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实验药理学
适用课程:&药理学实验(1000092)【访问量：47898】
丹参酮Ⅱ-A磺酸钠抗心律失常、心肌缺血作用机制研究
指导老师：丁虹教授、王
试验人：武汉大学药学院2005级本科生（孙锦、熊为佳、邹先勇、吴
萌、李杨燕）
一、背景阐述
以高血压、脑卒中和冠心病为代表的心脑血管疾病，严重危害人类健康，被称为"人类健康的头号刽子手"。1997年，世界卫生组织（WHO）关于1996年全球各种疾病的死亡统计显示，冠心病、脑卒中和其它心脏病死亡人数共计1400万，占总死亡人数的28.8%。据统计，到2010年由心脑血管疾病致死的人数占总死亡人数的比例将会上升到36.0% 1998年全球各种疾病死亡人数统计中，因冠心病死亡的人数为720万，位居第一，占死亡总人数的13.85%。而且，就国内而言，统计数据表明，国内冠心病的发病率平均86.50人/10万，国内不稳定心绞痛发病率93.81人/10万。而心律失常和心肌缺血是心血管系统疾病发病的基础和常见的临床表现特征，也是临床心血管病造成死亡的原因之一。美国的流行病学研究发现，75％的心力衰竭患者合并有心律失常，并且50％心力衰竭患者死于心律失常。天津“丹参酮滴丸”及其他省市某些中药制剂经美国FDA批准进入临床验证，几年后将进入美国市场.心律失常的定义，心肌缺血的定义发病机理
对于心律失常来说，目前临床治疗心律失常药物分为四类，包括钠通道阻滞剂、β受体拮抗剂、延长动作电位时程药物和钙通道阻滞剂。而目前临床治疗心肌缺血的药物主要有硝酸酯类及亚硝酸酯类、肾上腺素β受体阻断药、钙拮抗药类。
目前，临床上以上的药物外，中药制剂也在发挥作用。丹参酮就是其中之一。
药品简介：
丹参酮Ⅱ-A为樱红色针状结晶，它从活血化淤药物丹参中提取。研究发现，丹参具有良好的抗冠心病作用。其有效成分主要是丹参素(p-3，4二羟基苯基乳酸)及丹参酮。
30-40年代初，日本学者中尾万三、Nakao和Takiura先后从丹参酮的乙醇或乙醚提取物中分离得到三种红色结晶，分别命名为丹参酮Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；泷浦洁证实丹参酮Ⅱ为Ⅱ-A和Ⅱ-B的混合物；60年代，Kakisawa确定了丹参酮Ⅱ-A的结构式；1968年，Baidlre等人合成了丹参酮Ⅱ-A。
而丹参酮Ⅱ-A经磺化后便得到的丹参酮Ⅱ-A磺酸钠，用它做成的灭菌水溶液，大大增强了药物的水溶性，获得了更高疗效的新药物。
1.2其心血管系统相关的药理及功能：
（1）抗动脉粥样硬化作用：碱性纤维母细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖模型上 ,用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法观察该药对 DNA 合成的影响；用细胞计数法测定该药对平滑肌细胞增殖的影响。结果发现 ,在无细胞毒性的浓度范围内 ,丹参酮Ⅱ- A 剂量依赖性地抑制碱性纤维母细胞生长因诱导的人血管平滑肌细胞 DNA 的合成 ,IC 50为 2.8μmol/L ,提示丹参酮Ⅱ- A 能对生长因子为始因引起的血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化可能治作用 。采用原位杂交技术探讨了丹参酮Ⅱ- A磺酸钠对血管平滑肌细胞增殖相关基因c - myc表达的影响 ,发现巨噬细胞源性生长因子可明显促进平滑肌细胞c - myc高表达 ,导致平滑肌细胞增殖 ,而丹参酮Ⅱ- A 能阻止这种作用 ,使 c - myc 表达水平下降 ,抑制平滑肌细胞增殖。提示丹参酮 Ⅱ- A 可能通过阻止血管平滑肌细胞增殖而起到抗动脉粥样硬化作用。应用免疫细胞化学、流式细胞术和核酸原位杂交技术也观察到丹参酮Ⅱ- A硫酸钠对低氧诱导肺动脉平滑肌细胞 PASMC 增殖有抑制作用，机制是通过下调增殖细胞核抗原 PDGF mRNA基因表达来实现。通过观察兔耳增生性瘢痕组织形成发现丹参酮Ⅱ- A可抑制成纤维细胞增殖和降低胶原纤维含量。
