在应激状态下，血中浓度立即增加的激素是（） A．盐皮质激素 B．ACTH C．降钙素 D_答案_百度高考
在应激状态下，血中浓度立即增加的激素是（）
A．盐皮质激素 B．ACTH C．降钙素 D．生长抑素 E．甲状腺激素
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手术应激对机体血清中ACTH,Cor和IL--6的影响
研究生：刘& 阳导& 师：张书峰& 教授河南省人民医院小儿外科郑州& 45000020世纪60年代人们开始对应激反应有所研究，Selye等首先提出了应激学说和全身适应综合症，对应激后机体的各种生理变化有所揭示。在外科学的范围内，手术创伤是常见的一种应激原，而且这种应激原的强度和作用远大于紧张、害怕、寒冷等的作用。小儿实体肿瘤患儿作为外科手术对象中一类特殊群体，对环境变化的适应性差，手术后，机体的对手术创伤的耐受力更差，术后并发症和死亡率均较成人高。经过数十年的发展，小儿术前术后在长期不进食的情况下可以得到足够的营养支持，血压、心率、血氧饱和度等生命体征等得到的分秒监测，手术方式也有了很大的改进，使手术方式简单化，手术操作时间大大缩短，术后患儿的死亡率有了一定的改善，但与成人相比，术后小儿的死亡率还是很高的。因此，能否找到能反映机体对应激变化的指标，并进行动态监测，就可以对术后机体内一些相关的变化规律有进一步的了解，从而采取相应的措施，指导临床治疗方法的改变，催进患儿术后早日恢复。血清中皮质醇(cortisol,Cor)，促肾上腺皮质激素( adrenocorticotrophichormone, ACTH)水平可用来作为反映机体应激变化的指标，因应激反应时，机体启动以下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）的强烈兴奋为代表的神经内分泌反应。HPA轴兴奋释放的中枢介质为促肾上腺皮质激素释放激素（ CRH ）和ACTH,CRH最主要的功能是刺激ACTH的分泌，进而增加糖皮质激素(GC)的分泌，而GC中最主要的是Cor。细胞因子（cytokine）是近年来的研究热点，它是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过旁分泌、自分泌或内分泌的方式结合细胞表面的相应受体而发挥生物学作用。按其结构和功能，可分为6类， 29种白细胞介素是其中一类。IL-6是由单核-巨噬细胞、T细胞和内皮细胞分泌的，与急性期蛋白产生，发热有关。相关研究已证实，白细胞介素-1β（IL-1β）可直接或间接地作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，其主要作用点在CRH神经元。IL-1β与CRH神经元上的受体结合后，可以通过释放CRH促进ACTH的分泌，引起GC分泌增多。IL-6可能也具有与IL-1β相似的作用，具体的作用途径还在进一步研究中。本研究是关于手术创伤的急性应激反应，特选择IL-6作为一个研究指标。手术创伤可加重机体固有的疾病，如原发性、冠心病、溃疡性结、支气管等，也可引起新的疾病，如生长发育减慢、应激性溃疡、感染性休克、多器官功能衰竭等。小儿很少有一些原发疾病，因而术后的并发症多为应激性溃疡、感染性休克、多器官功能衰竭等疾病。相关报道指出，重大疾病时，机体应激性溃疡的发病率为75%-100%，但让机体处于危险状态的是应激性溃疡发生大出血，其死亡率可达50%。按照Selye的理论，如果能找到相关的指标来判断机体在应激后从抵抗期进入衰竭期，就能在机体出现并发症前采取措施，就能减少应激对机体的威胁，增强机体的抵抗力，逆转病情。目前，国内外对手术创伤的研究对象多集中在成人，对成人开胸手术和颅脑手术的研究较多，很少研究实体肿瘤小儿这类特殊群体；研究的指标也往往选择局限于传统内分泌的相关指标上，对今年来研究较热的细胞因子类研究很少。兔的免疫系统与人体较接近，与免疫相关的研究往往选择兔作为实验对象。特本研究将幼兔和实体肿瘤患儿作为研究对象，将ACTH, Cor和IL-6作为指标。本研究由两部分组成：幼兔实验部分和人体研究部分。分别动态监测幼兔和实体肿瘤患儿手术前后不同时间点血清ACTH、Cor和IL-6的变化。先对幼兔的变化做分析，寻找规律，再通过对小儿的研究，看两种对象的相关指标变化有无相似性。若有相似性，则这些指标可作为监测疾病变化的敏感性指标，广泛应用于临床，预测患儿预后，减少并发症的出现，提高术后小儿的生存率。也能为临床采取干预治疗提供依据。实验材料2.1.1 主要仪器设备分光光度仪&&&&&&&&&&&&& UV－240lPC &&&&&&&&&&&&&&&& 日本酶标仪&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Bio－Rad 3550－UV&&&& 美国洗板机&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& DEM--3型&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 美国-80℃冰箱&&&&&&& 科研专用型&&&&&&&&&& 海尔公司肝素抗凝管2.1.2 药品及试剂戊巴比妥钠&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 上海化学试剂公司Cor 放免试剂盒&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 北京科美东亚股份有限公司ACTH放免试剂盒&&&&&&&&&&& 北京科美东亚股份有限公司IL-6 ELISA试剂盒&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 郑州宝赛生物科技有限公司 (进口分装)2.2 实验方法2.2.1 动物来源, 实验前准备和手术方法由河南省动物实验中心提供的日本大耳白兔14只，均为幼兔，月龄为3-4月，性别和体重详见表2.3.1，饲养于河南省动物实验中心。