细菌的生化试验 - 微生物实验 - 生物秀
标题: 细菌的生化试验
摘要: [细菌的生化试验]不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系不同，对营养物质的吸收利用、分解排泄及合成产物的产生等都有很大的差别，细菌的生化试验就是检测某种细菌能否利用某种(些)物质及其对某种(些)物质的代谢及合成产物，确定细菌合成和分解代谢产物的特异性，借此来鉴定细菌的种类。[目的要求](1)掌握细菌鉴定中常用生化试验的原理和方法。(2)了解细菌生化试验在…… [关键词:细菌 培养基 试剂 发酵 菌落 乳糖 接种]……
不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系不同，对营养物质的吸收利用、分解排泄及合成产物的产生等都有很大的差别，细菌的生化试验就是检测某种细菌能否利用某种(些)物质及其对某种(些)物质的代谢及合成产物，确定细菌合成和分解代谢产物的特异性，借此来鉴定细菌的种类。
[目的要求]
(1)掌握细菌鉴定中常用生化试验的原理和方法。
(2)了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。
[实验内容]
1．氧化型与发酵型(O/F)的测定
原理不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解；分装试管，3～4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出后冷却成琼脂柱。
试验方法挑取18～24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中1管覆盖1mL灭菌的液体石蜡，37℃培养48h或更长时间，最长可达7d。
结果判定只在没有覆盖石蜡的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型；两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型；两管都不生长者不予判定结果。
2．糖类分解试验
原理细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，是受遗传基因所决定的，是细菌的重要表型特征，有助于鉴定细菌，含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。
培养基可用市售各种糖或醇类的微量发酵管。
试验方法取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖培养基内，开口朝下，置灭菌培养皿中。37℃培养24h，观察结果并记录。
如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色[培养基内指示剂溴甲酚紫由pH 7.0(紫色)～pH 5.4(黄色)]，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。
结果判定用符号表示
无变化一培养液仍为紫色
产酸十培养液变为黄色
产酸又产气⊕培养液变黄，并有气泡
3．吲哚(靛基质)试验
原理有些细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli))能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而成红色。
培养基Dumham氏蛋白胨水溶液。蛋白胨lg，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL。将蛋白胨与氯化钠加入蒸馏水中，加热溶解后调pH为7．6，再煮沸加热30min。待冷后用滤纸过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min。
Ehrlich氏对位二氨基苯甲醛1g，无水乙醇95mL，浓盐酸20mL。先用乙醇溶解后加盐酸，避光保存。
Kovac氏试剂对位二氨基苯甲醛5g，戊醇(或异戊醇)75mL，浓盐酸25mL
试验法以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于Dunham氏蛋白胨水溶液中，置37℃培养24～48h(可延长4～5d)；于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL，摇匀，静置片刻后，沿壁加入Ehrlich氏或Kovac氏试剂2mL。
斑点试验法将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上；滴加1～1.5mL试剂液于滤纸上使其变湿；取18～24h血琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上；在1～3min内棕色的试剂由紫红变为红色者为阳性。
加热试验法将一小指头大的脱脂棉，滴上两滴Ehr·lich氏试剂，再在同一处加滴两滴高硫酸钾(K2SO8)饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约1.5cm；将被检试管放入烧杯或搪瓷缸煮沸为止；脱脂棉上出现红色者为阳性。若将试剂加到液体中，吲哚和粪臭素均呈阳性反应，而用此法，只是吲哚(具挥发性)呈阳性反应。
4．甲基红(MR)试验／VP试验
原理细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4．5以下时，加入甲基红指示剂而变红[甲基红的变色范围为pH 4．4(红色)～pH 6．2(黄色)]，此为甲基红试验。当细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇又变成2，3一丁二烯醇，2，3一丁二烯醇在碱性条件下氧化成为二乙酰，二乙酰和蛋白胨中精氨酸胍基起作用产生粉红色的化合物，此为VP试验。这两个试验密切相关，对一种细菌而言，两者只能居其一。