（2）缩小心肌梗死面积 ：利用结扎狗冠状动脉前降支的心肌梗死模型,静注丹参酮Ⅱ- A ,结果心肌梗死范围缩小 ,疗效非常显著 ,冠状动脉内给药后同样显著缩小狗心肌梗死面积 ,其疗效与潘生丁相当。用结扎冠状动脉左前降支的方法复制犬心肌缺血再灌注模型 ,结果丹参酮能明显增加正常及部分再灌注心肌血流量 ,丹参酮主要增加缺血周围区血流量说明丹参酮可以缩小缺血心肌的范围 ,丹参酮无改善再灌注心肌微循环障碍的作用。
（3）降低心肌耗氧量：降低心肌耗氧量有利于缺血性冠心病的治疗。阻断狗冠状动脉血流后 ,对照组静注生理盐水其左室舒张压上升 ,而静滴丹参酮Ⅱ- A的试验组则明显降低。说明丹参酮Ⅱ- A可能通过降低左心室壁张力和心脏体积而降低心肌耗氧量。在给大鼠口服甲状腺素粉诱导甲亢过程心肌微粒体ATP 酶活性降低 ,丹参酮Ⅱ- A 磺酸钠 ATP酶活性具有保护作用,可提高心肌ATP 酶活性 ,对心肌起到保护作用 。采用离体大鼠工作心模型,通过在停跳液中加入丹参酮进行实验 ,结果表明实验组的心功能恢复率优于对照组 ,同时再灌注期心肌丙二醛产生和冠脉回流液中乳酸脱氢酶含量减少 ,心肌超微结构改变也和上述结果相一致 ,而且丹参酮的心肌保护效果优于维拉帕米 ,作用机制与减少氧自由基产生有关 。
（4）抗心律失常作用：丹参酮Ⅱ- A 对酶解分离的大鼠单个心室肌细胞的内向整流钾电流和瞬时外向电流均有抑制作用 ,这两种电流的抑制使心动作电位时程延长。也有实验证明丹参酮Ⅱ- A可抑制豚鼠单个心肌细胞L 型钙电流和缩短动作电位时程。因此推断丹参酮Ⅱ- A可能有抗心律失常作用。采用膜片钳全细胞式记录方法 ,观察了丹参酮Ⅱ- A对豚鼠单个心室肌细胞跨膜电位及 L 型钙电流的影响。结果证明 ,丹参酮Ⅱ- A 具有类维拉帕米样 L - 型钙通道阻断剂作用 ,可用于心肌缺血 - 再灌注损伤和心律失常的防治。孙学刚等的实验也证实丹参酮能预防大鼠缺血再灌注性心律失常的发生，能减少心律失常大鼠的病死率。
（5）对心肌的保护作用：陶军等利用家兔心肌缺血 - 再灌注模型 ,观察了缺血 - 再灌注后心肌 2 ,4 - 亚甲二氧苯丙胺 MDA 生成、超氧化物歧化物 SOD 活性、血清肌酸激酶CK 活性变化及丹参酮Ⅱ- A 对上述指标的影响。结果表明,缺血 - 再灌注心肌 MDA含量显著升高 ,SOD活性明显下降,同时血清 CK活性显著升高 ,缺血和再灌注模型给予丹参酮Ⅱ- A 5 mg/ kg 能显著降低心肌中 MDA 的生成和减少心肌 CK的释放。用化学发光法显示丹参酮Ⅱ- A 对超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢有消除作用。由此推测消除氧自由基是丹参酮Ⅱ- A防治心肌再灌注损伤的机制之一。买长江等 用离体大鼠工作心模型 ,研究了丹参酮Ⅱ- A 对心肌的保护效果 ,并与异搏停对比 ,证实丹参酮Ⅱ- A心肌保护效果优于异搏停 ,作用机制与减少氧自由基有关。张洁等的研究表明丹参酮Ⅱ- A对培养猪冠脉平滑肌上钙激活性钾通道具有明显的直接激活作用 ,因此推测丹参酮Ⅱ- A 能扩张冠脉平滑肌而利于冠心病的治疗。
1.3临床应用：
（1）治疗冠心病，能改善冠状动脉循环，抑制血栓疾病发生。
（2）抗感染，用于化脓性和外科感染（急性扁桃体炎，外耳道炎、骨髓炎、手术感染等）。
（3）用于治疗宫颈糜烂。
（4）治疗某些皮肤病及痤疮。
（5）治疗肝炎及麻风病。
除此以外，其对肿瘤细胞的诱导分化作用，抗氧化作用，诱导肿瘤细胞凋亡作用，抗氧化作用，对神经细胞保护作用，抗炎作用及性激素样活性都在研究之中。
1.4药品发展及前景：
由于丹参酮Ⅱ-A肠道吸收差，临床起效慢，故由钱名坤等人将其磺化成水溶性钠盐--DS-201，并先后由上海制药一厂、中药三厂制成供临床与动物实验用的注射液。