动物饲养环境为普通环境，温度20-22度，相对湿度40%-70%，每天12h仿日光灯照。实验动物分笼饲养，饲料采用实验中心提供的普通饲料，每日定时喂食120g，允许自由饮用清水。实验前禁食8h，禁饮4h。使用3%浓度的戊巴比妥钠水溶液，按每公斤体重1ml的剂量行耳缘静脉缓慢注射，边注射边观察日本大耳白兔的心率、呼吸、疼痛刺激反应等，待其对疼痛无反应时，置于仰卧位，固定四肢，行腹部去毛。去毛后，聚维酮碘溶液消毒，行手术区域备皮。然后遂行脾切手术。手术时间控制在60min±20min。术后日本大耳白兔清醒时进食水。2.2.2 标本采集和分组原则分别于术前24h，术后12h，术后24h，术后48h，术后72h经耳缘静脉采血2ml，置于肝素抗凝管，3000转/分离心10分钟，取上层血清约1ml，置于EP管中，-80℃低温保存。放免法测量不同时间点血清中ACTH、Cor的含量；双抗夹心 ELISA 法测量不同时间点血清中IL-6的含量。把术前指标的数值作为正常组，术后4个时间点的数值作为对照组，采用自身前后对比的方法。2.2.3 兔血清皮质醇测定2.2.3.1 试剂盒组成:①125I-Cor &&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml缓冲液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&②抗体&&&&&&&&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&③校准品&&&&&&&& 7瓶（浓度分别为0，10，25，50，100，200，500ng/ml）&&每瓶溶于0.5ml蒸馏水&&&&&&&④分离剂 &&&&&& 1瓶（悬浮液）& 用前充分摇匀&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&⑤缓冲液&&&&&&&& 1瓶（液体）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑥质控血清&&&& 2瓶（冻干品）& 含低、高两个剂量2.2.3.2 准备工作:将血清标本解冻2.2.3.3 操作步骤:①标记需用的试管，包括标准品、质控品、标本、总技术管、NSB管，需做双份平行。②加标准品0—6、质控品1—2、标本至相应管中，NSB管中加100μl标准品0。③加100μl标记物至所有管中，包括总计数管。④加100μlCBG抗血清至相应各管，其中总计数管及NSB管除外，加100μl标准品0至NSB管。⑤轻轻振荡试管架，使各管中可能包含的空气逸出。盖好试管，室温温育2小时。⑥轻轻搅拌免疫吸附剂，使之保持悬浮状态，加100μl免疫吸附剂至各管，其中总计数管除外。轻摇试管架30秒。室温温育20分钟。⑦加3ml工作液至各管，总计数管除外，后1500转/分室温下离心15分钟。马上抽吸各管中的上清液，总计数管除外。⑧使试管竖立于吸水纸上10分钟，充分空干。γ-放免计数仪计数60秒。⑨自动打印出测量值。2.2.4& 兔血清Il-6的测定2.2.4.1 试剂盒组成:①酶标板 (Coatedwells)&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 96wells②Anti-rabbit IL-6Biotin&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 6ml③标准品 (Standards)&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&& lset④浓缩洗涤液 (20倍)(washing Concente) &&&&& 25ml⑤显色液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&& 12ml⑥Antl-rabbit IL-6POD&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&& 6ml⑦终止液 (Stopsolution)&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&& 12ml2.2.4.2 操作步骤:①取出试剂盒平衡至室温 (20℃－25℃)。②浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍 (至500ml)。③加入10μl标准品，I0μl血浆于相应反应板孔中。④每孔加入40μlAnti-rabbitIL-6Biotin和 40μlAnti-rabbit IL-6POD。轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育45分钟。⑤洗板，甩尽板内液体，用洗板机洗涤反应板 (每孔内加入洗涤液350μl) 5遍。⑥每孔加入100μl显色液，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟。⑦每孔加入100μl终止液，轻轻混匀30秒;30分钟内在450nm处读OD值。⑧以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血浆样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。2.2.5 兔血清ACTH的测定2.2.5.1 试剂盒组成:①125I-ACTH&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml缓冲液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&②抗体&&&&&&&&&&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml蒸馏水&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&③校准品&&&&&&&&&& 7瓶（浓度分别为0，10，25，50，100，200，500ng/ml）&&每瓶溶于0.5ml蒸馏水&&&&&&&④分离剂&&&&&&&&&& 1瓶（悬浮液）& 用前充分摇匀&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑤缓冲液&&&&&&&&&& 1瓶（液体）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑥质控血清&&&&&& 2瓶（冻干品）& 含低、高两个剂量2.2.5.2 准备工作:将血清标本解冻2.2.5.3 操作步骤:①标记需用的试管，包括标准品、质控品、标本、总技术管、NSB管，需做双份平行。②加标准品0—6、质控品1—2、标本至相应管中，NSB管中加100μl标准品0。③加100μl标记物至所有管中，包括总计数管。④加100μlCBG抗血清至相应各管，其中总计数管及NSB管除外，加100μl标准品0至NSB管。⑤轻轻振荡试管架，使各管中可能包含的空气逸出。盖好试管，室温温育2小时。⑥轻轻搅拌免疫吸附剂，使之保持悬浮状态，加100μl免疫吸附剂至各管，其中总计数管除外。轻摇试管架30秒。室温温育20分钟。⑦加3ml工作液只各管，总计数管除外，后1500转/分室温下离心15分钟。马上抽吸各管中的上清液，总计数管除外。⑧使试管竖立于吸水纸上10分钟，充分空干。γ-放免计数仪计数60秒⑨自动打印出测量值。2.3统计方法数据均采用均数±标准差 ( ±s) 表示。SPSS10.0软件包进行统计分析。比较采用 t检验和方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。2.4结果1. 本实验所用的14只日本大耳白兔，9只为母兔，5只为公兔，体重在1.1-1.4Kg之间，详情见下表，F为母兔，M为公兔。表2.4.1 日本大耳白兔基本情况编号性别体重（Kg）01F1.202F1.103M1.304F1.205M1.206M1.407F1.108F1.109F1.210F1.011M1.212F1.213F1.314M1.22..血清中Cor水平于术后开始上升，术后24h到达峰值。对照组的前3个时间点与正常组相比，均有统计学意义（P＜0.05）。表2.4.2& 2组日本大耳白兔各时间点血清中Cor的变化( ±s, ng/ml)项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP141481.18±4.18103.20±15.52＊5.1260.00081.18±4.18167.56±16.19＊19.3280.00081.18±4.18120.36±11.28＊3.5330.00481.18±4.1884.27±4.92＊0.4910.064＊与正常组相比，P＜0.05图2.4.1&& 2组日本大耳白兔各时间点血清中Cor变化的柱状图&3.血清中IL-6水平在术后4h到达峰值，在术后24h内变化显著，对照组在术后4h、术后24h与正常组相比，有统计学意义（P＜0.05）表2.4.3& 2组日本大耳白兔各时间点血清中IL -6的变化( ±s, μmol/l)&项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP141472.36±3.34120.73±10.85＊15.9490.00072.36±3.34117.41±48.65＊3.4560.00472.36±3.3473.46±4.390.7480.46272.36±3.3471.86±3.300.3940.697＊与正常组相比，P＜0.05&图2.4.2&& 2组日本大耳白兔各时间点血清中IL -6变化的柱状图&&4.