CD133及ALDH在肿瘤侵袭中的作用及机制研究--《北京协和医学院》2013年博士论文
CD133及ALDH在肿瘤侵袭中的作用及机制研究
【摘要】：第一部分：CD133对直结肠癌侵袭能力的作用研究及机制探讨
CD133(prominin-1)是目前文献中使用率较高的干细胞表面标记分子。CD133在直结肠癌细胞中广泛表达,但其分子本身在结肠癌侵袭转移中的作用及机制未见报道。因此本研究重点观察了CD133在结肠癌体外侵袭中的作用,并深入探讨了其导致细胞侵袭能力改变的分子机制。
为筛选适宜的细胞模型,我们用流式细胞术及Western blotting检测了CD133在六种结肠癌中的表达,结果CD133阳性比例在不同细胞中跨度很大,从1.5%-98%不等。接着我们以恶性程度较高且CD133+率较高(83.52%)的HCT116细胞为模型,分选出CD133high及CD133low细胞进行体外培养及功能研究。结果发现CD133high细胞比CD133iow具有更强的增殖能力(集落形成、MTT检测)与侵袭能力(transwell检测),表明高表达干细胞标记CD133的肿瘤细胞在侵袭转移中发挥更重要的作用。
为研究CD133分子本身功能,我们用siRNA在体外有效敲低了HCT116田胞中CD133的表达,发现下调CD133可明显降低细胞的侵袭能力,但对癌细胞的增殖能力没有明显影响。至于CD133影响结肠癌肿瘤侵袭能力的分子机制,文献中未见相关报道。所以我们检测了与肿瘤侵袭转移密切相关的多个信号通路上的重要分子包括Hif-1α、Hif-1β、cdc42、RhoA、Smad7、TIMP-1和TIMP-2,结果表明敲低CD133仅显著下调了TIMP-2的表达。进一步用siRNA在体外有效敲低了TIMP-2的表达,发现敲低TIMP-2对细胞增殖及侵袭能力的影响与CD133敲低作用一致。首次证明TIMP-2是CD133的下游分子并且CD133通过TIMP-2影响癌细胞的侵袭能力。研究同时发现CD133及TIMP-2对HCT116细胞侵袭能力的影响与MMP2及MEK/ERK信号通路无关。
总之,我们的研究首次揭示了干细胞标记CD133分子本身在结肠癌侵袭过程中发挥重要作用,并且CD133是通过调节TIMP-2而影响癌细胞的侵袭能力。
第二部分ALDH对肿瘤细胞生物学行为的影响
乙醛脱氢酶(ALDH)是存在于细胞内依赖于NAD(P)+的酶,可将醛解毒为相应的酸。作为近年来新发现的肿瘤干细胞标记分子,ALDH已被证实可在多种正常组织及肿瘤组织中作为干细胞的标记分子。ALDH家族在人类细胞中有19个亚型,除ALDH1A1以外其他各亚型在肿瘤中的功能研究还较少,各亚型在不同肿瘤组织中的表达情况也比较复杂。有研究表明ALDH1A3在乳腺癌及黑色素瘤中有重要作用,而其在结肠癌及肺癌中的功能却未见报道。
本研究中我们首先用ALDEFLUOR法检测了ALDH在六种结肠癌及两种肺癌细胞系中的活性,发现在结肠癌细胞系中的表达情况差异很大,ALDH+细胞比例从7.4-64.5%不等,两种肺癌细胞系中A549与NCl-H157中ALDH+细胞比例分别为11.9%和1.2%。然后我们以结肠癌HCT116及肺癌A549田胞作为研究模型,用流式细胞术分选出了其中ALDHhigh及ALDHlow细胞进行功能研究,发现ALDHhigh细胞比ALDHlow细胞具有更强的体外增殖能力(MTT、集落形成),并且在HCT116细胞中ALDHhigh细胞比ALDHlow细胞具有更强的体外侵袭能力(transwell检测),说明ALDHhigh细胞具有干细胞的特性。将分选后的HCT116ALDHhigh细胞及ALDHlow细胞体外再培养,发现随着培养时间的延长ALDHhigh细胞中ALDH+细胞的比例呈下降趋势,而ALDHlow细胞中ALDH+细胞的比例呈上升趋势,并最终趋于HCT116细胞中ALDH+田胞的比例,说明肿瘤干细胞可能是一种功能状态(functional status)而不是特殊类型(special entity)。
由于两种细胞表达不同的ALDH亚型,HCT116主要是ALDH1A3,而A549细胞中同时表达ALDH1A1及ALDH1A3,需要探讨不同亚型对肿瘤细胞的影响。为此用siRNA将这两种亚型的表达进行了有效敲低并进行相关功能研究。结果显示,敲低ALDH1A3后,HCT116和A549细胞的侵袭能力均显著降低,A549细胞的增殖能力也显著降低,而HCT116细胞的增殖能力无显著变化,其机理还在深入研究中。说明ALDH1A3对肿瘤的增殖及侵袭转移能力具有重要影响。肿瘤细胞在病人体内处于低氧环境,为此我们利用在培养体系中加入CoCl2的方法来模拟低氧环境,发现下调ALDH1A3后的HCT116细胞在低氧环境中的凋亡比例增加,表明ALDH1A3与癌细胞的耐低氧能力有关,下调ALDH1A3降低了HCT116细胞对低氧环境的耐受。
