料：
所检培养细胞；
BudR贮存液；
2×SSC液；
常规染色体制片所需物品；
20W紫外灯一个；
4、操作程序
（1）BudR掺入：细胞培养24小时后于培养液中加入BudR，最终浓度5-15mg/ml，避光条件下继续培养。
（2）终止培养：待细胞经历两个细胞周期（48小时），培养终止前3小时加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02ug/ml培养液；
（3）常规制片及烤片；
（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿，移入50-60℃水浴锅内，紫外线灯距离5cm，照射30-40分钟；
（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟；
（6）洗片及存片：同G带片
注意：BudR是一种强突变剂，使用浓度不宜过高，否则会产生细胞毒性作用。
（三）染色体脆性部位（fra）
脆性位点也称危性部位，是在一定的培养条件下人类染色体上某些特异位点非随机地表现出的裂隙和断裂。脆性部位分为普通型和罕见型两大类。
1、实验材料
（1）常规外周血所用物品。
（2）培养基是用不含叶酸的MEM-Fra培养基或低叶酸的CT199培养基。
2、培养液配制
MEM-Fra 90-95%
小牛血清 5-10%
双抗 100u/ml
PH调至7.5左右
3、操作程序
与制备外周血的染色体方法相同。
注：脆性X综合症：（FraX）
这种染色体改变是在1969年被发现，1977年被定位于Xq27、记录为fra（X）（q），并命名为脆性部位。X连锁智力低下（MR）与fra（X）（q27）密切相关。FraX的发生率占新生儿的1/2500；占X连锁MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其发生率仅次于先天愚型。
消毒与灭菌
一、消毒与灭菌的概念
　　在延期界中，微生物无处不有，无孔不入，如制种所用的原料、水、工具、设备、操作的双手和衣着以及空间，都有大量的微生物存在。因此要分离和培养食用菌纯种，首先必须将培养基进行灭菌达到灭菌状态，并对生产过程的各个环节以及环境也必须进行消毒，昼减少其它微生物的存活而造成生产的污染，因此消毒灭菌是菌种生产过程中必须掌握的最主要关键技术之一。
（一）消毒　具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。就食用菌菌种生产而言，消毒是指用物理或化学方法杀灭或消除对食用菌生长发育有害的微生物，通常只能消灭物体表面或环境中的一部分微生物，有能达到消灭所有微生物。
（二）灭菌　指彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽胞和孢子，使物体成为无菌状态。
二、常用消毒和灭菌方法
（一）物理灭菌方法　通过高潮、射线、微波以及器械进行灭菌或除菌的方法均为物理灭菌方法。
１、热力灭菌　利用高潮杀死微生物的方法，称为热力灭菌。微生物组成的最重要成份是蛋白质、核酸等，当高潮时会引起蛋白质和核酸不可逆的变性或凝固，使细胞失去了生理机能，停止生长发育，直至生化瓜停止而终止生命。此外高温尚可破坏细胞的　其他组成，或者使细胞的脂肪膜受热溶解而形成了极大的孔，导致细胞内含物泄漏而引起死亡，从而达到高潮灭菌的效果。
　　热力灭菌经常使用两个杀菌指数：热死温度和热死速度。前者指在１０分钟内可以杀死细菌悬液中所有细胞的温度，后者指在一定温度下，杀死所有细胞所需的时间。在同样温度条件下，热死温度高的微生物，其热死速度慢，热死温度低的微生物，其热死速度快。提高灭菌温度，可以加快热死速度。因此，可以通过提高灭菌温度来缩短灭菌时间，或延长灭菌时间以降低灭菌温度。