培养基葡萄糖蛋白胨水溶液。
甲基红试剂甲基红0．02g，95％酒精60mL，蒸馏水40mL。
VP试剂甲液：α一萘酚酒精溶液(α-萘酚5g，无水乙醇100mL)。乙液：KOH溶液(KOH 40g，水100mL)。将甲液和乙液分别装于棕色瓶中，于4～10℃保存。或：硫酸铜1g，浓氨水40mL，10%KOH 950mL，蒸馏水10mL。
MR试验方法取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h，取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；橙色者为可疑，以“±”表示；黄色者为阴性，以“-”表示。
VP试验方法取一种细菌的24h纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h。取出后在培养液中先加VP试剂甲液0．6mL，再加乙液0．2mL，充分混匀。静置在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；不变色为阴性，以“-”表示。1h后可出现假阳性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养液中混合，静置，强阳性者约5min后就可产生粉红色反应。
5．枸橼酸盐利用试验
原理以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，若细菌能利用这些盐作为碳源和源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成NH40H，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色。
培养基Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管或琼脂斜面培养基。
微量法取纯培养细菌接种于枸橼酸盐培养基内，置37℃培养48～72h，如培养基由草绿色变为深蓝色为阳性，以“+”表示，否则为阴性，以“-”表示。肠杆菌、枸橼酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长良好或培养基显为深蓝色。
常量法将被检菌纯培养物或单个菌落划线于枸橼酸钠琼脂斜面并在37℃培养24～48h。肠杆菌、枸橼酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长良好或培养基显为深蓝色。
6．硫化氢试验
原理细菌分解含硫氨基酸，产生H2S，与培养基中的醋酸铅或FeSO4发生反应，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁。
培养基可用成品微量发酵管、醋酸铅琼脂或三糖铁琼脂斜面。
微量法取一种细菌纯培养物，接种于H2S微量发酵管中，置37℃培养24h后观察结果。培养液呈黑色者为阳性，以“+”表示，无色者为阴性，以“-”表示。
常量法用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺醋酸铅琼脂或三糖铁培养基，37℃培养24～48h或更长时间，培养基变黑者为阳性。或将纯培养物接种于肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管壁和棉花塞间夹-6．5cm×0．6cm大小的试纸条(浸有饱和醋酸铅溶液: 取10g醋酸铅溶于50mL，沸蒸馏水中即为饱和醋酸铅溶液)，培养于37℃，观察，纸条变黑者为阳性。
7．氧化酶试验
原理测定细菌细胞色素氧化酶的产生，阳性反应限于那些能够在氧气存在下生长的同时产生细胞内细胞色素氧化酶的细菌。
试剂1％四甲基对苯二胺(Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochlo-ride)，新鲜配制，装棕色瓶贮存，4℃，可保存1个月。
试验方法加2～3滴试剂于滤纸上，用牙签挑取1个菌落到纸上涂布，观察菌落的反应。阳性反应在5～10s内由粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。也可将试液滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红然后到深紫色者为阳性。也可在菌落上加试液后倾去，再徐徐滴加用95％酒精配制的1％的α-萘酚溶液，当菌落变成深蓝色者为细胞色素氧化酶阳性。
8．触酶试验
原理本试验是检测细菌有无触酶的存在。过氧化氢的形成看作是糖需氧分解的氧化终末产物，因为H2O2的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为触酶(过氧化氢酶)和过氧化物酶。
试剂3％H2O2(新配)。
试验方法可用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加1滴3％H202于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H202混合物之上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细胞的气溶胶颗粒的形成。或直接将3％H202加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现(血琼脂平板除外)。
9．脲酶试验
原理细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。