总之,我们的研究首次揭示了ALDH尤其是其亚型ALDH1A3对结肠癌及肺癌细胞的生物学行为具有重要影响,为临床结肠癌及肺癌治疗提供了新的潜在靶点。
第三部分：小鼠树突状细胞肉瘤中SRS19-6MuLV病毒的检测及致病机理研究
SRS19—6MuLV是小鼠白血病病毒(MuLV)家族成员,分离于我国TSZ系统的白血病,与国外分离的只能引起单一白血病的小鼠白血病病毒不同,该病毒能引起至少4种白血病包括：红细胞性白血病,髓系白血病,T淋巴瘤及B淋巴瘤。我们实验室用以前工作中制备的抗小鼠树突状肉瘤(DCS)细胞的单克隆抗体983D4筛选DCS的cDNA表达文库,所获得的DNA序列经测序与小鼠白血病病毒SRS19-6MuLV高度同源。
为探讨SRS19-6MuLV是否可引起树突状肉瘤细胞,即是否是DCS肿瘤发生的病毒病因,我们首先用PCR检测了SRS19-6MuLV基因特异性片段在多种肿瘤细胞及组织中的存在情况,包括DCS细胞、15种小鼠肿瘤细胞、2种小鼠瘤株、12种小鼠正常组织、11种人肿瘤细胞及SRSV/3T3细胞(SRS19-6MuLV转化的阳性对照细胞)。结果显示,在DCS细胞、DCS的瘤株LⅡ及SRSV/3T3细胞基因组中存在SRS19-6MuLV特异基因片段,提示DCS细胞基因组中存在SRS19-6MuLV的插入。我们接着用反向PCR法(IPCR,从病毒插入片段设计引物,向病毒插入位点以外扩增)检测了SRS19-6MuLV在DCS及SRSV/3T3细胞基因组中的插入位点,找到7个病毒基因的插入位点。通过生物信息学分析,在插入位点周围发现了一些与肿瘤发生密切相关的普通脆性位点及Ras相关的miRNA。提示SRS19-6MuLV是DCS肿瘤发生的病毒病因。
SRS19-6MuLV不仅能引起四种白血病,我们的结果还证明SRS19-6MuLV也可以引起小鼠树突状细胞肉瘤(DCS),而此病毒并不感染人类细胞,丰富了我们对SRS19-6MuLV致瘤谱及致瘤机理的认识。
【关键词】：
【学位授予单位】：北京协和医学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R730.23【目录】：
中文摘要7-10ABSTRACT10-13第一部分 CD133对结直肠癌侵袭能力的作用研究及机制探讨13-56 引言14-17 实验材料17-22 实验方法22-36
1. 细胞培养22
2. 细胞总蛋白的提取22
3. BCA法检测蛋白浓度22-23
4. Real Time PCR23-26
5. Western Blotting26-27
6. 细胞CD133~+率分析及CD133~(high)、CD133~(low)分选27-28
7. MTT法检测细胞增殖28
8. 细胞集落形成率测定28
9. Transwell体外侵袭实验28-29
10. siRNA干扰CD133或TIMP2的表达29-30
11. MMP2明胶酶谱检测30-31
12. 质粒转化、扩增31
13. CD133 shRNA表达载体构建31-34
14. 慢病毒包装34
15. 慢病毒感染目的细胞及稳定细胞株筛选34-35
16. 统计学方法35-36 实验结果36-50
1. CD133在六种结直肠癌细胞系中的表达36-37
1.1 流式细胞术检测CD133在六种结肠癌细胞系中的表达情况36
1.2 Western blotting检测CD133在六种结肠癌细胞系中的表达情况36-37
2. CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更高的体外增殖能力与侵袭能力37-39
2.1 流式细胞术分选CD133~(high)与CD133~(low)细胞并检测分选纯度37
2.2 CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更高的体外增殖能力37-38
2.3 CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更强的集落形成能力38
2.4 CD133~(high)比CD133~(low)亚群具有更强的体外侵袭能力38-39
3. siRNA下调CD133后降低了HCT116细胞的侵袭能力39-41
3.1 siRNA可有效下调HCT116细胞中CD133的表达39-40