　　热力灭菌经济有效，简便易行，是最普遍采用的方法，它可以分为湿热灭菌和干热灭菌两种。
（１）湿热灭菌　指利用热蒸汽杀死微生物。由于蒸汽的穿透力较热空气强，蛋白质、原生质胶体在湿热条件下容易变性凝固，酶系统容易被破坏，蒸汽进入细胞内凝结成水，能放出潜在热量而提高温度，更增强了杀菌力。常用湿热灭菌方法圾如下几种。
A.高压蒸汽灭菌法 利用高温高压蒸汽进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌可以杀死一切微生物，包括细菌的芽孢，真菌的孢子或休眠体等耐高温的个体。灭菌的蒸汽温度随蒸汽压力增加而升高，增加蒸汽压力，灭菌的时间可以大大缩短。因此它是一种最有效的、使用最广泛的灭菌方法。蒸汽压力与蒸汽温度的关系见下表。
压 力 温 度 压 力 温 度 压 力 温 度
磅/英寸2 Kg/cm2 (℃) 磅/英寸2 Kg/cm2 (℃) 磅/英寸2 Kg/cm2 (℃)
1 0.070 102.3 9 0.633 114.3 17 1.195 123.3
2 0.141 104.2 10 0.703 115.6 18 1.266 124.3
3 0.211 105.7 11 0.774 116.8 20 1.406 127.2
4 0.281 107.3 12 0.844 118.0 22 1.547 128.1
5 0.352 108.8 13 0.914 119.1 24 1.687 129.3
6 0.422 109.3 14 0.984 120.2 26 1.696 131.5
7 0.492 111.7 15 1.055 121.3 28 1.82 133.1
8 0.563 113.0 16 1.12 122.4 30 2.109 134.6
　　高压灭菌所采用的蒸汽压力与灭菌时间，应根据具体灭菌物质而定。液体培养基灭菌时，一般采用1.0Kg/cm2,温度121.30℃,灭菌30分钟;母种、栽培种等固体培养基灭菌时，通常采用1.5Kg/cm2,温度129℃,灭菌1-2.5小时。 但有些固体培养基导热性差，培养基中耐热性微生物又较多，如制备蘑菇栽培种的河泥烘料培养基，灭菌时间或灭菌压力要有所增加，通常压力为2Kg/cm2,灭菌时间为4小时。
　　使用高压蒸汽灭菌时，应注意以下几点：
　　ａ、灭菌锅内的冷气必须排尽。冷空气的热膨胀系数大，若无菌锅内留有冷空气，当灭菌锅密闭加热时，冷空气受热很快膨胀，使压力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，锅内温度低于蒸汽压表示的相应的温度，致使灭菌有能彻底。特别是使用只装有压力表，没有温度表的灭菌锅时，尤应注意。
　　排除冷空气的方法有两种：缓慢排气和集中排气。缓慢排气法，即开始加热灭菌时便打开排气阀门，随灭菌锅内温度逐渐上升，锅内的冷空气便逐渐排出，当锅内温度上升到100℃,大量蒸汽从排气阀中排出时，即可关闭排气阀，进行升压灭菌。集中排气法，即在开始加热灭菌时，先关闭排气阀，当压力升到0.5Kg/cm2左右时，打开排气阀，集中排出空气，让压力降到零，并有大量蒸汽排出时，再关闭排气阀进行升压灭菌。固体培养基灭菌时可采用集中排气法。液体培养基灭菌时一般不宜采用，以免液体冲出瓶口
　　ｂ、灭菌锅内的培养基必须排列疏松，使蒸汽畅通。灭菌锅内蒸汽是否畅通，关系到灭菌温度是否均一。灭菌材料若放得过多、过密，会妨碍蒸汽的流通，影响温度分布的均一，造成局部地区温度较低，甚至形成温度“死角”，达不到彻底灭菌，常常导致以手杂菌污染。
