国际通用检查试剂基本可以测试出国内HIV2病毒 - 中国网
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国际通用检查试剂基本可以测试出国内HIV2病毒
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中国药品生物制品检定所王佑春研究员 杨佳/摄
12月1日，由中国生物技术发展中心、中华医学会等有关单位举办的第四届健康科技高峰论坛在中国生物技术学术中心举行。本届论坛结合“世界艾滋病日”，以“艾滋病防治研究的科技进展与展望”为主题，报告内容涵盖艾滋病的预防、诊断、治疗和疫苗研发等方面。中国网，敬请关注！中国药品生物制品检定所王佑春关于艾滋病诊断试剂研究的现状的演讲。
王佑春：我主要是从病毒方面，包括艾滋病、SARS方面的工作。艾滋病疫苗和有关试剂的质量控制是我们工作的一部分。今天很高兴参加这次活动，结合我们的工作对艾滋病诊断试剂的研发状况给大家汇报一下。
人类感染HIV病毒以后，病毒首先在肌体里面复制。在复制的过程中，最先的是病毒核酸大量扩增。这个时候扩增量非常大，过一段时间以后能够持续的维持低水平的核酸病毒量。在病毒扩张过程当中，很快会出现第二次抗原，再过一段时间这种抗体也会诱导出来。从病人感染到抗体检测这段时间叫“窗口期”，在窗口期的时候，病毒传染病非常高，这是一个常规的方法，抗体是监测不到的，但是感染率非常高。HIV感染以后，研究各种各样的病毒试剂，对HIV病毒感染进行检测。这种诊断试剂到目前为止，国际上、国内研究的试剂主要有以下几种：抗体监测试剂，包括确认试剂，还有快速监测试剂，还有通过唾液和尿液的监测试剂。另外就是抗原检测试剂，还有抗原抗体联合体的试剂，还有核酸检测试剂。
最近几年，对耐药物学研究比较多，我们国内也有一些单位在研制耐药性试剂，而且国外有两家已经研制出了，有的在中国开始申报。下面我把每一类诊断试剂的情况，包括国内、国外的情况简单向各位汇报一下。抗体检查试剂主要是通常所说的免检免疫的诊断试剂，到目前为止，这类发展到了第四代。在HIV刚刚发现的时候，那是85年，那个时候巴林诊断试剂第一代的特点是所用的抗原是完全从细胞提取的抗原，作为HIV的抗原来进行检测。这种抗原包括细胞的成分比较多，而且病毒各个现段都有。随后就发展到第二代诊断试剂，主要采用基因工程的办法，对它有目的性的抗原进行工程表达，然后作为简单试剂的抗原。但是第二代主要是检测抗HIV病毒的另一个抗体，所以叫它间接法。这类诊断试剂在诊断过程中检出相对比较晚，但是也有局限性。
后来发展到第三代。在第二、第三代的时候涉及到了创新。在这个创新过程中，第二代是用于检查，但是不是所有的能表达的抗原都能够进行，也就是说到90年代初，国外能够对这一进行改进，这种抗原可以很好的进行酶标被，它检测的是总的HIV抗体，所以它的特点比第二代大大的提高了。第三代是我们国内和国际上使用的是关于临床筛查的主流试剂。
最近几年发展到第四代诊断试剂。HIV抗体和抗原联合起来，同时检测。大家都知道，如果是联合检测，抗原、抗体肯定有反映，但是检测的片断不一样。我们检测抗体的时候是检测模具抗体，检测抗原的时候是检测HTV2的抗原，这样在一个反映里面既可以检测到HIV抗体，也可以检测到第二次抗原。通过前面的模式图可以看到，第二次抗原出现比抗体出现早一些，这部分诊断试剂国外已经有了一些，国内有两家已经开始注册，也用于血液筛查。
我们对用于血液筛查的诊断试剂，从1994年下半年，就开始实行PP检定。尤其最近，大家对PP检查比较熟悉，实际在94年下半年，用于血液筛查的那个时候卫生部开始实行PP检。包括乙肝抗原、乙肝抗体、血型，加上HIV抗体。当时在检查的时候不是都合格的，不合格率有相当一部分，有专门的监督管理部门去监督。最近几年，随着工艺稳定，PP检的合格率越来越高。从07、08年，基本上在HIV方面都是合格的。
2007年HIV诊断试剂用于血筛查的诊断情况
第三代在2007年所有进入PP检查的诊断试剂有17家企业，总共生产103批，产量是7500万人份，其中国产16家，有91批，国产产量是6800万，占总产量的91%。进口的只有1家，是12批次，大约有600万，大约占8.9%。07年第四代试剂共有3家，都是进口的，总共申报12批次，有600多万人份。在07年全年用于血液筛查或者这类的诊断试剂，一共进入国内市场8100万人份。其中在第三代、第四代中，我们的国产试剂占84.2%。所以说，大部分的诊断试剂用于血筛查的都是国产的诊断试剂。