培养基尿素微量发酵管或christensen氏尿素琼脂培养基，蛋白胨lOg，葡萄糖1g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2g，0．4％酚红溶液3mL，琼脂20g，20％尿素溶液100mL，蒸馏水900mL。除尿素溶液外，将上述成份依次加入蒸馏水中，加热溶解，调pH至7．2，121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷至50～55℃左右加入已滤过除菌的尿素溶液，混匀分装于灭菌试管，放成斜面冷却备用。
试验方法用接种环将待检菌培养物接种于尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。置37℃培养，于1～6h检查(有些菌分解尿素很快)，有时需培养24h到6d(有些菌则缓慢作用于尿素)。阳性反应，则琼脂斜面由粉红到紫红色。
10．淀粉水解试验
原理有的细菌具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈蓝紫色反应。
培养基与试剂3％可溶性淀粉琼脂平板(普通琼脂900mL加3％可溶性淀粉溶液100mL)和革兰氏碘溶液(见附录一)。
试验方法将细菌划线接种于3％可溶性淀粉琼脂平板上，在37℃培养24h。取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环(即淀粉酶阳性)。
11．石蕊牛乳试验
原理石蕊是一种pH指示剂，当pH升至8．3时碱性显蓝色，pH降至4．5时酸性显红色；pH接近中性，未接种的培养基为紫蓝色故称紫乳。石蕊也是一种氧化还原指示剂，可以还原为白色，所以，石蕊牛乳(紫乳)是用来测定被检细菌几种代谢性质的一种鉴别培养基。
培养基加石蕊酒精饱和溶液于新鲜脱脂乳中，分装小管，经流通蒸汽灭菌而成。
试剂石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30mL的40％乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，连续2次。加40％乙醇至总量为lOOmL，，并煮沸1min。取用上清液，必要时可加几滴lmol/L盐酸使其呈紫色。现多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脱脂乳中加1．2mL
1．6％溴甲酚紫酒精溶液。
试验方法与结果判定将被检菌接种于紫乳，置37℃温箱培养，观察结果。若细菌分解乳糖产酸，指示剂变色(石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色)。若产酸产气，使牛乳酸凝，气体使凝块中有裂隙，如产气荚膜梭菌呈“暴裂发酵”。若为紫色，表示乳糖未分解；若为蓝色表示乳糖虽未发酵，但细菌分解培养基中所出现的氮源物质而产碱所致。若指示剂还原则为无色，常出现在酸凝块形成之后。
12．硝酸盐还原试验
原理有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐(偶而还会形成NH3、N2、N0、NO2和NH40H等其他产物)，若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染料对磺胺苯一偶氮-α-萘胺(锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且可用于区别假阴性反应和真阴性反应)。
培养基蛋白胨1g，硝酸钾0．1～0．2g，蒸馏水100mL。将上述成分放于蒸馏水中加热溶解，调pH至7．4，滤纸过滤，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌20min。在上述培养基中加入硫乙醇酸钠0．1g即成厌氧菌用的硝酸盐培养基。
甲液：甲基α-萘胺0．6g，5mol/L冰醋酸100mL，稍加热溶解，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中，4～10℃保存。
乙液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L冰醋酸100mL，先用5mol／L冰醋酸30mL，溶解对氨基苯磺酸，再加冰醋酸至100mL。放入带玻璃塞的玻璃瓶中4～10℃保存。
试验方法与结果判定把纯菌培养物接种到硝酸盐培养基中，在37℃培养18～24h，再加试剂甲和乙各3～5滴，在30s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是真正的阴性试验。
13．苯丙氨酸脱氨酶试验
原理若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。
培养基DL一苯丙氨酸2g(L-苯丙氨酸1g)，氯化钠5g，琼脂12g，酵母浸膏3g，蒸馏水1 000mL，磷酸氢二钠1g。分装于小试管内，121℃高压蒸汽灭菌10min，制成斜面。
试剂10％FeCl3水溶液。
试验方法与结果判定将被检菌18～24h培养物取出，向试管内注入0.2mL(或4～5滴)10％FeCl3溶液于生长面上，变绿色者为阳性。
14．氨基酸脱羧酶试验
原理这是肠杆菌科细菌的鉴别试验，用以区分沙门氏菌(通常为阳性)和枸橼酸杆菌(通常为阴性)，若细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基(一COOH)，导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性。若细菌不脱羧，培养基不变则为黄色。