血清ACTH水平在术后4h到达峰值后，一直处于高水平状态，对照组各个时间点与研究组相比，均有统计学意义（P＜0.05）。表2.4.4& 2组日本大耳白兔各时间点血清中ACTH的变化( ±s, pg/ml)项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP141441.86±4.34411.26±41.86＊32.8410.00041.86±4.3496.46±7.10＊24.5480.00041.86±4.3487.31±8.90＊17.1710.00141.86±4.3460.01±5.97＊9.2000.002＊与正常组相比，P＜0.05图2.4.3&& 2组日本大耳白兔各时间点血清中ACTH变化的柱状图&&实验材料3.1.1主要仪器设备分光光度仪&&&&&&&&&&&&&&& UV-240lPC&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 日本输液泵&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Top330O型&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 日本酶标仪&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Bio-Rad 3550-UV&&&&&&&&&& 美国洗板机&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& DEM-3型&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 美国-80℃冰箱&&&&&&& 科研专用型&&&&&&&&&& 海尔公司3.1.2 药品及试剂罗库溴铵注射液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 荷兰欧佳农公司盐酸戊乙奎醚注射液&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 成都力思特制药股份有限公司枸橼酸舒芬太尼注射液&&&&&&& 宜昌人福药业有限公司注射用盐酸瑞芬太尼针&&&&&&& 宜昌人福药业有限公司丙泊酚中长链脂肪乳注射液&&& 北京费森尤斯卡比医药有限公司（进口分装）Cor放免试剂盒&&&&&&&&&&&&&& 北京科美东亚股份有限公司ACTH放免试剂盒&&&&&&&&&&& 北京科美东亚股份有限公司IL-6 ELISA试剂盒&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 郑州宝赛生物科技有限公司 (进口分装)3.2实验方法3.2.1 研究对象的选择和手术方法&选择2008年7月-2009年4月间在郑州大学第三附属医院小儿外科进行腹部手术的实体肿瘤患儿14例，均签署医学研究知情同意书。14例患儿无明显营养不良和严重感染，术前体检内分泌水平正常，无术前免疫功能异常，麻醉均采用经口气管插管全身麻醉，麻醉所用药物相同。手术时间120±20min，男 9 例 ,女6例;手术年龄3岁～6岁 ,手术分级根据P-POSSUM评分系统，分值小于-2.700和ASA分级小于等于Ⅲ级。术前常规禁食水。3.2.2 标本采集和分组原则分别于术前24h，术后4h，术后24h，术后48h，术后72h取外周静脉血2ml，置于肝素抗凝管，3000转/分离心10分钟，取上层血清约1ml，置于EP管中，-80℃低温保存。放免法测量不同时间点血清中ACTH、Cor的含量；双抗夹心 ELISA 法测量不同时间点血清中IL-6的含量。14例患儿术前的测定值为正常组，术后4个时间点的数值为对照组，采用自身前后对比的方法。3.2.3 人血清Cor的测定3.2.3.1 试剂盒组成:①125I-Cor &&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml缓冲液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&②抗体&&&&&&&&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&③校准品&&&&&&&& 7瓶（浓度分别为0，10，25，50，100，200，500ng/ml）&&每瓶溶于0.5ml蒸馏水&&&&&&&④分离剂 &&&&&& 1瓶（悬浮液）& 用前充分摇匀&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&⑤缓冲液&&&&&&&& 1瓶（液体）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑥质控血清&&&& 2瓶（冻干品）& 含低、高两个剂量3.2.3.2 准备工作:将血清标本解冻3.2.3.3 操作步骤:①标记需用的试管，包括标准品、质控品、标本、总技术管、NSB管，需做双份平行。②加标准品0—6、质控品1—2、标本至相应管中，NSB管中加100μl标准品0。③加100μl标记物至所有管中，包括总计数管。