　　ｃ、灭菌完毕，应缓慢减压。高压蒸汽灭菌结束后的排汽降压不能太快，若排汽太快，瓶内外的压力差　就会增大，引起瓶塞冲出瓶口；液体培养基灭菌时，液体会突然沸腾，弄脏瓶塞；塑料袋装培养料灭菌时，应让其自然冷却，当压力下降到0.5Kg/cm2左右时，再打开排气阀放气，以免在减压过程中，袋内外产生压力差，把塑料袋击穿，导致以后杂菌污染。
　　ｄ、注意棉塞防湿。用棉塞塞的瓶子或试管，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌时，因锅中热蒸汽在锅壁四周和锅盖内侧容易产生凝结水，凝结水沿着锅壁和锅盖下流，弄湿棉塞。潮湿的棉塞在培养过程中，容易生长链孢霉等霉菌，污染培养物。为了防止棉塞潮湿，灭菌时，瓶子的棉塞不能接触灭菌锅壁，瓶子上面就盖铝帽或防水油纸，以免锅盖下面的水流到棉塞上。灭菌结束时，应先排放锅内热水，然后再慢慢排放蒸汽降压。若棉塞潮湿，可在锅中烘烤一定时间再取出来。
B.常压蒸汽灭菌法　采用自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。阿诺氏(Arnold)流通蒸汽灭菌器是微生物技术中常用的设备。我国食用菌菌种生产过程中，有的利用蒸笼灭菌，有的利用钢筋水泥砌成大型的流通蒸汽灭菌灶，一次可灭菌几千瓶母种或栽培种培养料。
　　利用常压蒸汽灭菌时，灭菌物品在灭菌锅内排列不能过密，要保证蒸汽能在锅内均匀地流通。流通蒸汽的温度一般为100℃左右，要杀死耐热性的芽胞， 必须延长灭菌时间，一般为6-8小时。这种专用流通蒸汽灭菌灶的最大优点是：容量大， 结构简单，成本低廉，可自行建造。缺点是灭菌时间长，能源消耗量大，稍不注意就有灭菌不彻底的现象发生。
C.间歇灭菌法　指间歇一定时间，连续消毒几次达到灭菌的方法。此方法运用于不耐高温的(100℃左右)培养基的灭菌。欲杀死培养基的芽胞， 可将其在流通蒸汽中消毒20-30分钟,先杀死其中的营养体细胞,然后将培养基在室温或温箱中培养,使芽孢发芽长成营养体,再用流通蒸汽消毒20-30分钟,杀死新长成的营养体细胞,这样连续3次,即可杀死培养基中的全部芽孢,达到无菌状态。
（２）干热灭菌　采用灼烧或干热空气灭菌，称为干热灭菌。虽然干燥主热空气的穿透力不如湿热蒸汽强，但它使用方便，适用于玻璃器皿和瓷器等物的灭菌，故广泛应用于实验室和生产实践。干热灭菌主要有两种类型。
A.火焰灭菌法 即通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法。耐热的接种环、接种铲、接种匙、接种针等，通过火焰灼烧，可彻底灭菌，试管口和玻璃瓶口，通过几次火焰，温度可达200℃以上，一切微生物和芽孢，可全部杀死，达到无菌程度。
　　B.干热灭菌法　即利用加热的高温空气进行灭菌的方法。干热烤箱是干热灭菌的常用，它是通过电热丝进行加温和调温的，不仅可以用来灭菌，也可用于器皿等材料的烘干。干热灭菌适用于固体材料灭菌，不适用于液体材料灭菌。由于干热空气穿透力　差，加之微蛋白质在干燥条件下，不易凝固变质，故干热灭菌温度，一般要求掌握在160℃,维持2小时。但要注意，如果干热灭菌温度超过170℃,包装灭菌用品的纸张或棉花布类,会被热空气烤焦，甚至有着火燃烧的危险。
２、辐射灭菌　利用辐射产生的能量进行杀菌的方法，称之辐射灭菌。生产上应用辐射灭菌方法主要是指此外线灭菌。
　　紫外线灭菌　紫外线是非电离辐射，波长为136-400纳米，以波长265-266纳米的杀菌为最强。微细胞中的核酸碱基对紫外线吸收能力特强，辐射后引起核酸的突变，从而抑制DNA的复制而致死；与此同时， 空气在的一部分氧在紫外线照射下产生臭氧，也具有很强的杀菌作用。另外，紫外线照射微生物细胞后，在有氧的情况下，产生光化学氧化反应，生成过氧化氢(H2O2),能发生强烈氧化作用， 引起细胞死亡而达到杀菌目的。由于紫外线穿透物质的能力很差，一层普通玻璃或水，均能滤去大量的紫外线，所以只适用于空气和物体表面的灭菌，一般要求紫外灯距离照射物不超过1.0米为宜，接种室和接种箱常用紫外灯作为空气和桌面的消毒。