我们对08年的诊断试剂的PP检的情况也进行了总结。这个数据截止到9月底，第三代试剂到9月底总共有18家申报，有91批，有6500多万，都是合格的。其中国产的是17家，有82批次，生产了6000多万，约占95%。今年第四代诊断试剂除了前年的进口3家诊断试剂以外，我们还有两家国产诊断试剂获得了批准，正式生产，也投放了市场。在这五家企业当中，总共9个批次是200多万人份，将近300万，国产是49万，刚刚开始申报，量比较少，明年可能会有所增加。进口的3家企业，是6批次，有200多万人份，所以进口占多数，但是国内一些企业在研制这种试剂，全年总合格率到9月份是7000万人份，其中国产的占71%左右。
我们对这几年的试剂进行了比较，除了检验合格以外，我们还对一些指标进行了更细化的分析。这个表格像07年对灵敏度和阳性检测率的检测，最低检出线6份里面有3个，从这个结果看出有一些是符合最低要求的。38批是在6份中测出4份，它的要求不能高。而且对于阳性参考阴性进行了分析，有20个阴性，这样能够测出18份，是阴性的就符合了要求。我要说明一下，20份中的2份不是整个流行的状况是百分之多少，实际上这里面的样品都是特殊的样品，并不是代表流行病学的状况。因为我们要选择有代表性的，能控制特性的指标，很多阴性里面就是很多试剂出现假阳性，所以20份里面如果有18份检测出阴性，这是符合要求的。我们对第四代诊断试剂进行了进一步分析，第四代既有检测抗体，又有检测抗原。我们在做它的评价时，对第四代诊断试剂的抗体情况和第三代相同，起码不能低于第三代诊断试剂抗体的水平，这样才能够保证抗体的指标。在这种情况下，我们对它的抗原也进行了评价，可以看到不同厂家的抗原检测情况也是不一样的，有的是5A、2.5A、3.2A，现在是属于有规律的，现在对它的特点也进行了分析。
从流行病学来讲，我们对不同的国内的、国外的诊断试剂，还有进口的诊断试剂，对它们进行了分析。很多是用自己的不同的亚性对这种诊断试剂进行比较和分析。从自己的分析来看，所有国内国外的诊断试剂，被检测的时候是没有太明显的区别。但是检测PC重组的时候可能会出现一定差异，可能在关键的时候会出现一些差距。另外，我们还用国际上的参考点进行分析，这是从美国、英国的研究中所制定的参考点，我们用这套参考点对国内上市做PP检的诊断试剂进行比较分析，但是它们的能力是不一样的。我们还有其他的A亚性、C亚性，不同试剂检测不同亚性的灵敏度还是有区别的。
国内有HIV2的病毒，这些检查试剂基本上都可以测试到，但是强度不一样。需要注意的是O组，前面讲的A、C都是M组的。O组的能否检测出来，因为这组病毒数量只是很小的一部分，这部分是不是能够检测出来，我们也进行了分析。可以看到，下面的试剂对O组的检测效果是比较好的，中间的试剂对O组的亚性样品是检测不出来的，这样说明我们国内的检测试剂在质量提高方面，在进一步提高检测能力方面还有待进一步提高。
诊断试剂进行评价最好的是阳转血清。就是这个人从没有感染之前，就开始收集他的样品。到他感染以后，出现核酸、抗原、抗体，用动态学的系列进行评价，这是评价诊断试剂最好的样品。也就是看什么时候能够检测出来，检测的时间早还是晚。我们通过从美国的BBI公司购买了这种阳转血清来评价我们的试剂。这张图的基线下面是检测时间短于对照试剂，基线检测时间是早于对照试剂。从这个结果可以看到，我们总共第三代试剂8家，在这8家中有2家是低于国外试剂的。实际上有4家是高于国外试剂的，后面的4个都是第四代诊断试剂。通过这个可以看到，我们国内的试剂并不比国外差，有些检测试剂时间早于国外的。从前面的分析来看，主要是用于血液筛查的诊断试剂质量得到了很大的提高，与国外的诊断试剂没有明显差异，而且我们国内用的大部分都是国产发明的。
