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- 生物医学工程
人工真皮――胶原+6-硫酸软骨素膜的制作及部分性能测定
生物医学工程学杂志 1999年第2期第16卷 论著
作者：李孝建　史济湘
单位：（李孝建）广州市红十字会医院，广州　510220；（史济湘）上海第二医科大学 附属瑞金医院，上海　200025
关键词：胶原；6-硫酸软骨素；戊二醛
　　摘要　用酸溶解法从鼠尾腱中提取I型胶原，与6-硫酸软骨素按一定比例混合后，经过冷冻干燥、戊二醛交联等步骤制成人工真皮―胶原+6-硫酸软骨素膜。制成的人工真皮为半透明薄膜。扫描电镜观察其内部为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm。性能测定发现该人工真皮与创面具有良好的粘附性，经戊二醛交联后，体外降解速率得到明显控制。
Formation and Characteristics of an Artificial Dermis――
　　Collagen-Chondroitin-6-Sulfate Membrane
　　Li Xiaojian　Shi Jixiang
　　Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou　510220
　　Ruijing Hospital Attached to shanghai second Medical University,Shanghai　200025
　　Abstract　In this study, we extracted type-I collagen from rat tail tendon with acetic acid and then mixed it with chondroitin-6-sulfate to form a collagen-chondroitin-6-sulfate membrane by freeze drying and crosslinking. The result showed that the collagen-chondroitin-6-sulfate membrane was semitransparent, with a network structure, and the pore size was about 100-150μm. It was also demonstrated that the “dermis” achieved a good adherence to wound and the degradation rate in vitro was markedly decreased by glutaraldehyde crosslinkage.
　　Key words　Collagen　　Chondroitin-6-sulfate　　Glutaraldehyde
　　近十几年来，复合移植方法覆盖Ⅲ度烧伤切痂创面越来越受到人们的重视，其中理想的真皮成份甚为重要。我们参照Yannas［1］的方法以改进制成的人工真皮具有组织相容性好、创面粘附力强、不易被降解吸收等优点，而且内部为有适宜孔径大小的网状结构，能诱导创面新生真皮的再生。现将制作方法及部分生物物理性能介绍如下。
　　1　材料和方法
　　1.1　胶原+6-硫酸软骨素膜的制作
　　取大鼠尾数根，去皮后抽取尾腱50 g，剪碎置入锥形烧瓶内，加入0.05 M乙酸200 ml，4℃冰箱放置4 d。4 ℃，16，000 rpm离心1 h，弃沉淀。在上清液中加入NaCl，使NaCl最终浓度为5%，见有白色絮状沉淀析出后，4 ℃，8，000 rpm离心30 min，弃上清。沉淀物用0.05 M乙酸溶解后，重复上述盐析步骤二次，沉淀物再用0.05 M乙酸溶解，置于0.02 M Na2HPO3中透析3天，即为精制胶原。
　　精制胶原与6-硫酸软骨素(Sigma)按10∶1比例均匀混合，取混合液15 ml，置于直径9 cm玻璃平皿内，-60 ℃冰冻后，于-55℃，3.9×10-5 KPa下冷冻抽干。抽干后样品置于0.25%戊二醛(pH：3.2)溶液中交联24 h，再于蒸馏水中浸泡24～48 h，自然晾干即成。
　　1.2　部分性能测定
　　1.2.1　形态及结构观察　观察其外观性状，并在扫描电镜下观察其内部结构。
　　1.2.2　粘附性能测定　按朱德安等［2］介绍的方法，用岛津GA型材料试验机作垂直剥离强度测定，得出创面粘附力。
　　1.2.3　体外酶降解试验　将1 mg胶原+6-硫酸软骨素膜样品置入盛有1.9 ml Stock缓冲液的试管中，并加入新配制的0.1 ml，100 Units胶原酶溶液。试管置于37 ℃恒温振荡器中，控制转速为10 rpm，分别于24、48、72、96 h后测定上清液中羟脯氨酸浓度［3］。
　　2　结　果
　　(1)制成的胶原+6-硫酸软骨素膜为半透明薄膜，厚度为0.1 mm，具有一定抗张强度。扫描电镜观测的内部结构见图1：