本品于1995年由上海第一生化药业有限公司首次获得上市批准，在药监局数据库中仅查见吉林安迪诺制药有限公司于1996年获得了原料生产批文，丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液有上海第一生化等三个厂家生产，江西银涛药业有限公司于05年1月向国家食品药品监督管理局提交了本品注射液的仿制申请，目前正在药品审评中心审评。
丹参酮Ⅱ-A磺酸钠目前国内市场仅有一家生产原料、三家生产水针，均已过了新药保护期。丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液2ml:10mg/支的南京市招标价为22.4元/支，市场调节价为23.8元/支，无降价风险。
丹参酮Ⅱ-A中丹参酮Ⅱ-A磺酸钠因副作用小，适应症广，一日1次使用方便，治疗面宽，市场竞争小，市场价值比巨大，预计国内市场约1000万支/年的销量。
综上所述，丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液市场竞争小，销售价格稳定，利润可观，市场前景广阔；多年的临床应用证实了丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液的疗效可靠、耐受性良好、安全性高。
近年来，对于丹参酮Ⅱ-A的药理作用研究越来越广，其心脏相关药理作用越来越受重视，有理由相信，其某种改造结构可能会成为一种化学实体而得到上市。因此，对其药理作用研究将是一种前景乐观的项目。
二、实验部分
2.1实验模型：
2.1.1室性心律失常模型
由于丹参酮Ⅱ-A主要用于抗室性早博，为得知其明确机制，需制造大鼠室性心常模型。
心室心动过速和心室颤动性心律失常多选用狗、猫或大鼠等整体心脏（开胸或闭胸）进行实验。常使用造型药物为乌头碱、肾上腺素及氯化钙（或氯化钡）。一般使用乌头碱缓慢静脉注射造型，大鼠剂量： 30～50μg/kg。还可使用高浓度的肾上腺素（豚鼠40μg/kg，猫、犬100μg/kg）快速静注，可造成动物多源性早搏、短阵性室性心动过速等。这类模型可用于筛选抗心律失常药物。其优点为心律失常在几分钟自行消失，因此同一动物可反复多次进行心律失常实验，便于观察抗心律失常药物作用的持续时间，并可进行自身对照。
　　（1）肾上腺素或氯仿-肾上腺素引起室性心律失常：
大剂量的肾上腺素可提高心肌的自律性而导致心律失常（室性早搏、室性心动过速，甚至心室颤动），而氯仿与肾上腺素和用更增加对心脏的毒性。实验中将氯仿2mL 注入3g纱布块上，放入动物麻醉口罩中，给家兔吸入，当角膜反射刚消失，立即去掉麻醉口罩，记录正常心电图II导联后，迅速耳缘静脉注入0.01%肾上腺素0. 5 mg/kg，及时记录心律失常持续时间。可出现一源性或多源性室性早搏、阵发性室性心动过速，甚至出现心室颤动，通常持续约4-7min左右。
　　（2）乌头碱引起室性心律失常：
电生理实验表明乌头碱引起心律失常的机制是激活了心肌细胞的钠通道，使钠通道开放，加速心肌细胞钠离子内流，促使细胞膜去极化，加速起搏点自律性，诱发异位节律点，可形成多源性异位节律，缩短心肌不应期而导致心律失常。实验中选用200g左右的大鼠，乌拉坦或戊巴比妥钠麻醉固定后，经股静脉插管、尾静脉注射或舌下静脉注射30-50μg/kg。静注乌头碱的速度不同，形成心律失常的速度及持续时间也不完全相同，慢速注射（1-5min注射完）所用剂量偏下限，一般心律失常约3-10min出现，约持续90-120min（大鼠）。快速注射，3-5s注完，通常心律失常约45-80min。
　　（3）氯化钡或氯化钙引起室性心律失常：
Brooks指出当血清钙离子浓度超过正常3-4倍，可出现室性颤动。给麻醉大鼠静脉注射氯化钙120-200mg/kg可产生严重的心律失常。若于10s内静注120mg/kg，可立即产生阵发性心动过速，继而房室传导分离，1.5min发展为心室扑动及颤动，2min完全停止。若于数秒中快速静注140mg/kg，约80%的大鼠在60-90s内死于室颤；约20%的大鼠发生室性早搏伴发窦性过缓或房室传导阻滞，以后转为室性心动过速，可逆性室颤，10-30min后恢复正常。
心律失常心电图观察指标为：皮下放置心电图肢体导联电极，测标准Ⅱ导心电图，观察药物对心率及Q - T间期的影响。
2.1.2心肌缺血模型
（1）药物法：亦为近年来常采用的一种方法。最常使用的造模药物为4%异丙肾上腺素，给大鼠皮下注射50mg/kg体重；或将药物加入500ml盐水中从家兔耳静脉匀速（4小时）滴入，每公斤体重可分别给药10、20、30mg，或直接将药物注入腹腔均可造型。也可用麻醉犬静脉给予麦角新碱0.2mg/kg 体重，造成冠状动脉痉挛。
（2）冠脉阻断法：结扎冠状动脉是制作心肌梗塞模型的最常用方法。一般选用成年健康犬或家兔，麻醉后开胸，多结扎其冠状动脉前降支阻断心肌供血，引起病变；也有人采用闭胸式选择性冠状动脉插管法，即在荧光屏下将心导管由麻醉犬的颈动脉切口处插入，沿主动脉壁直抵左窦底部，将其尖端送至左冠状动脉内约2cm深处，向导管内注入120mg/kg体重的汞，形成急性心肌梗塞。亦有人用冠状动脉周围套线牵拉法使其不完全阻断，以形成家兔急性缺血性濒危心肌模型。为了更接近自然状态下心肌缺血的变化，近来有的单位用清醒犬作急性缺血和梗塞模型。先将犬麻醉，然后分离冠状动脉长约10毫米，套上冠状动脉压迫环，用注水压迫阻断冠状血流，观察犬在清醒状态下的心肌缺血反应与药物效应。此外，还有人用离体大鼠心脏冠脉结扎复制出超微结构的心肌缺氧损伤模型。
（3）高脂血症大鼠模型：购买的大鼠适应性饲养1周后，喂基础饲料并用脂肪乳剂（10%胆固醇、20%猪油、1%甲基硫氧嘧啶片、2%猪胆盐，20%吐温80、20丙二醇、27%蒸馏水）灌胃。取上述脂肪乳按10mL/kg连续灌胃15d。
（4）离体大鼠心肌缺氧/再给氧损伤模型（加剧心肌组织缺血性损伤）：根据Langendorff创建的离体心脏灌注法，稍加改良建立离体大鼠心脏缺氧/再给氧损伤模型。选取体重230～300gSprangue-Dawley或Wistar大鼠，腹腔注射肝素2mg，15min后断头或拉颈处死。立即在肋緣下横向剪开腹前壁，再依次纵向剪开胸侧壁和横膈前缘，将胸壁翻至头侧。分离出心脏后轻轻提起心脏，在主动脉距其起始部4～5mm处用弯头组织剪迅速将主动脉及其他血管一并剪断，心脏立即至于有冷灌流液的培养皿内。在液面下找出主动脉断端，用眼科镊夹住断端在液面下套入装置中的主动脉插管并以线结扎固定。从剪取心脏到将其固定于套管上应于2min内完成。立即通入95%的O2和CO2的Kreb’s-Henseleit液灌流。剪去心脏周围附着的组织，并于肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪一小口，以利冠脉回流液的排出。正常灌流速度为7～10ml/min。以带线的蛙心夹夹住心尖，连接于与张力换能器相连的杠杆，将心肌收缩幅度和张力记录于生理记录仪。根据实验要求，可行左心室内球囊插管，即行左心室切口，气囊导管从二尖瓣插入左心室，球囊内注水是压力调至5～6mmHg并维持整个实验过程，记录左室内压（LVP）和左室内压最大变化速度（LV dp/dtmax）。药物以灌流液稀释后根据实验要求给予。心脏自然灌流平衡15min后即可进行缺氧（或缺血）。根据不同实验目的，选择缺氧（或缺血）不同时间后进行再给氧（或再灌注）。若观察再灌注所致心律失常，通常在缺氧10～15min后再给氧30min；研究药物对缺血心肌细胞酶释放等作用，则多选用缺血30～60min然后再给氧20～60min。实验选用冠脉流量，心肌收缩功能和舒张功能（LVP、LVEDP、dp/dtmax），心电图，流出液或心肌匀浆CPK、LDH、ATP、MDA、CGRP 、氧自由基等作为测定指标，并结合光镜与电镜形态学观察。