④加100μlCBG抗血清至相应各管，其中总计数管及NSB管除外，加100μl标准品0至NSB管。⑤轻轻振荡试管架，使各管中可能包含的空气逸出。盖好试管，室温温育2小时。⑥轻轻搅拌免疫吸附剂，使之保持悬浮状态，加100μl免疫吸附剂至各管，其中总计数管除外。轻摇试管架30秒。室温温育20分钟。⑦加3ml工作液至各管，总计数管除外，后1500转/分室温下离心15分钟。马上抽吸各管中的上清液，总计数管除外。⑧使试管竖立于吸水纸上10分钟，充分空干。γ-放免计数仪计数60秒。⑨自动打印出测量值。3.2.4 人血清IL-6的测定3.2.4.1 试剂盒组成:①酶标板 (Coatedwells)&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 96wells②Anti-human IL-6Biotin&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 6ml③标准品 (Standards)&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&& lset④浓缩洗涤液 (20倍)(washing Concente) &&&&& 25ml⑤显色液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&& 12ml⑥Antl- human IL-6POD&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&& 6ml⑦终止液 (Stopsolution)&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&& 12ml3.2.4.2 操作步骤:①取出试剂盒平衡至室温 (20℃－25℃)。②浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍 (至500ml)。③加入10μl标准品，I0μl血浆于相应反应板孔中。④每孔加入40μlAnti-human IL-6Biotin和 40μlAnti- human IL-6POD。轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育45分钟。⑤洗板，甩尽板内液体，用洗板机洗涤反应板 (每孔内加入洗涤液350μl) 5遍。⑥每孔加入100μl显色液，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟。⑦每孔加入100μl终止液，轻轻混匀30秒;30分钟内在450nm处读OD值。⑧以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血浆样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。3.2.5 人血清ACTH的测定3.2.5.1 试剂盒组成:①125I-ACTH&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml缓冲液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&②抗体&&&&&&&&&&&&&& 1瓶&&& 每瓶溶于10ml蒸馏水&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&③校准品&&&&&&&&&& 7瓶（浓度分别为0，10，25，50，100，200，500ng/ml）&&每瓶溶于0.5ml蒸馏水&&&&&&&④分离剂&&&&&&&&&& 1瓶（悬浮液）& 用前充分摇匀&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑤缓冲液&&&&&&&&&& 1瓶（液体）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&⑥质控血清&&&&&& 2瓶（冻干品）& 含低、高两个剂量3.2.5.2 准备工作:将血清标本解冻3.2.5.3 操作步骤:①标记需用的试管，包括标准品、质控品、标本、总技术管、NSB管，需做双份平行。②加标准品0—6、质控品1—2、标本至相应管中，NSB管中加100μl标准品0。③加100μl标记物至所有管中，包括总计数管。④加100μlCBG抗血清至相应各管，其中总计数管及NSB管除外，加100μl标准品0至NSB管。⑤轻轻振荡试管架，使各管中可能包含的空气逸出。盖好试管，室温温育2小时。⑥轻轻搅拌免疫吸附剂，使之保持悬浮状态，加100μl免疫吸附剂至各管，其中总计数管除外。轻摇试管架30秒。室温温育20分钟。⑦加3ml工作液只各管，总计数管除外，后1500转/分室温下离心15分钟。马上抽吸各管中的上清液，总计数管除外。⑧使试管竖立于吸水纸上10分钟，充分空干。γ-放免计数仪计数60秒。⑨自动打印出测量值。3.3 统计方法数据均采用均数±标准差 ( ±s) 表示。SPSS10.0软件包进行统计分析。采用 t检验和方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。