图1　人工真皮的扫描电镜结构
　　Fig 1　Scanning Electron Microscope structure of the artificial dermis
　　(2)胶原+6-硫酸软骨素膜与创面的粘附力见表1：
表1　人工真皮与自、异体皮粘附力的比较
　　Table 1　Adhesion of artificial dermis compared with that of autologous skin and allogenic skin
Adhesion of
　　5 hous(g)
Adhesion of
　　72 hours(g)
Autologous skin
Allogeneic skin
Artificial dermis
　　* Compared with autologous skin and allogeneic skin
　　P＞0.05
　　(3)未交联及不同交联时间的胶原+6-硫酸软骨素膜的体外降解试验结果见表2：表2　未交联与交联不同时间的人工真皮体外降解结果的比较
　　Table 2　In vitro degradation results of non-crosslink artificial dermis compared with that of crosslink artificial dermis in different time
Concentration of hydroxyproline(ug/ml)
Non-crosslink
Crosslink 2 h
Crosslink 24 h
　　* Compared with Non-crosslink P＜0.001；△Compared with Crosslink 24 h　P＜0.053　讨　论
　　(1)从组织中提取的胶原可以由多种方法制成膜，报导的有盐析成膜、氨熏成膜及冷冻干燥成膜等。不同的成膜方法对内部结构的影响较大，而内部结构的差异直接影响其性能。理想的人工真皮，其内部结构应是具有一定大小孔径的网状结构，以利于组织的成纤维细胞和毛细血管的侵入。Doillon等［4］曾研究在不同的pH条件下加入糖胺多糖以及在不同的冷冻温度下制成的胶原+6-硫酸软骨素膜，其内部孔径大小经光镜和扫描电镜观察有明显差异。因此，选用合适的成膜方法及条件非常重要。本研究用鼠尾I型胶原，在pH3.2的条件下加入6-硫酸软骨素，-55 ℃冷冻抽干制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经扫描电镜观察，为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm之间，比较符合人工真皮的内部结构要求。此外，单纯胶原蛋白制成的膜常缺乏弹性，且易碎［5］，加入糖胺多糖成份(如6-硫酸软骨素、透明质酸等)后，可以增加其韧性和弹性。
　　(2)控制人工真皮在体内的被吸收率及降解速率也是非常关键的。即人工真皮必须在移植后保持其网状结构一段时间，以支持组织细胞和血管的侵入。60年代曾有人用胶原替代骨移植，但因植入物很快被降解而达不到预期效果。我们制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经戊二醛交联后，在体外胶原酶降解条件下，通过检测胶原降解的特有产物羟脯氨酸浓度，发现其降解速率得到明显控制。至于这种人工真皮在体内降解速率如何，尚待进一步研究。
　　(3)作为直接贴附创面的人工真皮，除具有适当的孔径及生物降解性能外，还应与创面有良好的粘附性，防止与创面之间产生间隙，积聚体液而诱发感染。我们制作的人工真皮与创面的粘附力，经过检测与自体皮、异体皮均无显著差异。
　　参考文献
　　1　Yannas IV, Burke JF, Gordon PL et al. Design of an artificial skin. Ⅱ:Control of composition. J Biomed Mater Res, 7
　　2　朱德安，曹启栋.洗必泰酒精冷藏猪皮――一种简单长期的保存猪皮.中华整形烧伤外科杂志，3
　　3　李玉瑞，主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，
　　4　Doillon CJ, Whyne CF, Brandwein S et al. Collagen-based wound dressings :control of the pore structure and morphology. J Biomed Mater Res, 19
　　5　Basil A, Pruitt BA, Levine NS. Characteristics and uses of biological dressings and skin substitutes.Arch Surg,2
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