3.2 siRNA下调CD133后对HCT116细胞增殖能力没有影响40-41
3.3 siRNA下调CD133后降低了HCT116细胞的体外侵袭能力41
4. CD133的下调影响TIMP-2的表达41-44
4.1 侵袭转移相关信号通路分子筛查41-42
4.2 敲低CD133可使TIMP-2表达明显降低42-43
4.3 TIMP-2在CD133~(high)及CD133~(low)HCT116细胞中的表达没有区别43
4.4 敲低CD133对MMP及TIMP家族其他成员的影响43-44
5. siRNA下调TIMP-2后对CD133表达无影响且可以降低细胞的体外侵袭能力44-47
5.1 siRNA可以有效下调TIMP-2的表达44-45
5.2 siRNA下调TIMP-2后对CD133表达没有影响45-46
5.3 siRNA下调TIMP-2后对细胞的体外增殖能力没有影响46
5.4 siRNA下调TIMP-2后可降低细胞的体外侵袭能力46-47
6. MMP2及MEK/ERK通路不参与CD133及TIMP-2对细胞的影响47-48
7. CD133 shRNA表达载体的构建及CD133稳定敲低细胞系的建立48-50 讨论50-55 小结55-56第二部分：ALDH对肿瘤细胞生物学特性的作用研究56-90 引言57-59 实验材料59-63 实验方法63-72
1. 细胞培养63
2. 细胞总蛋白的提取63
3. BCA法检测蛋白浓度63-64
4. Real Time PCR64-66
5. Western Blotting66-67
6. 细胞ALDH~+率分析及ALDH~(high)、ALDH~(low)分选67-68
7. MTT法及CCK8检测细胞增殖68-69
8. 细胞集落形成率测定69
9. Transwell体外侵袭实验69-70
10. siRNA干扰ALDH1A1或ALDH1A3的表达70
11. 细胞免疫化学染色70-71
12. 流式检测细胞周期71
13. 细胞凋亡检测71
14. 统计学方法71-72 实验结果72-85
1. 流式检测ALDH在几种结肠癌及肺癌细胞系中的表达72-73
2. ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的生物学特点73-76
2.1 HCT116/A549细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的分选73
2.2 HCT116/A549细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的体外生长的差别73-74
2.3 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的集落形成能力差别74
2.4 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞周期的差别74-75
2.5 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞再培养75
2.6 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的体外侵袭能力的观察75-76
3. ALDH1A1及ALDH1A3在几种结肠癌细胞中的表达情况76-78
3.1 Western boltting检测ALDH1A1及ALDH1A3在几种结肠癌及肺癌细胞系中的表达情况76-77
3.2 间接免疫荧光检测ALDH1A1及ALDH1A3在HCT116/A549细胞中的表达情况77-78
4. siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3对HCT116/A549细胞的影响78-85
4.1 siRNA可有效下调ALDH1A1及ALDH1A3的表达78
4.2 siRNA下调ALDH1A3或ALDH1A1后对HCT116/A549中ALDH~+细胞比例的影响78-79
4.3 siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3后对HCT116/A549细胞凋亡没有影响79-80
4.4 siRNA下调ALDH1A3后对HCT116增殖能力没有影响80-81
4.5 siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3后对A549的增殖能力有不同影响81
