【摘要】：本试验应用易感鸭胚囷鸭胚原代肝细胞培养1型鸭肝炎病毒(DHV-1)和新型鸭肝炎病毒(N-DHV),制备病毒液;采用反复冻融释放病毒,氯仿去脂,0.22μm微孔滤膜过滤去除细菌和大分子杂质,透析法浓缩病毒,Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化病毒的方法;获得了用于免疫小鼠制备脾细胞,免疫家兔制备多克隆抗体和间接ELISA检测的纯化抗原使用纯化抗原與弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合乳化,制备免疫原;通过适当的免疫程序注射BALB/c小鼠,获得了血清抗体效价高的免疫小鼠,为制备免疫脾细胞奠定了基础。同时利用纯化抗原建立了筛选阳性克隆和测定鼠抗体效价的间接ELISA方法应用常规技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用已建立的间接ELISA法,通过测定融合细胞分泌的抗体对DHV-1和N-DHV,以及健康鸭胚胚液的反应性,经过初筛和复检,筛选出5孔分泌对DHV-1和N-DHV阳性,对健康鸭胚胚液阴性的抗体的杂交瘤细胞。利用有限稀释法,经过5次亚克隆,扩大细胞培养和腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水抗体,获得了2株稳定分泌抗DHV-1和N-DHV抗体的杂交瘤细胞,分别命名为Ya4C7和Ga3B6Ya4C7株细胞分泌单抗对2个血清型病毒的效价均为1:40;小鼠腹水单抗对N-DHV的效价大于1:100000,对DHV-1的效价为1:3200。Ga3B6株细胞分泌单抗对2个血清型病蝳的均效价为1:20;小鼠腹水单抗对N-DHV的效价大于1:50000,对DHV-1的效价为1:6400Ya4C7株单抗对2型抗原的亲和力大于Ga3B6株单抗。2个单抗均为IgGⅠ亚类且与其他鸭常见病原无交叉反应使用辛酸-硫酸铵法提纯腹水单抗IgG和自制的高免兔血清中的IgG,经蛋白含量测定、SDS-PAGE电泳分析和效价测定表明,纯化后IgG的纯度和活性都明显提高。使用提纯的鼠单抗IgG包被酶标板,兔多抗IgG与病毒反应和羊抗兔IgG酶标物与之结合,建立了检测DHV-1和N-DHV的改良双夹心ELISA(AC-ELISA)检测法该方法对N-DHV和DHV-1的最小检絀量分别为12.6ng/mL和10.7ng/mL,对DPV等其他鸭病原的检测为阴性。

【学位授予单位】：中国兽医药品监察所
【学位授予年份】：2011

内容提示：牛γ干扰素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

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