（5）体外培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/再给氧损伤试验法（对缺氧的耐受性较高）：利用体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞，通过暂时停止供应心肌细胞生存必须的糖和氧，并缺糖缺氧一定时间后恢复供糖供氧，可分别造成模拟心肌缺血与缺血后再灌注损伤模型，能在较长时间内观察药物对细胞生理功能、生化和形态学的影响，从细胞水平评价药物对心肌缺血和再灌注损伤的保护作用。
心肌缺血心电图指标观察为：皮下放置心电图肢体导联电极，测标准Ⅱ导心电图，观察药物对S-T段、T波幅度的影响。
2.2实验阳性对照药：
心律失常阳性对照药：
（1）钠通道阻滞药：利多卡因
（2）β受体阻断药：普萘洛尔
（3）钙通道阻滞药：维拉帕米
心肌缺血阳性对照药：
（1）β受体阻断药：普萘洛尔
（2）钙拮抗药：维拉帕米
2.3试验材料：
试验动物：SD大鼠200-300g，雌雄各半，武汉大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（鄂）；使用许可证号：SYXK（鄂）。
试验药品：乌拉坦，上海化学试剂厂提供，批号：030412，生理盐水配制成20%溶液备用；
丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液，上海第一生化药业有限公司提供，5%葡萄糖配制成0.5%溶液备用；
肾上腺素，武汉制药一厂提供，批号：990902，生理盐水配制成0.01%溶液备用；
异丙肾上腺素，上海申隆制药厂提供，批号：990416，生理盐水配制成0.5%溶液备用；
生理盐水，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司提供，批号：070507；
5%葡萄糖输液，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司提供，批号：070601。
乌头碱，生理盐水配制成0.001%溶液备用；
氯化钙，生理盐水配制成1.00%溶液备用；
利多卡因，江苏济川制药有限公司，批准文号:国药准字H，5%葡萄糖配制成0.05%溶液备用；
普萘洛尔，10mg*100片国药准字H%葡萄糖配制成0.5%溶液备用；
盐酸维拉帕米，国药准字H%葡萄糖配制成0.05%溶液备用；
试验器材：BL-420 E型生物机能试验系统、动物秤、大鼠手术台、眼科镊、1ml、5ml注射器、4#、6#针头。
2.4试验方法
1．丹参酮Ⅱ-A对大鼠心律失常防治作用的机制研究
心电图检测
实验用药前将各组大鼠先作心电图检查,弃去ST段、T波有异常改变者和心律失常者。
肾上腺素造模
取大鼠，称体重，分为阴性对照组、阳性对照组和受试药组。分别腹腔注射乌拉坦1-2g/kg（20%乌拉坦，5-6ml/kg）麻醉，仰卧位固定于手术台上,针型电极插入大鼠皮下，打开生物机能试验系统，待心电图稳定后开始实验，先记录一段正常的大鼠心电图。分别舌下静脉快速注射0.01%肾上腺素溶液1ml/kg；接着，所有大鼠按下表顺序进行给药（受试药表示丹参酮Ⅱ-A磺酸钠，以下同）：
受试化合物对大鼠心率的影响（χ±s）
与阴性对照组*P<0.05,**P<0.01
受试化合物对大鼠Q - T间期的影响（χ±s）
与阴性对照组*P<0.05,**P<0.01
乌头碱造模
取大鼠，称体重，分为阴性对照组、阳性对照组和受试药组。分别腹腔注射乌拉坦1-2g/kg（20%乌拉坦，5-6ml/kg）麻醉，仰卧位固定于手术台上,针型电极插入大鼠皮下，打开生物机能试验系统，待心电图稳定后开始实验，先记录一段正常的大鼠心电图。分别舌下静脉快速注射0.001%乌头碱溶液30-50μg/kg（0.6-0.8ml）；接着，所有大鼠按下表顺序进行给药：
受试化合物对大鼠心率的影响（χ±s）
与阴性对照组*P<0.05,**P<0.01
受试化合物对大鼠Q - T间期的影响（χ±s）
与阴性对照组*P<0.05,**P<0.01}