3.4结果1.患儿血清中Cor水平术后开始上升，术后24h到达峰值，对照组在术后4h、术后24h、术后48h与正常组相比，有统计学意义（P＜0.05），在术后72h降至术前水平。表3.4.1&&& 2组患儿各时间点血清中Cor的变化( ±s, ng/ml)项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP141424.79±3.7236.25±2.81＊9.1840.00024.79±3.7244.13±3.29＊14.5660.00024.79±3.7232.04±8.37＊2.9590.00824.79±3.7223.38±5.831.3990.304＊与正常组相比，P＜0.05图3.4.1& 2组患儿各时间点血清中Cor变化的柱状图&2.患儿血清中IL-6水平在术后4h到达峰值，在术后24h内变化显著，对照组在术后4h、术后24h、术后48h与正常组相比，有统计学意义（P＜0.05），术后72h降至术前水平。&表3.4.2& 2组患儿各时间点血清中IL -6的变化( ±s, pg/ml)项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP14145.17±0.3223.59±4.24＊16.1920.0005.17±0.326.77±1.81＊3.2560.0065.17±0.325.86±0.87＊2.7710.0135.17±0.325.18±0.290.1230.903＊与正常组相比，P＜0.05图3.4.2&&&& 2组患儿各时间点血清中IL -6变化的柱状图&3. 血清ACTH水平在术后4h到达峰值后，一直处于高水平状态，术后各个时间点与术前相比，均有统计学意义（P＜0.05）。与动物实验中该指标的变化相似。表3.4.3&& 2组患儿各时间点血清中ACTH的变化( ±s, pg/ml)项目n术后4h术后24h术后48h术后72h正常组对照组tP141482.08±4.74837.68±49.62＊56.7190.00082.08±4.74130.74±13.40＊12.8410.00082.08±4.74123.74±4.82＊23.0570.00182.08±4.74118.57±6.33＊17.2760.002＊与正常组相比，P＜0.05图3.4.3&& 2组患儿各时间点血清中ACTH变化的柱状图&&&讨论&& 应激（stress）是指机体在受到各种因素刺激时所出现的非特异性全身反应［1］。本文主要研究手术创伤这种非良性应激。应激时，神经-内分泌系统反应较敏感，其最基本的表现是以蓝斑-去甲肾上腺素能神经元/交感-肾上腺髓质轴（LC/NE)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）的强烈兴奋为代表的神经内分泌反应［2,3］。其中，HPA轴的作用更为显著。HPA轴兴奋释放的中枢介质为促肾上腺皮质激素释放激素（ CRH ）和ACTH，CRH最主要的功能是刺激ACTH的分泌进而增加糖皮质激素(GC)的分泌，而GC中最主要的是Cor［4］。机体创伤对免疫系统的影响也是很大的［5-8］。IL-6与其受体结合后启动复杂的细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录的变化，起到刺激造血、促进血管生成、抗细菌、抗病毒、调节特异性免疫等作用［9］，可以促进炎症急性期的反应［10］。IL-6可以影响Cor的释放，进而与HPA轴相互作用［11］。实体肿瘤患儿因其自身的特殊性，在手术前后是否会出现这些变化，以及具体怎样的变化是本研究的重点。本实验通过对日本大耳白幼兔脾脏切除术术前、术后血清ACTH、Cor和IL-6含量和实体肿瘤手术患儿的术前、术后血清ACTH、Cor和IL-6含量的研究，动态监测其变化，旨在找到实体肿瘤患儿的手术应激中的有一定变化规律的指标。1、大耳白幼兔血清中Cor和ACTH的变化规律及意义本研究的动物实验结果中可以看出， 14只日本大耳白幼兔血清Cor于术后4h开始升高，在术后24h到达峰值，后开始下降。在术后4h，2组相比，P =0.000，在术后24h，2组相比，P =0.000，术后48h，2组相比，P=0.004，均有统计学意义。直到术后72h，2组相比，P=0.064，日本大耳白兔血清中Cor的含量为84.27 ng/ml ，接近正常组的水平。大耳白兔血清中ACTH水平在术后4h到达峰值，后一直处于较高水平，2组在4个不同时间点的对比，P＜0.05，在术后72h，对照组为60.01 pg/ml，仍远远高于正常组的41.86 pg/ml。但具体它的高水平状态能持续到术后几天，有待于以后的进一步研究。成人颅脑损伤的研究中，ACTH的高水平可持续到术后4个月。当机体受到各种有害刺激，如缺氧、创伤、手术、饥饿、疼痛、寒冷以及精神紧张、沮丧和焦虑不安等，人体内的化学成分即有变化［13］，以适应变化了的外界条件［14］。应激对CNS的影响下［15］，二者均有变化，表现在血中ACTH浓度立即增加，Cor也相应增多［16］。