培养基蛋白胨5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1g，蒸馏水1 000mL，0．2％溴麝香草酚蓝溶液12mL。调整pH至6．8，在每100mL基础培养基内，加入需要测定的氨基酸0．5g，所加的氨基酸应先溶解于1．5％NaOH溶液内(L-α-赖氨酸0.5g+1．5％NaOH溶液0．5mL，L-α-鸟氨酸0.5g + 1.5％NaOH溶液0.5mL)。加入氨基酸后，再调整pH至6．8，分装于灭菌小试管内，每管1mL，121℃高压蒸汽灭菌10min。
试验方法与结果判定从琼脂斜面挑取培养物少许，接种于试验用培养基内，上面加一层灭菌液状石蜡。将试管放在37℃培养4d，每天观察结果。阳性者培养液先变黄后变为蓝色，阴性者为黄色。
15．胆汁溶解试验
原理肺炎链球菌产生自溶酶，它能使正在生长的菌体溶解，使老龄菌落中心下陷，胆盐通过降低培养基与菌体细胞膜之间的表面张力而加速这一过程。本试验常用以鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌。
试剂2％去氧胆酸钠溶液。
试验方法与结果判定在被检菌血琼脂平板上找到单个分散的菌落，在其上加1滴试液。再置37℃培养箱中30min后取出观察菌落，可见菌落消失，或尚有部分保留。培养菌在肉汤中生长，而且固体培养平板上菌落周围形成一个黑洞(孔)者是D群链球菌的标志。
16. 明胶液化试验
原理明胶是一种动物蛋白质，某些细菌具有明胶液化酶，明胶经分解后，可呈现不同的特征，有利于细菌的鉴定。
培养基明胶培养基。明胶12～15g，普通肉汤100mL。将明胶加入肉汤内，中加热溶解，调pH至7．2，分装试管，115℃高压蒸汽灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。
试验方法与注意事项分别穿刺接种被检菌18～24h培养物于明胶培养基，置22℃下培养，观察明胶液化状况。明胶低于20℃凝成固体，高于24℃则自行呈液化状态。因此，培养温度最好在22℃，但有些细菌在此温度下不生长或生长极为缓慢，则可先放在37℃培养，再移置于4℃冰箱经30min后取出观察，具有明胶液化酶者，虽经低温处理，明胶仍呈液态而不凝固。明胶耐热性差，若在100℃以上长时间灭菌，能破坏其凝固性，此点在制备培养基时应注意。
17．JB一半乳糖苷(ONPG)试验
原理细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β-半乳糖苷酶透性酶(β-galactosidase permease)，它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为卢一半乳糖苷酶(β-galac-tosidase)，亦称乳糖酶(Lactase)，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24～48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有β-D-半乳糖苷酶(胞内酶)，而缺乏卢一半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，而经培养基中1％乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的透性酶后，始能较快分解乳糖，故呈迟缓发酵现象。PNPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚(Orthonitrphenyl，ONP)，故由培养基液变黄可迅速测知β-半乳糖苷酶的存在，从而确知该菌为乳糖迟缓发酵菌。
ONPG培养基邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0．01mol／L pH7．5磷酸缓冲液1 000mL，pH 7．5的灭菌1％水300mL。先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1％水混合，分装，每管2～3mL，无菌检验后备用。购不到ONPG时，可用5％的乳糖，并降低蛋白胨含量为0.2％～0.5％，可使大部分迟缓发酵乳糖的细菌在1d内发酵。
试验方法取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1～3h或24h，如有β-半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。
1．解释所做生化试验的原理。
2．在所做生化试验中，分解糖或蛋白质的各有哪些?
3．试述生化试验在细菌鉴定中的作用与意义。
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-生化试验_图文_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
评价文档：
上传于||暂无简介
大小：10.15MB
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢主管技师基础知识模拟1_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
主管技师基础知识模拟1
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用0下载券
想免费下载更多文档？
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩14页未读，继续阅读
你可能喜欢生化试验_图文_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
评价文档：
上传于||暂无简介
大小：11.82MB
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢}