免疫荧光假阳性问题，高手赐教(假阳性,免疫荧光,一抗,荧光) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 免疫荧光假阳性问题，高手赐教(假阳性,免疫荧光,一抗,荧光)
摘要: [免疫荧光假阳性问题，高手赐教(假阳性,免疫荧光,一抗,荧光)] 本人做干细胞分化实验，分化之后检测VASA标记，开始做的时候发现细胞阳性率很高，我就用阴性对照组，用成纤维细胞做，因为这个细胞确定不表达vasa，结果，所有细胞都发荧光，说明一下，我的一抗是新买的，abcam的，一抗是兔抗人，二抗是山羊抗兔，波段488，发绿色荧光。不加一抗时候很少细胞发光，求高手赐教 关键词:[假阳性 一抗 免疫荧光 荧光 干细胞 山羊抗兔 成纤维细胞]……
本人做分化实验，分化之后检测VASA标记，开始做的时候发现细胞阳性率很高，我就用阴性对照组，用成纤维细胞做，因为这个细胞确定不表达vasa，结果，所有细胞都发荧光，说明一下，我的一抗是新买的，abcam的，一抗是兔抗人，是山羊抗兔，波段488，发绿色荧光。不加一抗时候很少细胞发光，求高手赐教
回复请问您现在问题解决了吗？我现在也约到了差不多的问题，望您赐教
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& && & 各位高人，小弟在做细胞免疫荧光实验中发现一个这样的问题，我的细胞中阳性率极高，差不多有100%左右，而且还出现两个极端现象，阳性率要么是100%，要么是0，没有出现一个视野中部分细胞是阳性，部分细胞是阴性的现象，但是我做的阴性对照组中没有阳性细胞，这就排除了二抗非特异性吸附的问题。请教师兄后，师兄告诉我说一抗可能不纯，里面存在非特异性的成分，吸附在细胞上产生假阳性现象，使用前可以先用别的细胞吸附一次后使用。我想请教各位，有谁做过这种吸附实验吗？效果怎么样？抗体浓度怎么确定？具体怎么操作？
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觉得还是你的一抗本身的原因，可以这样考虑；& ]7 I! Y0 [% \: `&&H2 r% _
1.找阳性的细胞或者组织切片，染色严重抗体是否有效？( G$ P$ \4 M- T: U6 d7 q8 J' S
&&如果有特异的阳性，说明是你的处理细胞比如诱导方法上的问题，没有得到阳性的细胞；! k! M) Q8 I, o4 A! W
&&如果没有特异染色结果，见2
2.在别人的相关的有很漂亮图片的文章中查找信息，索要或者重新购买？
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说一说你的对照是怎么做的？抗体是哪里的？适不适合做免疫荧光？你想要什么样的结果？你怎么证明是假阳性？
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回复 3 X2 n8 |4 B8 u1 w0 K/ z1 B* I$ n
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我的阴性对照就是不加一抗，其余相同。我们的抗体一般都是Sigma的，肯定适合做免疫荧光。因为我是做干细胞分化，想检验它的分化效率，可以肯定的是不可能达到100%，我想利用免疫荧光来统计阳性率。因为做完后发现所以的细胞都是阳性，所以假阳性的概率是很高的，而且阴性对照里面是没有阳性结果的。
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一抗出问题的可能性还是比较大的，可以杂一下其他细胞，另外参考一下western效果，可以用相同的一抗和二抗
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Sigma的抗体？哦。既然用牌子证明抗体没有问题，那我就先不说抗体的问题了。你的对照，有没有什么都不加的，完全空白对照（检测，细胞本身的特性）？有没有其他的已知阳性对照？染色结果是怎么样？你说的阴性中没有阳性细胞是指的，阴性完全没有信号？连背景颜色都没有吗？请用怀疑的态度来做实验，请不要带着答案去做实验！这是生物老师交给大家的。请多看文献！这是经验！谢谢。说话可能过火，请往好的方向理解！
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你好~我对你的头像十分感兴趣，想知道，这是什么细胞？怎么标记的？是你做的实验还是文献上的图片？如果是文献，能否给个全文？谢谢
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回复 . z8 z$ z. t2 \% G, m
7 p' [. m# q$ x9 ]+ E+ l: M
我的头像是在百度图片里找的，你也可以找一找。呵呵！
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8 L/ |1 ], ~) C# h" c$ E# o&&s
你好，非常感谢你的回复。我的阴性对照是按照通常水平来说用PBS代替一抗，其余的和实验组完全一样，对照组中没有任何信号，背景也没有。而且这样的情况不仅仅是我一个出现，我的一个Parter也是这样的现象，不过她不认为这是个问题罢了。已知的阳性对照我自己没有做，但是又其他同学做过，因为用的取材的SC，S100为全阳性这也没有什么问题。如果是一抗吸附造成的，把一抗染其他细胞看看会怎么样。
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回复 / q/ G% ?% e0 R' A% U- j, y
1 Q& @) u! w- T6 y
关于标记基因的特异性现在在一些细胞当中很有争议。有的在不同的固定液当中实现的染色效果同一个抗体会得到不同的结果。我做组织染色时经常观察到negative control 会有背景的。当然有无背景取决于显微镜灵敏度的调整。这一点我可以保证。对于一抗来说DAKO和JK的抗体做了很多年，很专业，至于Sigma的抗体可以不怀疑，但是做对照组是应该的。也利于分析问题。希望你们参考一下别人成功的实验及文献，有可能的话完全重复一下，希望实验顺利！
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抗核抗体阳性说明什么？
全网发布： 08:48
&&& 在临床上，常常遇到一些病人在检查中发现抗核抗体（ANA）阳性，担心自己是不是得了红斑狼疮，那么ANA阳性到底说明了什么呢？
&&& 其实，在我们身体内有一个系统叫免疫系统，这个系统专门产生一些细胞或抗体对抗进犯我们身体的细菌或者病毒，防止机体受到这些微生物的感染。但是，在有些时候，免疫系统也会出错，产生一些针对自己身体内细胞的抗体，这些抗体种类繁多，其中重要的一类即是抗核抗体（ANA）。很多病人以为抗核抗体是单一抗体，这种观点是不对的。现在，人们把抗体所针对的体内物质称为靶抗原，原先人们将ANA作为一组将人体细胞内各种与细胞核相关成分作为靶抗原的自身抗体的总称，而最近认为靶抗原所分布的区域已不局限于细胞核，还包括细胞浆中的某些核蛋白和核酸等。针对不同的核抗原，身体产生不同的抗核抗体。在体内的抗体中，主要有5类，分别称为IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。 ANA主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，但是这些抗体并不会针对某一个器官和或某一个特定的种属的动物。到目前为止，已有二十余种抗核内不同成分的抗核抗体被相继发现。
&&& ANA存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。目前理解，ANA包括五大类，每一类又因不同的抗原特性再分为许多亚类，因此总起来称为抗核抗体谱。各种ANA在不同的自身免疫病中出现不同的组合，由此成为各种疾病的特征性抗体谱。病人检测出不同组合的抗核抗体，对诊断疾病有非常重要的意义。
&&& 在临床实际检测中，首先检测抗核抗体要有一个初筛实验，确定病人血清ANA是否阳性，再进一步检测各亚类ANA。初筛实验一般用间接免疫荧光法检测，间接免疫荧光法是ANA检测的标准筛查方法。ANA的阳性结果可报：均质型、斑点型、核仁型、着丝点型等等，其不同核型的确定对下一步的检测和临床诊断有重要的参考价值。也可用酶联免疫吸附法检测，但是这一方法没有间接免疫荧光法完整的含有真核细胞靶抗原。
&&& ANA对很多自身免疫性疾病有重要的诊断价值。ANA最常见于系统性红斑狼疮和混合性结缔组织病。在、干燥综合症、系统性硬皮病等也可出现阳性。并且低滴度的ANA可出现在慢性活动性、结核病、重症肌无力、慢性甲状腺炎等，也可在正常老年人中检出。很多病人拿了检验报告单，不明白各个抗核抗体的核型，但是一般来说，ANA滴度大于1：80阳性者要高度怀疑自身免疫性疾病，而且滴度越高，与自身免疫性疾病的相关性越大。
&&& 因此，抗核抗体的初筛阳性并不一定说明就是得了狼疮，而是需要通过抗核抗体谱的检测，以及与身体的其它情况一起经过综合判断才能诊断。患者如果发现抗核抗体阳性也不要慌，可以咨询风湿免疫的专科医生，了解这一指标的意义。
发表于： 20:30
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