在这一反应中，除垂体-肾上腺皮质系统参加外，交感-肾上腺髓质系统也参加，生理学家Cannon最早全面研究了交感-肾上腺髓质系统的作用，曾提出应急学说（emergency reaction hypothesis），认为机体遭遇特殊情况时，包括畏惧、剧痛、失血、脱水、乏氧、暴冷暴热以及剧烈运动等，这一系统将立即调动起来，儿茶酚胺（去肾上腺素、肾上腺素）的分泌量大大增加。实际上，引起应急反应的各种刺激，也是引起应激反应的刺激，当机体受到应激刺激时，同时引起应急反应与应激反应，两者相辅相成，共同保持平衡着机体的适应能力［17］。也就是说，应激时，垂体释放ACTH增加，导致血液中GC增多［18］，并产生一系列反应，以HPA轴的活动增强为主，提高机体对应激刺激的耐受和生存能力，同时NE轴的活动也增强，血液中儿茶酚胺的含量增加。可以认为，应激反应是一种以ACTH和GC分泌增加为主，多种激素共同参与的使机体抵抗力增强的非特异性反应。在应激刺激下，下丘脑、腺垂体、肾上腺皮质和GC间存在着长反馈和短反馈，即GC浓度升高时，反馈性抑制下丘脑CRH神经元和腺垂体ACTH神经元的活动；ACTH的浓度升高也可反馈性抑制CRH神经元的活动。但应激时，长反馈的调节被抑制，甚至消失，综合作用下，表现为血液中ACTH和GC水平浓度升高。2、实体肿瘤患儿血清中Cor和ACTH的变化规律及意义14例实体肿瘤患儿血清中Cor和ACTH的变化与动物实验中二指标的变化相仿，血清中Cor含量在术后72h降至23.38 ng/ml，接近正常组的含量；血清中ACTH的含量在术后72h为118.57 pg/ml，而正常组为82.08 pg/ml，高于正常组。这说明，手术应激对机体的变化也适用于实体肿瘤患儿。这些变化产生的原因，一方面是上文中提出的神经-内分泌系统的作用，这个系统在应激反应时，在动物体内变化明显，在人体内也有同样的变化。另一方面可能是参加本研究的患儿均为实体肿瘤患儿，年龄为3—6岁，原始胚胎残留组织在体内存在的时间较长，引起患儿出现疑似感染的症状，如发热、贫血、白细胞升高、局部压痛等。长期的慢性疾病对体内的内分泌系统已经造成了一定的影响［21，22］，这些患儿年龄在3—6岁，处于学龄前期，与成人相比，其免疫系统抵御外界的能力还是比较弱的［23］，加之手术创伤的作用，加重了体内的神经-内分泌系统的紊乱。学龄前期的小儿，非特异免疫中很多成分都弱于成人，小儿的趋化因子的浓度低下，调理素不足，造成吞噬作用低下。同时血清中备解素含量亦较低下, 减弱了由补体介导的溶菌、杀菌和抗病毒、抗感染方面的作用。另外，小儿内分泌腺发育不全，分泌物所含的溶菌酶、粘多糖等抗微生物成分较少，故易引起皮肤、眼、呼吸道及胃肠道的感染。小儿特异性免疫的非特异性致酶源植物血凝素 （PHA）已能发生明显的迟发型超敏反应，说明细胞免疫功能已发育，但其功能尚未成熟，不能抵御某些细胞内溶物的病原体感染。小儿外周血活性T细胞数较成人低，从而影响了淋巴因子的释放，对于巨噬细胞的激活、抵制病毒复制和排除细胞内的病原体都是不利的。另外，患儿在手术前后的情绪变化和人体血清Cor水平的日节律波动等都会给所测指标的一定的影响。学龄前期的小儿已经有了一定的认知能力，术后疼痛和医护人员的操作对他们的心理会有所影响。人体血清Cor的分泌有昼夜节律波动，上午8时浓度最高，午夜2时浓度最低。ACTH的分泌规律也呈现昼夜节律波动，上午6-8时为分泌高峰，午夜22-24时为分泌低谷。ACTH分泌的这种日节律波动，是由下丘脑CRH节律性释放所决定的。由于ACTH分泌的日节律波动，促使糖皮质激素的分泌也出现相应的波动，即导致了Cor的分泌节律性。手术创伤早期，应激反应使血清 Cor升高，血清中含量稍高的Cor对机体具有抗炎、消肿的作用 ,有利于组织修复。但Cor能使糖异生增加及组织分解 ,其水平持续升高 ,可因高分解代谢导致负氮平衡,反而严重影响机体的修复过程［20］。Cor又能抑制白细胞的趋化作用 ,因此持续高水平 Cor不利于机体的抗感染效应的发挥 ,而导致患儿术后继发感染的可能性增加 ,不利于组织的修复。说明血清 Cor水平的下降实际上对患儿具有一定的保护作用 ,降低感染率 ,但确切机理尚不明确。ACTH在应激反应的急性期变化很快，在本研究中，术后4h血清中的ACTH含量大约为术前含量的十倍。其高水平状态持续很长，本研究中到术后72h，仍高于术前水平。以往的研究结果显示，ACTH的高水平状态可持续到手术后4个月。3、大耳白幼兔血清中IL-6的变化规律及意义从本文的动物实验结果可以看出，14只日本大耳白幼兔的血清IL-6水平于术后即开始显著升高，术后4h到达峰值，为120.73μmol/l，然后开始下降。在术后4h和术后24h，正常组与对照组相比，P值分别为0.000和0.004，术后48h和术后72h，大耳白幼兔血清IL-6含量接近于正常组的72.36μmol/l，P值分别为0.462和0.697 。这些变化，一方面与手术切除脾脏有关，因脾脏参与免疫，涉及特异和非特异性，细胞核体液的防御反应，脾脏也是淋巴细胞居留和增殖的场所，含有T细胞，B细胞和NK细胞，并产生免疫球蛋白，补体，调理素等免疫成分。脾脏切除后，会对体内的细胞免疫产生一定的影响。另一方面，也说明细胞因子在手术创伤引起的应激反应中变化迅速，在术后4h就能快速升高峰值，在48h内又降至术前水平。可以认为IL-6是提示机体免疫系统改变比较敏感的指标。4、实体肿瘤患儿血清中IL-6的变化及意义14例实体肿瘤患儿血清IL-6于术后开始显著升高，在术后4h到达峰值23.59 pg/ml& ，后开始下降，术后24h内波动变化较大，在术后72h时为5.18 pg/ml& 接近于正常组的5.17 pg/ml& ，此时2组相比，P值为0.903。IL-6是一种由184个氨基酸组成的蛋白质，分子量为21KD，由单核细胞、成纤维细胞核内皮细胞等分泌。急性炎症反应时，IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IL-1β等趋炎因子在机体内的含量迅速升高［24-26］，以对抗炎症反应［27］，病毒、IL-1、TNF、血小板生长因子等都可以诱导IL-6的产生和释放［28］。IL-6也可以引起各种动物的发热反应。以往的动物研究证明，给兔、鼠静脉或脑室内注射IL-6，动物可出现体温明显升高，用IL-1β抗血清阻断发热的同时，也抑制了血浆中IL-6的增多。TNF和IL-1β都能诱导IL-6的产生，而IL-6则下调TNF和IL-1β的表达。蛋白激酶C激活途径和cAMP依赖途径对IL-6基因表达有重要调节作用。IL-6可促进B细胞的增殖分化，诱导成熟B细胞分泌抗体，还可促进T细胞分化，也可协同其他细胞因子，促进造血细胞的增殖，诱导粒细胞和巨噬细胞的成熟，使免疫系统在应激反应中快速发生变化［29］，机体通过对免疫系统的精细调节，使机体的内环境达到一种新的平衡。在急性应激反应下，细胞因子在短时间内即可大量快速地释放［32,33］，并可表现出以下几个方面的生物学活性：抗菌作用，调节特异性免疫，刺激造血，促进血管生成，促炎，抗炎等［34］。感染时，细菌刺激感染部位的巨噬细胞释放IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等，这些细胞因子随即启动对细菌的攻击 [35,36]。如IL-1激活血管内皮细胞，促进免疫系统的效应细胞进入感染部位，并激活淋巴细胞。IL-6可激活淋巴细胞，促进抗体的生成。IL-8趋化中性粒细胞和T细胞，使其进入感染部位。IL-1和IL-6还可以引起发热反应。上述错综复杂的细胞因子的协同作用构成了一种重要的防卫体系［37-39］。在免疫应答识别和激活阶段，有多种细胞因子可刺激免疫活性细胞的增殖，如IL-4、IL-13合IL-6等，刺激B淋巴细胞的增殖［40］。细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子受体根据其结构和信号转导途径可分为Ⅰ型细胞因子受体、Ⅱ型细胞因子受体、肿瘤坏死因子受体和趋化性细胞因子受体等不同的家族或超家族。IL-6、 IL-9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5等细胞因子的受体均属于Ⅰ型细胞因子受体家族。许多细胞因子如IL-1、IL-6等的受体有游离的形式即可溶型细胞因子受体。可溶型细胞因子受体可以作为相应细胞因子的运载体，也可与相应的膜型受体竞争配体而起到抑制作用，因此，2008年，Hayrettin Ozturk提出，检测某些可溶型细胞因子的水平有助于某些疾病的诊断，对病情的发展和转归也可进行监测[31]。5、动物和人体研究结果的共同点对两部分的研究结果做对比可以看到，血清中Cor和IL-6在术后72h能够降至正常水平，而血清中ACTH水平在术后72h内一直高于正常组，P值均小于0.05，可以这样认为，手术创伤引起了血清ACTH短时间内大量的释放，术后即开始，在术后24h后，变为缓慢释放，持续到术后72h，或许更长时间。说明，应激引起血清ACTH的长时间释放，手术创伤没有完全消失的情况下，其释放量仍较基础水平高。ACTH的含量变化，只能提示机体是否还处于应激状态。血清ACTH水平没有出现类似血清Cor改变的情况，有可能是因为在应激刺激下，下丘脑、腺垂体、肾上腺皮质和Cor间存在着长反馈和短反馈，即Cor浓度升高时，反馈性抑制下丘脑CRH神经元和腺垂体ACTH神经元的活动；ACTH的浓度升高也可反馈性抑制CRH神经元的活动。对14例患儿的研究中还发现了一个现象，有4例患儿在术后7天左右出现肠梗阻、溃疡性大出血、重症感染等并发症。恢复欠佳的这4例患儿，在术后72h内的动态监测中有一个共同点，即术后各个时间点，其血清中Cor和IL-6的含量较均值高。术后72h时，4例患儿的血清中Cor的含量为30.75 ng/ml，仍高于此时的均值23.38 ng/ml ，血清中IL-6的含量为6.04 pg/ml，仍高于此时的均值 5.18 pg/ml。而4例患儿血清中ACTH水平没有这个特点。可以认为，血清中Cor和IL-6可作为推测学龄前期实体肿瘤患儿愈后的敏感指标。在临床上，我们可以尝试使用 CRRT（肾脏连续替代治疗）来清除这两种炎症介质，防止其产生级联放大效应，可以从根本上减轻患儿的全身炎症反应。早期在对手术创伤的研究上，手术种类多局限于成人颅脑手术和胸外手术上，很多学者提出创伤后血清中Cor持续高水平是机体病情严重的重要标志［19］。通过本研究，可以认为，血清中Cor和IL-6的持续高水平是学龄前期实体肿瘤患儿病情严重的重要标志。6、手术应激和应激性疾病本研究中，14例患儿的手术均为开腹手术，时间较长，120min±20min，手术分级根据P-POSSUM评分系统，分值小于
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