正常妊娠妇女外周血可溶性白细胞介素－2受体及淋巴细胞亚群的变化--《中华妇产科杂志》1994年09期
正常妊娠妇女外周血可溶性白细胞介素－2受体及淋巴细胞亚群的变化
【摘要】：测定了８７例妊娠晚期及２９例正常非孕妇女外周血可溶性白细胞介素－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平，同时对其中３６例孕妇及１０９例正常非孕妇女（正常对照）进行外周血淋巴细胞亚群检测。结果：妊娠晚期妇女ｓＩＬ－２Ｒ水平及Ｔｓ细胞（ＣＤ＿８）明显高于正常对照，分别为：２１４６００±７０４００Ｕ／Ｌ比１６２１００±８４１Ｄ０Ｕ／Ｌ，　Ｐ＜０．０１及３７．６％±５．３％比３１．３％±７．０％，Ｐ＜０．０１。妊娠妇女Ｔｈ细胞／Ｔｓ细胞（ＣＤ＿４／ＣＤ＿８）比例明显低于正常对照（１．２±０．２比１．５±０．５，Ｐ＜０．０１）。但总Ｔ淋巴细胞（ＣＤ＿３），ＣＤ＿４，细胞与正常对照相比，差异无显著性，分别为：６４．１％±７．３％比６６．０％±９．９％，Ｐ＞０．０５及４４．１％±５．８％比４３．８％±９．Ｏ％，Ｐ＞０．０５。相关分析表明孕妇ｓＩＬ－２Ｒ水平与ＣＤ＿３、ＣＤ＿４、ＣＤ＿８细胞及ＣＤ＿４／ＣＤ＿８均无显著相关性（ｒ分别为０．２０３２，０．２０７７，０．１０３７及０．１２１４，Ｐ均＞０．０５）。提示：孕妇外周血Ｔ淋巴细胞亚群及血清ｓＩＬ－２Ｒ的变化对维持正常妊娠有重要作用，ｓＩＬ－２Ｒ可能是促进胎儿正常生长的重要介质之一。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R714.3【正文快照】：
正常妊娠妇女外周血可溶性白细胞介素－２受体及淋巴细胞亚群的变化刘春兰，许怀英，刘颖，高之睦，张言超，周连凤摘要测定了８７例妊娠晚期及２９例正常非孕妇女外周血可溶性白细胞介素－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平，同时对其中３６例孕妇及１０９例正常非孕妇女（正常对
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京公网安备74号鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究--《四川农业大学》2006年博士论文
鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究
【摘要】：
随着养殖业向集约化和管理向人性化发展，口服疫苗逐渐成为研究的热点和重点，乳酸杆菌是肠道正常的益生菌，具有天然的抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用。利用基因工程手段，将乳酸杆菌开发成为具有特定功能的基因工程菌，使其在肠道分泌抗原蛋白以达到免疫的目的。本研究以较为保守的鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)VP3基因为抗原基因，同时为了更好地提高免疫效果，将鹅白细胞介素-2(Intedeukin-2，IL-2)成熟蛋白基因IL2c与VP3基因融合，并使其在乳酸杆菌中得到良好表达，为研制鹅IL-2增强鹅细小病毒VP3乳酸杆菌口服基因工程疫苗准备了材料。
1．为了探索乳酸杆菌在鹅养殖业中的应用，首先本研究对鹅肠道乳酸杆菌进行了调查，结果表明雏鹅在20日龄时肠道的乳酸杆菌已达到较高的水平，最高可达10~8CFU／g。分离鉴定了15株乳酸杆菌，分别属于旧金山乳杆菌、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌、类高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、双发酵乳杆菌、小鼠乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和棒状乳杆菌棒状亚种。通过耐酸和耐胆盐试验表明L2和L8两株乳酸杆菌具有较强的耐受性，质粒检测均没有发现有质粒存在。
2．根据GenBank上注册的短小乳酸杆菌(L．brevis)S-层蛋白基因序列设计一对引物，采用PCR法获得了S-层蛋白信号肽基因，将其克隆到pMD18-T载体并测序。序列分析表明序列全长为352bp，其中编码信号肽部分的90bp的碱基与GenBank中Z14250的完全相同，生物信息学分析也表明这是一段信号肽基因，氨基酸序列分析也表明它具备信号肽的典型特征，结果表明本试验克隆得到了短小乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因。
3．根据GenBank中的鹅细小病毒B株全基因序列，设计合成一对引物，应用PCR技术扩增了鹅细小病毒强毒CHv株的VP3基因片段，将扩增后的VP3基因重组到pUC57载体上，并对插入片段进行序列测定，将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主来源的细小病毒的VP3进行生物信息学比较及分析。结果表明，我国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1605bp，编码534个氨基酸，与国内外10株GPV的VP3基因进行比较，核苷酸同源性为93.4％-99.8％，氨基酸同源性为96.5％～99.3％，变异较小，是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％和89.9％，而与其它种属的细小病毒同源性均在30％以下，表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。生物信息学分析表明它是一种疏水性的、稳定的、有强抗原性的膜外蛋白，有3个潜在的糖基化位点。
4．参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列，设计了一对引物，采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出了鹅IL-2基因，并进行了克隆和测序。结果显示鹅IL-2基因全长468bp，含有一个441bp的ORF区，编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点，1个糖基化位点，含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与浙江白鹅的同源性极高，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8％和100％，与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性分别为92.2％、77.5％、78.2％和85.8％、65.5％、64.1％，而与其它种属的哺乳动物及啮齿类动物(如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿)的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分别低于45％和28％，进化树分析也表明四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲源关系。成熟蛋白IL2c基因全长为407bp，含有一个378bp的编码区，编码126个氨基酸。
5．首先通过酶切连接和PCR方法将SP基因与VP3基因连接，然后再利用酶切连接的方法通过在引物上加上一个由GSGGSGG 7个氨基酸组成的短肽将VP3基因与IL2c基因连接，从而构建成了VP3-IL2c的融合蛋白基因。将该融合基因连接到乳酸杆菌表达载体pMJ67中，获得了重组的分泌性表达载体pMJ-SP-VP3-IL2c，通过电转化方法，将其转化到乳酸杆菌L．casei，通过乳糖诱导，成功表达了融合蛋白，SDS-PAGE结果显示在约76kD处有一特异性条带，其分子量与融合蛋白基因所推导的蛋白质分子量相符。并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导剂的浓度为0.5％，诱导剂加入时间为OD_(600)=0.5，诱导时间为20h时，可得到最高表达量。用兔抗GPV阳性血清进行West-blotting试验表明该重组表达的融合蛋白对GPV具有较好的免疫原性。采用Sepharose 4B琼脂糖凝胶为填料对重组表达蛋白进行分子筛层析，得到了纯度较高的重组蛋白。采用MTT法测定IL2c蛋白的活性，试验结果表明表达后的VP3-IL2c融合蛋白的淋巴细胞增殖系数可达3.84，表明IL2c蛋白具有生物学活性。
【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2006【分类号】：S852.5【目录】：
中文摘要11-14
英文摘要14-17
缩略词17-18
第一部分 文献综述18-34
第一章 乳酸杆菌表达系统的研究状况18-24
1 乳酸杆菌表达载体的优点18-19
2 乳酸杆菌质粒19
3 乳酸杆菌质粒的选择性标记19-21
4 乳酸杆菌基因工程菌的应用21-23
5 面临的挑战23-24
第二章 鹅细小病毒结构蛋白的研究现状24-28
1 结构蛋白的分子生物学特征24-26
2 结构蛋白的体外表达26-28
第三章 融合蛋白表达技术研究进展28-34
1 融合蛋白的构建方式28-30
1.1 自我融合29
1.2 C端或N端融合29
1.3 双亲和融合29
1.4 信号肽与目的蛋白的融合29
1.5 分泌-亲和融合29
1.6 分泌-粘附融合29-30
2 融合蛋白的连接30-34
2.1 直接相连31
2.2 稀有碱基相连31
2.3 柔性肽相连31-34
第二部分 实验研究34-124
第四章 鹅肠乳酸杆菌的调查、分离鉴定及筛选34-42
1 材料34-35
1.1 鹅粪便34
1.2 菌种34
1.3 试剂34-35
1.4 主要仪器35
2 方法35-37
2.1 正常鹅肠道乳酸杆菌调查35
2.2 样品的采集35
2.3 乳酸杆菌的分离35
2.4 乳酸杆菌的纯化35
2.5 乳酸杆菌的鉴定35-36
2.6 耐酸性试验36
2.7 耐胆盐试验36
2.8 乳酸杆菌质粒检测36-37
3 结果37-40
3.1 鹅肠道乳酸杆菌调查结果37
3.2 乳酸杆菌鉴定结果37-39
3.3 乳酸杆菌耐酸性试验结果39-40
3.4 乳酸杆菌耐胆盐试验结果40
3.5 质粒检测结果40
4 讨论40-41
5 小结41-42
第五章 乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因的克隆及序列测定42-54
1 材料42-43
1.1 菌种和质粒42
1.2 主要试剂42
1.3 配制试剂42-43
1.4 主要仪器设备43
2 方法43-47
2.1 引物设计43-44
2.2 L.brevis基因组DNA的提取44
2.3 PCR扩增L.brevis S-层信号肽(SP0)44-45
2.4 SP0基因的纯化45
2.5 JM109感受态细胞的制备45-46
2.6 纯化的SP0基因与pMD18-T的连接46
2.7 转化感受态细胞46
2.8 质粒的提取46-47
2.9 重组质粒的酶切鉴定47
2.10 SP0基因序列测定及分析47
3 结果47-50
3.1 PCR扩增47-48
3.2 重组质粒的酶切鉴定48
3.3 SP0测序结果48-49
3.4 生物信息学分析结果49-50
4 讨论50-52
5 小结52-54
第六章 鹅细小病毒VP3基因的克隆、测序及分子特性分析54-70
1 材料54-55
1.1 病毒54-55
1.2 载体55
1.3 鹅胚55
1.4 试剂55
1.5 主要仪器55
2 方法55-58
2.1 引物设计55-56
2.2 病毒核酸的提取56
2.3 VP3基因PCR扩增56
2.4 PCR产物回收56
2.5 纯化产物酶切56-57
2.6 回收57
2.7 连接57
2.8 转化57
2.9 质粒的提取57
2.10 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定57-58
2.11 VP3基因序列测定58
2.12 VP3序列及推导蛋白质的生物信息学分析58
3 结果58-67
3.1 PCR扩增58-59
3.2 重组质粒的筛选及鉴定59
3.3 VP3编码基因的序列测定及同源性比较59-63
3.4 VP3基因推导氨基酸同源性比较63
3.5 系统进化树分析63-64
3.6 疏水性分析结果64-65
3.7 抗原性分析结果65
3.8 跨膜区预测结果65
3.9 磷酸化位点预测结果65-66
3.10 N-糖基化位点预测结果66-67
3.11 二级结构预测结果67
4 讨论67-69
5 小结69-70
第七章 鹅白细胞介素-2基因及其成熟蛋白基因IL-2c的克隆、测序及生物信息学分析70-88
1 材料70-71
1.1 实验动物70
1.2 菌株和质粒70
1.3 酶及试剂70-71
2 方法71-76
2.1 IL-2基因的克隆71-75
2.2 IL-2成熟蛋白基因(IL2c)的克隆75-76
3 结果76-85
3.1 RT-PCR结果76
3.2 四川白鹅IL-2基因的酶切鉴定结果76-77
3.3 IL-2序列测定结果77-78
3.4 IL-2基因同源性比较及遗传进化树分析78-80
3.5 IL-2信号肽预测80-81
3.6 IL-2成熟蛋白基因PCR结果81-82
3.7 pUC-IL2c酶切鉴定结果82
3.8 IL2c序列测定结果82-83
3.9 IL2c疏水性分析83-84
3.10 IL2c抗原性分析84-85
4 讨论85-86
5 小结86-88
第八章 鹅细小病毒结构蛋白VP3基因与鹅IL2c基因分泌性融合表达载体的构建88-106
1 材料88-91
1.1 菌株及质粒88
1.2 酶及试剂88-89
1.3 主要仪器89-91
2 方法91-97
2.1 SPO基因和VP3基因的连接91-92
2.2 SP+VP3基因的获取92-94
2.3 SP-VP3基因与IL-2c融合基因的构建94-95
2.4 分泌性表达载体的构建95-97
3 结果97-102
3.1 SP0与VP3连接97
3.2 SP-VP3基因PCR97-98
3.3 重组质粒酶切鉴定98-99
3.4 SP-VP3基因的序列测定99-100
3.5 pUC-SP-VP3-IL2c重组质粒酶切鉴定100
3.6 重组表达载体的PCR鉴定100
3.7 重组表达载体的酶切鉴定100-102
4 讨论102-104
4.1 构建策略102
4.2 关于酶切位点的选择102
4.3 关于表达载体的选择102-103
4.4 关于融合蛋白的选择103-104
5 小结104-106
第九章 融合表达载体在乳酸杆菌中的分泌表达及其活性检测106-124
1 材料106-107
1.1 菌株及表达质粒106
1.2 酶及试剂106
1.3 主要仪器106-107
2 方法107-112
2.1 乳酸杆菌感受态细胞的制备107
2.2 电转化107-108
2.3 阳性菌株的筛选及鉴定108-109
2.4 融合蛋白在乳酸杆菌中的表达109-110
2.5 表达产物的转印110-111
2.6 表达产物的免疫印迹111
2.7 重组蛋白的纯化111-112
2.8 MTT法检测IL-2的活性112
3 结果112-119
3.1 重组阳性乳酸杆菌的PCR鉴定112-113
3.2 表达产物SDS-PAGE分析113
3.3 表达条件的优化113-117
3.4 重组蛋白的相对表达量117
3.5 表达产物Western-blotting分析117-118
3.6 重组蛋白过柱纯化效果118-119
3.7 表达产物IL2c蛋白活性分析119
4 讨论119-122
4.1 关于电转化119-120
4.2 诱导表达120
4.3 表达条件的优化120-121
4.4 Western-blotting检测121
4.5 MTT法检测IL2c蛋白活性121-122
5 小结122-124
第三部分 结论124-126
第四部分 参考文献126-144
第五部分 附件材料144-154
附录一 主要溶液的配制144-148
附录二 测序图谱148-154
1 pMD-SP0基因测序结果148
2 pUC57-VP3基因测序结果148-150
3 pMD-IL2基因测序结果150
4 pUC-IL2c基因测序结果150-151
5 pMD-SP-VP3基因测序结果151-154
致谢154-156
作者简介156-158
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白血病患者高白细胞血症致血清钾测定假性异常升高2例
来源：检验医学网|作者：安徽省肿瘤医院检验科
钾是人体细胞内的主要阳离子，钾参与机体糖原和蛋白质代谢，维持体液酸碱平衡及渗透压，细胞内钾则保持神经肌肉的应激性及细胞电活动的稳定性，血钾过高会使心肌抑制导致心脏停搏在舒张期；血钾过低心脏会停搏在收缩期。最近，我们发现白血病患者高致血清钾测定假性异常升高2例，现报告如下：
& 项某某，男，2岁，儿童血液科病人。2015年2月我院确诊MDS-RAEB-II，同年5月行干细胞移植成功。近一周，发热，热前无畏寒、寒颤，无相关伴随症状日入院。查体神清扁桃体II&肿大，可见数个白斑附着，考虑：1急行白血病，2扁桃体炎，血白细胞260.57&109，手工分类：原始细胞0.82，髓示：MDS-RAEB-II急髓变；流式细胞免疫分型考虑AML-M5。入院一周，11月8日早上6点分离胶生化管抽血查生化，8点半出结果，仪器：罗氏501型，K：7.64mmol/l,BUN：0.9 mmol/l，CREA：9umol/l, CySc:0.88mgl/l ,UA：213 umol/l，肝功能正常，立即复检吻合后，室内三水平质控在控，电话通知临床血钾危机值。11点临床送分离胶生化管急诊复查电解质，仪器；贝克曼DX800，当天室内三水平质控在控，血钾：9.58 mmol/l ，下午6点，又急诊送检电解质，血钾：10.64 mmol/l，从早上6点到晚上6点，该病人血清钾一直处于危急值，而临床医生密切观察病人状态并无明显异常，心电图正常，考虑，该病人血清钾异常高是否由于高比例原始细胞在体外环境被破坏和释放细胞内钾增多的原因。立即联系临床用肝素抗凝管抽血后由床位医生立即送检，不通过医院运转中心耽搁时间，结果，晚上8点半，肝素抗凝管测定血浆钾：3.96 mmol/l，正常范围。证实该患者高血钾为假性。
& & 武双，男12岁，患儿6年前诊断慢粒细胞白血病，因经济原因未行化疗，口服格列卫2月，口服羟基脲，别嘌醇和碳酸氢钠片降白及碱化维持治疗。8月前自行停药，2-3天前出现间断鼻出血，日门诊拟慢性粒细胞白血病和鼻出血入院。查体神清，轻度贫血貌，恶病质面容。血常规：白细胞572.26&109, 血涂片示原始细胞比例&5%，中幼、晚幼稚粒细胞大于50%，嗜酸、嗜碱细胞易见，12月1日21点分离胶生化管血钾6.68mmol/l,报告危急值，12月2日上午8点分离胶生化管血钾6.27mmol/l,，会诊考虑是否会有假性高血钾存在，10点40分通知临床用肝素抗凝管抽血后由床位医生立即送检，不通过医院运转中心耽搁时间，结果，肝素抗凝管测定血浆钾：3.45 mmol/l，略低于正常范围。证实该患者高血钾同样为假性高血钾。
血钾升高有病理性升高和假性升高，病理性常见原因有肾上腺皮质功能减退、急性或慢性肾功能衰竭、休克、组织挤压伤、重度溶血等病。假性高血钾是指体外检测血清钾高于正常，而体内血钾浓度正常，病人也没有任何高血钾的心电图和临床表现。目前，临床上常见造成血清钾假性升高的原因有：1 用血常规抗凝管采血或标本被EDTA-2K污染，2 抽血不顺利，压脉带过紧且时间较长，患者反复攥拳头等使细胞去极化，导致血清钾升高，3 离心分离标本处置不当，造成血细胞破坏，内钾释放，使血钾升高，4 低温保存的标本，糖酵解减低，ATP生成减少，进一步抑制NA-K-ATP泵，使细胞内钾外漏，5 患者在补钾时，同侧取血导致血钾异常增高，以上原因均可通过重新正常采血，规范操作解决。
& &本文报道的2例白血病患儿并发血清钾测定假性异常升高，均排除上述5种原因。高血钾标本均为用带分离胶生化管，正常规范采血，由医院标本运转中心到护士办取来后送到检验科，标本外观无溶血 。检验科收到标本后按照正常流程操作：血钾高，检查质控在控，复查标本一致，危机值及时联系临床，而临床医生看到危机值高血钾结果，既紧张怕病人出现意外，但是观察病人无高钾表现时又十分困惑。该患者最后被想到为假性高血钾还因为了解到该病人血常规为高原始白细胞时才最终得以确诊。
关于白血病患者外周血白细胞高会导致假性高血钾现象，目前国内文献自1986年来零星报道可以在髓细胞白血病、淋巴细胞白血病和血小板增多症患者中发生：缪大敏1986年在慢粒急变M4的患者中发现1例，曹维彬2006年报道M1患者1例，李加平2010年报道急性髓细胞白细胞1例，徐娟1999年在慢粒患者中发现，刘春在2009年在河北医药杂志报道2例，其中1例是慢粒，另外1例是血小板增多症；温奕欣报道在急淋病例中血清钾采用抗凝处理后血钾由5.8 mmol/l下降到4.23 mmol/l。分析原因多数认为是白血病人的白血病细胞的脆性增大，大量白细胞在体外受到摇晃和环境改变即可释放钾；血小板增多症患者血液中大量的血小板在体外凝集过程中释放钾离子而致。作者回顾分析了我院2015年4月到9月共有9例白细胞大于100&109/白血病病例，但均未发现血钾增高现象，反而出现3例低血钾现象，推测出现上述现象的发生相对少见，是否会与该白血病病人的疾病分型、后期治疗和预后有关系，未见报道难以判断，有待以后进一步追踪。
综上，检验科医生在碰到结果异常时，不能习惯思维认为规范操作、当天质控在控、室内复查一致就行了。其实随着现代科学技术的发展和准入制度的严格执行，许多检验设备和试剂都有较好的质量保证，检验科医生要转变观念，多学习疾病诊断知识，主动联系临床，试着从一名实验诊断医生的角度，结合病人的疾病状态和用药情况来分析、处理问题，避免误诊、漏诊发生，对不能解释的异常结果找出实验干扰的实际原因，帮助临床医生获得真实的结果，化检验数据为有用的临床诊疗信息，切实提高检验医师在临床疾病诊疗中的作用。
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