３、过滤除菌　是利用机械的阻留方法来除去介质中的微生物。在菌种生产上应用的设备主要有超净工作台和空气自净器，它们均恬于空气过滤除菌，超净工作台主要是使操作台面达到局部灭菌，而空气自净器是使接种室的空气经过过滤达到整个空间的无菌状态。
（二）化学灭菌方法
　　利用化学药品灭菌或创造一个无菌环境，也是非常重要的灭菌手段。许多公演药品可使菌体蛋白质变性，有的可阻碍微生物的某一代谢环节。因此，化学药品可超到杀菌作用或抑菌作用。直接加入培养基能起灭菌作用，又不影响培养基成分的化学药品并不多，根据报道β－丙烷内酯(BPL)和焦碳酸二乙酯(PKE)具有这种作用，但应用甚少。有的具有杀菌和抑菌作用，但加入培养基后阻碍了香菇菌丝体生长发育，也不能被采用。香菇生产中常用的化学药品及具体使用方法如下。
１、甲醛的杀菌机理是具有强还原作用。甲醛与微生物蛋白质（含蛋白酶）的氨基结合，使蛋白质变性。其反应式为：蛋白－氨基＋甲醛（气体）→蛋白－氨基、甲醛。甲醛溶液杀菌力比石碳酸强，1:200的甲醛溶液在6-12 小时内可杀死所有的细菌芽孢;并对真菌孢子及营养体均有极强的杀伤力,不受有机物质的影响。因为它具有腐蚀性,刺激性大,不宜人体使用。常用福尔马林消毒空罐、无菌室或无菌箱等。
　　使用方法有加热熏蒸法，即利用福尔马林沸点96!0的特点，将福尔马林置于玻璃、陶瓷或金属容器中，用酒精灯或电炉加热，药液蒸发完，立即撤去热源。
　　加高锰酸钾氧化剂熏蒸法，即甲醛是还原剂，故与氧化剂反应可产生大量热。这种热又将蓁甲醛挥发。具体做法是在坩锅内（或用培养皿），按每立方米体积加10毫升福尔马林与1.5克高锰酸钾的比例计量,任其甲醛挥发, 关好门窗闷一夜或更长时间,能够达到良好的熏蒸灭菌目的。熏蒸后，室内不断散发刺激鼻眼的臭味。 有必要驱除室内甲醛气味时，可向室内喷洒氨水，氨水浓度为25-28%, 喷的雾滴越小越好,喷氨水的量为熏蒸甲醛的一半,约30分钟左右,氨水与空气中残存甲醛结合,形成白色无臭粉末。如无氨水，可用氯化铵或硫酸铵加石灰水产生氨气来中和甲醛。铵盐用量每立方米空间为5-6克。
２、硫磺及其熏蒸灭菌方法　商品硫磺为有光泽的淡黄色粉末（或碎块），不溶于水，熔点为363℃,燃烧后生成二氧化硫。二氧化硫为无色气体，有刺激味，渗透力强，易溶于水，生成亚硫酸，有助于提高灭菌率，同时可杀虫、杀螨。
　　使用方法是按每立方米空间15-20克计量,将硫磺放置在离地面较高的瓷或金属容器中，点燃硫磺产生二氧化硫，二氧化硫的密度比空气大，很容易下沉，所以一定要注意将装硫磺的容器放在空间较高的位置。为提高灭菌效果，在熏蒸前，应先向空间及墙壁上喷少量水雾，有助于增加二氧化硫与生成亚硫酸，从而提高熏蒸灭菌效果。
　　硫磺点燃后，对人体呼吸道粘膜、眼结膜有刺激性，应注意防护。二氧化硫对纤维及金属物品有腐蚀作用，因此，熏蒸房屋时应撤出易腐蚀物品。
　　除熏蒸与内吸外，其他化学灭菌方法均可归纳为表面灭菌。它们对微生物的毒害作用主要是迅速使细胞表面蛋白质、核酸及有关酶类被破坏。
３、乙醇类　乙醇又称为酒精。70-80%乙醇的杀菌能力较强。高浓度乙醇杀菌能力反而降低，因为95-100%的乙醇具有很强的脱水作用,当遇到微生物细胞时, 细胞表面很快脱水形成一层保护膜,乙醇分子再不易渗透保护膜起到杀菌作用。 如乙醇中加入稀酸或稀碱，杀菌效力增强。在70%乙醇中加1%硫酸或氢氧化钠,可在1-2 天内杀死枯草杆菌芽孢。乙醇只会杀死细菌营养体，在香菇生产中，多用于接种时手的皮肤及器械杀菌。使用时，对表面干燥的物品，用70-75%的乙醇擦拭；对于表面略湿润的物品多采用85%乙醇消毒。乙醇能降低酚、甲醛等杀菌能力， 但能增强硫横及升汞的杀菌效力。
４、酚及其衍生物　常用的是石碳酸，又名苯酚，纯品为无色或白色针状、块状或三棱形晶体，溶于水，具特殊气味。浓石碳酸能使皮肤变白、手指麻痹并可损坏皮肤与粘膜，对人畜有毒。0.5-1%的石碳酸水溶液作为喷雾剂处理无菌室(箱), 能起到降尘除菌、空气消毒的作用；也可用3-5%的石碳酸水溶液对器械浸泡消毒。在5%石碳酸水溶液中若加入0.85-0.9%的食盐则可增加石碳酸药效,如有乙醇存在时, 则药效大减。
　　石碳酸杀菌原理是使细菌蛋白(bacterial protein)质变性，也具有表面活性剂作用，破坏细胞膜的透性，可合细胞内含物外溢。石碳酸水溶液浓度大时是致死因子；反之，则起抑菌作用。
　　甲酚是酚的衍生物，又名来苏尔（煤皂酚），是用肥皂乳化的甲酚，杀菌效力比苯酚大４倍，常用3-5%的溶液消毒皮肤、桌面及用具。
５、石灰与碱类　石灰分为生石灰(CaO)与熟石灰(Ca(OH)2)两种。起杀菌作用的是熟石灰中的氢氧根离子，能水解蛋白质和核酸，使微生物的酶系和结构受到损害，并能分解菌体中的糖类。
　　使用生石灰时应加水，或生石灰遇到潮湿的物体，均会生成熟石灰，其化学反应式为：CaO+H2O→Ca(OH)2+热量。如果熟石灰长时间曝露在空气中， 可能使熟石灰吸收空气中的二氧化碳而生成有能杀菌的碳酸钙，反应式为：Ca( OH) 2+ CO2→CaCO3+H2O
从反应式中可清楚地看到，如想灭菌只能用生石灰使其与水反应生成熟石灰而杀菌。一般1-3%石灰水就可起很好的杀菌作用。如用0.5%石灰水浸泡稻草２小时或更长时间，也可起到杀菌与软化纤维的作用。菌筒或菌砖上发现霉菌污染时，也可将生石灰直接撒到污染菌面上，杀菌效果良好。
６、氧化剂与还原剂　高锰酸钾、过氧化氢、卤素（氯、溴、碘）及某些化合物（或络合物），如漂白粉等均为氧化剂，可以杀菌。亚硫酸及亚硫酸盐等均为还原剂，能通过氧化还原反应起到杀菌作用。
（１）高锰酸钾　强氧化剂，1:0的浓度都具有杀菌作用。0.5-1%的高锰酸钾水溶液于５分钟内可杀死大多数细菌；５％水溶液于１小时内可杀死细菌芽孢。高锰酸钾在酸性溶液中杀菌作用增高，如用１％高锰酸钾和１％盐酸溶液能在30分钟内破坏炭疽芽孢。高锰酸钾遇有机物时被还原成无杀菌作用的二氧化锰。因此，有能用于直接拌料灭菌。高锰酸钾对霉菌杀伤效果很差。
　　高锰酸钾只局限于对皮肤、粘膜及玻璃器皿消毒用，绝不能用于香菇生产原料（木屑等纤维材料）的直接拌料灭菌。
（２）碘及其化合物（络合物）　3-7%碘溶于70-83%的乙醇中所配制的碘酊, 是皮肤及小伤口的有效消毒剂。5%与10%碘化钾水溶液也是皮肤有效的消毒剂。 有机碘化物如碘福具有良好杀菌作用，有仅能杀死一般的细菌和真菌，并可使病毒灭活。
（３）漂白粉及其使用方法　漂白粉（氯石灰）是白色粒状粉末，能溶于水，易生成沉淀。高效漂白粉的有效氯含量为40-80%。漂白粉的使用浓度为５％，通常按每立方米空间用１克高效漂白粉计量。使用时将１克高效漂白粉溶于１升水中，静放１小时左右，取其上清液喷雾灭菌。
　　漂白粉的杀菌原理是漂白粉溶于水后，生成次氯酸和次氯酸盐等，并能释放氧，使细菌蛋白(bacterial protein)质或酶发生氧化；同时，释放出的氯还能取代蛋白质氨基中的氢离子使蛋白质变性，从而杀灭微生物。
７、重金属类　一些重金属及其化合物，可使微生物的蛋白合成受破坏，亦可导致酶失活及取代细胞结构上的主要元素，使微生物生长受掏或导致死亡。
　　常用的表面消毒剂是二氯化示，又名升汞。1:500-1:2000的升汞溶液对多数细菌有匀菌作用。由于升汞对金属器皿有腐蚀作用，对人畜有剧毒，目前又合成了对人体低毒的硫柳汞、袂塔酚(metaphen)等。
　　在香菇生产中常用的硫酸铜也是防治真菌的良好消毒剂，使用浓度低于２％，喷洒物体表面，主要防治青霉类真菌。如将硫酸铜、石灰、水，按1:1:100 的比例所配制成的波尔多深夜，是菇房、床面等的良好表面消毒剂。
８、表面活性剂　具有降低表面张力的物质称为表面活性剂。常用的肥皂与十二烷基磺酸钠类（如洗衣粉）的杀菌能力相当于石碳酸的2-3倍。
　　市售的新洁尔灭是季胺盐类的表面活性剂。化学名称为十二烷基溴化胺，淡黄色，有香味的胶状体。一般可将原液(5%)稀释一倍，把器械或手、以及不能遇热的器具进行消毒。对细菌、病毒有较好的杀灭能力，但对真菌杀灭效果不好。经常使用新洁尔灭会使皮肤干裂，同时对粘膜有刺激性，对铝制品有腐蚀性，对橡胶没有消毒作用。因此，不能用新洁尔灭消毒胶塞进行担子菌菌种保藏。
　　表面活性剂的杀菌机理是改变细胞透性，使菌全破裂；聚集在菌体表面时，影响细胞代谢，破坏细胞蛋白与酶的活性。
９、气雾消毒盒
三、消毒与灭菌效果的检查
　　消毒与灭菌效果好坏，直接关系到菌种成品率的高低。因此，除了要严格把好消毒、灭菌关外，同时还要严格执行检验制度，两者缺一不可。
（一）培养基灭菌效果检验
１、母种培养基经灭菌后，从高压灭菌锅中不同部位随机抽取５支，放置28±2℃恒温箱中培养5-7天,如无霉菌、细菌、酵母等杂菌出现，则认为灭菌彻底。
２、原种及栽培种培养基经灭菌后，从灭菌锅中上、中、下三层进行取样，每层对角线随机取样５瓶（袋），放置28-30℃恒温培养箱中培养5-7天，检查是否有霉菌菌落生成。如检查是否有细菌没有杀死，必须使用细菌培养基进行检测。细菌培养基：称取牛肉浸膏(或牛肉汁)10克,蛋白胨10克,NaCl15克,琼脂粉14 克, 加蒸馏水1000ml,经加热溶解后,装入中,在121℃条件下灭菌15分钟,随后排成斜面试管。上述抽取的样品，分别在无菌下取出少量培养基接入细菌培养基，然后在37℃培养24小时，检查结果没有细菌菌落产生，说明灭菌彻底。如某一位置试样出现杂菌，可能是锅内有“死角”，也可能是灭菌锅结构不合理，或没有按操作要求堆积，　气撒料，或一次性撒料过厚，或瓶、袋过于拥挤，蒸汽流通不均匀造成；如不分部位，大部分或几乎全部瓶、袋都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，如果是高压灭菌锅出现这种现象，则说明是冷窑没有排除干净所致。
（二）接种室（无菌室）、箱灭菌效果检验方法
１、平皿法　先制作常任的霉菌培养基，如CPDA、PDA、BSA等，灭菌后，常规制作无菌平皿培养基（简称平板）。检查接种室（箱）灭菌合格与否，随机取几组无菌平皿培养基（每组3-5个平皿）在接种室（箱）台面上不同位置打开置放的平皿， 其中一组不打开平皿盖作为对照，开盖平皿放置５分钟，然后盖上盖，与对照组同时在30℃培养72小时,检查在平皿培养基上是否有霉菌菌落。实验组少于１个菌落，视为灭菌合格。
　　检查细菌方法同上，一般采用MPSA培养基。不同的是将实验的平皿均放置在37℃下培养24小时,至多不超过48小时。
２、法　将上述常规真菌与细菌培养基斜面各取3-5支为一组,放置接种室(箱)内,按无菌操作将其中实验组棉塞打开,经30分钟后,再将无菌棉塞塞好,与对照组同时放在30℃和37℃进行(细菌与霉菌)培养。细菌在培养24-28小时后观察， 霉菌在培养72小时后观察,实验组均不长任何菌落,视接种室、箱灭菌良好。回复很好，很全面。回复很有帮助！回复很全面！回复真是太好了，解了我的燃眉之急啊！有这方面好的网上书籍介绍一点？感谢之至！回复很好，很受用回复谢谢楼主。很有用的文章！！回复非常有用的文章回复谢谢楼主，很实用。回复很好。回复谢谢了啊
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