4.6 siRNA下调ALDH1A3后对A549细胞周期的影响81
4.7 siRNA下调ALDH1A3后能降低HCT116的体外侵袭能力81-82
4.8 siRNA下调ALDH1A3后能降低A549的体外侵袭能力82-83
4.9 siRNA下调ALDH1A3后能降低HCT116细胞对CoCL_2模拟的低氧环境的耐受83-85 讨论85-89 小结89-90第三部分：小鼠树突状细胞肉瘤中SRS19-6MULV病毒的检测及致病机理研究90-106 引言91-92 实验材料92-94 实验方法94-98
1. 细胞培养94
2. 培养细胞及组织基因组DNA提取94-95
3. PCR扩增目的片段95
4. PCR产物胶回收95-96
5. 透射电镜检测DCS及SRSV/3T3细胞中有无病毒颗粒96
6. IPCR方法检测SRS19-6MuLV病毒在DCS及SRSV/3T3基因组中的插入位点96-97
7. 序列及插入位点生物信息学分析97-98 实验结果98-103
1. DCS及其他小鼠肿瘤细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果98
2. 小鼠正常组织、细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果98-99
3. 小鼠瘤株及SRSV/3T3细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果99-100
4. 人肿瘤细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果100
5. 透射电镜检测病毒颗粒100-101
6. SRS19-6MuLV病毒在DCS细胞及SRSV/3T3细胞中插入位点101
7. 序列及插入位点生物信息学分析101-103 讨论103-105 小结105-106参考文献106-114缩略语114-116文献综述116-132 参考文献126-132附录：已发表文章132-134致谢134-135个人简历135-136
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化验检验流程
凭医生开具的化验单到收费处交费。
凭化验检验单和交费收据做相应的化验检验。（三大常规化验和抽血在门诊三楼）。
检验标本要求：
* 大便标本1小时内送检（不要送检尿布便，会造成结果不准确，影响医生诊断和用药）。
小便标本2小时内送检，但中段尿培养须到医院作无菌处理后留取。
抽血注意事项：
* 抽血前晚请嘱孩子清淡饮食（不要吃油性食物）。晚间到次日抽血前均可正常饮白开水，早晨不要吃早饭。对年龄较小（如哺乳期）儿童，空腹期间可正常饮白开水，但空腹至少达3小时（一般要空腹4小时）。
* 请家长配合做好抽血时和抽血后的辅助工作。静脉抽血后请用棉球用力按压抽血部位15~30分钟止血，保持抽血部位清洁，以防局部感染。抽血后请及时给孩子饮食。
* 孩子如有晕针、惊厥、出凝血异常等方面的疾病，请及早告知开单医生和抽血护士，以预期应对潜在的突发情况。
化验报告：
抽血后护士会给家长一份回单，上面注明了取报告时间，请仔细阅读此回单，以便安排好取报告时间（划圈部分）。取报告时请携带就诊卡化验交费发票及回单，到指定地点取报告。门诊一楼服务台会保存报告一个月，然后转入库房长期保存。服务台工作时间：每天8：00-17：00。
检验科检验项目一览表
实验室三大常规化验项目
免疫室项目
生化室项目
微生物室细菌培养项目
急诊化验室
化验室三大常规化验项目（门诊三楼）
正常参考范围
&详见血常规报告
&C反应蛋白
&详见血常规报告
&男：0~15mm/H
&女：0~20mm/H
&网织红细胞计数（仪器）
&异常白细胞形态检查
&血液疟原虫检查
&尿红细胞形态
&乳糖耐受试验
&尿蛋白三项
&尿α1微球蛋白
周一至周五开展，11：00前送标本，下午四点出报告（周六、周日不开展）
&标本1小时内送检
&标本1小时内送检
&标本1小时内送检
&标本1小时内送检
&轮状病毒检测
免疫室项目（门诊三楼）
正常参考值
&类风湿因子
空腹抽血，周一到周五当日09:00前标本，下午4:00发报告；09:00后，次日下午4:00发报告（周六、周日不开展，节假日出报告时间另行通知）
&乙肝两对半
&传染病四项
&支原体抗体
由抽血处通知取报告时间
&心肌钙蛋白
&1小时后发报告
&1小时后发报告
&抗HP（含现症感染）
&1小时后发报告
&自身抗体全套
&含ENA、ANA、ANCA、ACA
一周后下午四点发报告（节假日出报告时间另行通知）
&自身抗体7项（ENA）
&抗心磷脂抗体（ACA）
&抗中性粒细胞抗体（ANCA）
&抗核抗体（ANA）
空腹抽血，周一到周五当日09:00前标本，下午4:00发报告；09:00后，次日下午4:00发报告（周六、周日不开展，节假日出报告时间另行通知）
&过敏原全套
五天后下午四点发报告（节假日出报告时间另行通知）
&三天后下午四点发报告
生化室项目（门诊三楼）
正常参考值
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&详见生化报告
空腹抽血，当日09:00前标本，下午4:00取报告；9:00后，次日下午4:00取报告
&肝功能(含血脂)
&K、Na、Cl、Ca2+、Mg、P
&详见生化报告
&钙、磷、碱磷酶
&详见生化报告
&详见生化报告
&血清淀粉酶
&血清(尿)蛋白电泳
&每周五出报告
微量元素全套（包括锌、铜、铁、铅、钙、镁）
周一至周日空腹抽血，一周后下午四点出报告（节假日出报告时间另行通知）
&24小时尿钙
&当日取报告
&当日取报告
&24h尿蛋白定量
&当日取报告
&脑脊液生化
&当日取报告
微生物室细菌培养项目（门诊八楼）
正常参考值
无菌操作，专用血培养瓶，接到标本第六天下午四点发报告
&血培养＋药敏
无菌操作，专用L型血培养瓶，接到标本第八天下午四点发报告
&L-型培养＋药敏
&无致病菌生长
接到标本后第四天下午四点发报告
&大便培养＋药敏
&中段尿培养
留取中段尿。第四天下午四点发报告
&中段尿培养＋药敏
接到标本后第四天下午四点发报告
&脓培养＋药敏
&分泌物培养
&分泌物培养＋药敏
&淋球菌培养
&咽拭子培养
&正常菌群生长
&咽拭子培养＋药敏
&正常菌群生长
&痰培养＋药敏
&脑脊液培养
接到标本后第六天下午四点发报告
&脑脊液培养＋药敏
急诊化验室（急诊楼一楼）
晚间门诊、急诊检验项目包括：
血常规、CRP、尿常规、大便常规、大便隐血、淀粉酶、急诊电解质、交叉配血、凝血常规。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
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& 帮看看化验单是什么意思
帮看看化验单是什么意思
问：到医院检查，请妇产科医生帮我看看这几张化验单是什么意思，谢谢了。曾经治疗情况和效果:无想得到怎样的帮助:看看化验单什么意思......
答：病情分析：你好根据你的描述考虑是怀孕。指导意见：建议你注意饮食加强营养，忌辛辣刺激的食物。......
问：检测的。想得到怎样的帮助:质控条带；阳性特异性反应条带；阴性这两个是什么意思啊？是正常的吗？这种检测准确吗？......
答：病情分析：质控条带阳性提示试纸没有失效，检测结果是阴性是正常的，提示没有感染艾滋病。指导意见：这样的结果是正常的，但我不建议用这......
问：谁能帮我看看这张抽血化验单是什么意思？
答：病情分析：你好，根据你的血常规检查结果主要是白细胞和中性粒细胞升高，说明有细菌感染的情况指导意见：治疗建议口服头孢克肟分散片和左......
问：可以帮我看看这张乙肝化验单是什么意思?可以详细点可以帮我看看这张乙肝化验单是什么意思?可以详细点......
答：病情分析：你并没有发乙肝化验单来。指导意见：怎么凭什么说你的乙肝检查的是什么意思呢。 提问人的追问
问：好心的医生帮我看看这几张化验单是什么意思啊！严重么？谢谢大家！
答：病情分析：由于每个医院的实验设备，试剂不同，正常参考值也有一定的差异，指导意见：你的检查结果，建议咨询你的经治医生。具体诊疗请一......
问：病情描述:看看严重吗？尿检没事就看看前列腺液的化验单......
答：你好，你这个是检查的前泪腺液体常规化验报告单，这个检查结果是没有问题的，这个属于正常的结果，正常就需要卵磷脂小体在3以上，你这个......
问：病情描述:你好，请帮我看看我的的化验单是什么意思好吗乙肝病毒DNA荧光定量2.40E+06是什么意思......
答：你好，乙肝病毒DNA荧光定量2.40E+06说明你的病毒定量过高，病毒复制严重，传染性非常强。你一定要积极正确治疗才能早日康复，......
问：病情描述:这是我刚刚拿到的化验单，我看不懂，医生很忙，也没有交谈上，请问这单子是什么意思？是表示是男是女？:需要医生帮助提供远程......
答：病情分析：这个就是个普通的血常规化验单。指导意见：上面所检查的结果提示是正常的，这个是不好看出男女的。......}