对确证试剂来讲，前面用筛查试剂检查出来，确证试剂有两种，包括蛋白印迹法和线性免疫分析技术法。线性免疫分析相对比较好。这两类试剂在国内有两家进行了注册，国内至少有4家在研究。最近对确认试剂的使用可能有不确定的情况比较多，所以我们对这些样品也进行了分析，用国际上三种比较好的诊断试剂来检测不确定的药品，然后看检测效果怎么样。总共用了64份对样品进行检测，可以看到第一种确认试剂检测出56分是阴性的，另外8份是不确定的。所以对不确定样品你还要追踪三个月再检测一次，看抗体有没有变化，如果没有变化就可以判断是阴性，如果有变化就确定为感染。确认以后，检测出来的不确定率就比较高，尤其是64份里面有53份确定了，这种有反应是微弱的，刚刚阳性的，我们拿不准是阳性还是阴性的，需要确认。在这里，有的确认试剂反而不能够给你很好的诊断结果，确认之后还是不确定，这个工作量就增加了。实际上所有的都进行了核酸检测，有的还进行了追踪。
胶体金类快速检测试剂这几年发展的很快。它的特点是在检测的时候用仪器，保存时间比较长，使用起来比较方便，这是它的特点。在审批这部分试剂过程中，是要严格的检验，另外集中病人来进行手术。国内至少有7家企业生产这种试剂，而且国外有两家在中国进口，还有企业也在研究，这类试剂在国内到国外出口的也有一两家。
还有抗体诊断试剂，包括尿液抗体检测试剂，现在有一些检测唾液的检查。现在有一家ELISA试剂获准生产，还有多家企业在研制这类产品。另外还有唾液抗体检测试剂。除了前面说的以外，还有新技术检测HIV抗体诊断试剂。主要包括化学发光法和时间分解法。化学发光法的优点是灵敏度比较高，检测效果比较好。如第四代检测试剂检测出阳性，你可以检测出是抗体阳性还是其他的，这种方法国内在慢慢使用和研究，化学发光法是经过了研究的。
除了抗体的诊断试剂以外，另外还有抗原检测试剂。这个诊断试剂的用途在很早的时间，美国用了一段时间成本太高了，而且没有筛选出来，这个试剂目前主要用于实验室，对药物筛查或者研究过程来用。国内最早也批过P24，但是现在基本不生产了。HIV鉴定诊断试剂的用途，它主要是检测窗口期的情况，减少窗口期传播风险。实际在国外用这个东西比较多，尤其用于献血员的筛查。国内在申报方面有3家企业，已经有4家企业在做了。3家企业申报的所有东西已经做完，另外还有进口试剂，这些检测试剂有一批已经注册。核酸用于血筛查的检测试剂也是最近一两年。
另外还有核酸定量检测试剂，这个在我国的时间比较长。它主要对病程监控、效果进行检测，预防和要了解检测情况怎么样，有很多已经开始使用。我们国内所用的这种方法大部分主要使用核酸检测试剂，国内现在使用荧光检测法在这种检测试剂里面，有一些已经通过了，有一些单位已经在研制和申报。这部分的诊断试剂大部分都是国外的，现在很多的实验室都是国外的，有很多实验室都在使用。这里有几个已经注册，有几个正在注册中。
对定量来讲，最主要的就是要看不同的试剂之间检测的是不是一样的。不同的试剂表现方法是不一样的，有的适用拷贝表，有的使用单位表格，我们在换算过程中要换算成国际单位进行表述，来分析不同的试剂检测结果。也就是说，这个试剂检测是多少，和那个试剂检测的数据有没有可比性。对在国内注册的6家试剂都进行了比较，从这个结果可以看到，大部分都没有明显的差别，也就是说他的标准不在考虑之内。像这些它们的相关系数也是非常高的。如果抗病毒治疗的时候，前面用一个试剂，后面用另外一个试剂，那么用药的效果和检测的效果就会反映出来，并不是说这些试剂不能用，但是要客观的用药的情况。而且我们对他们病毒检测情况，在不同的范围内检测结果不一样，因为在不同的范围有不同的情况。所以在使用的时候，尤其更换试剂过程中，要对治疗效果进行更好的评价。
关于试剂研发的关键步骤
在实际研发过程中有主要的几个步骤，一个是主要原材料，包括抗原、抗体、核酸引物以及核酸探针等。另外工艺的优化以及确定，实验室的质量分析和临床研究。在实验室质量分析过程中包括以下的指标，包括分析灵敏度、分析特异性等等。对目前已研制出的参考品来讲，有很多HIV抗体的参考品，要对国内产品进行标化。如果没有国内的标化，要根据国外的情况来研制。现在基本上艾滋病的所有诊断试剂都已经研制出来包括抗体的、快速的、确认的、唾液的、尿液的。
还有临床评价的意义及目的。临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有限，并不能完全代表临床情况。遇到特殊的情况还要进行特殊的说明。
临床过程中还要考虑其他的情况，最主要的要考虑样品的情况、人群的情况、样品来源的情况。还要有对照试剂，如果没有，要用其他的临床方法。
最后，我国艾滋病试剂的研发和生产是多样化的，有些试剂已经规模化生产，有些正在研发中。用于血液筛查的试剂进行严格的管理，实行批批鉴定，而且国内的诊断试剂和国外的基本没有区别，国外最近对我们的试剂也进行了研究，认为我们的试剂质量还是不错的。核酸检测试剂发展相对较慢，和国外相比较，确实存在一定差距。今后包括科技部或者其他部门能够加强这方面的资助，促进核酸试剂的发展，对我国的HIV试剂发展可能更好。
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乙肝五项检测卡用途：体外定性检测人血清、血浆中的乙型肝炎表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体及核心抗体。产品说明：1&HBsAg试条玻璃纤维素膜上预包被金标抗HBsAg单抗(Au-sAb1)，在硝酸纤维素膜上分别在检测线和对照线处包被HBsAg单抗(sAb2)和羊抗鼠IgG。2HBsAb试条玻璃纤维素膜上预包被金标表面抗原(Au-sAg)，硝酸纤维素膜上分别在检测线和对照线处包被HBsAg和羊抗HBsAg。3&HBeAg试条玻璃纤维素膜上预包被金标抗-HBe单抗(Au-eAb1)一、通用名：乙型肝炎病毒表面抗原全血诊断试剂（胶体金法）HbsAg检测原理乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（胶体金法）采用金标免疫层析双抗体夹心技术，检测全血、血清或血浆中的HBsAg。先在玻璃纤维上预包被金标记的HBs单抗，然后在硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置上分别包被HBs多抗（检测线）和抗鼠IgG（质控线）。当进行检测时，样品垫只允许血清或血浆通过，可阻止血细胞的渗透。若为阳性标本，标本中的HBsAg可与金标记的HBs单抗结合形成复合物，此复合物由于层析作用沿试纸条向前移动，则与检测线上预包被的HBs多抗结合形成"金标记HBs单抗—HBsAg—HBs多抗"复合物而凝聚显色。若样品中没有HBsAg或HBsAg的含量低于检测限时，则不形成复合物而不显色。本金标试纸条适用于无偿献血人员的HBsAg现场检测。【试剂盒组成】1、HBsAg金标试纸条&25条/桶×4桶2、样品稀释液&4.0ml/瓶×2瓶3、说明书4、记录纸5、灭菌一次性采血针、毛细管、毛细管吸头【规格】100人份/盒【样本要求】全血、血清或血浆【操作步骤】1、将密封桶打开，取出所需数量的试纸条后，立即关好密封桶。2、将试纸条放在水平工作台面上平置并做好样本标记。3、用毛细管吸取40μl新鲜待检全血标本（血清或血浆标本则为80μl）滴于试纸条的样品垫上，立即在样品垫上滴加1滴（40~50μl）样品稀释液（血清或血浆标本则无须滴加样品稀释液）。4、30分钟内观察并记录实验结果。【结果判断】若为强阳性标本，则在几分钟内即可判断结果；若为弱阳性标本，则在30分钟内观察实验结果有效。阳性结果：试纸条在检测线和质控线位置上各出现一条紫红色条带。阴性结果：试纸条仅在质控线位置上出现一条紫红色条带。无效结果：试纸条在检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带。二、产品应用范围：&&&本公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原全血诊断试剂（胶体金法），以定性的方法快速检测全血中乙肝表面抗原（HBsAg），临床常用于无偿献血员现场初筛及临床急症手术前检测HBsAg。三、产品优势：全血、血清或血浆多种加样选择检测快速、操作方便、无需特殊仪器特异性强、灵敏度高（最低可检出0.1年）、有效期长（18个月）GMP、ISO双重认证、质量更有保证。通用名：乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂（胶体金法）【主要组成成分】1、HBsAb金标试纸条。2、使用说明书。【样本要求】1、采集静脉的血清、血浆样本必须在无菌条件下，并避免使用溶血、高血脂、高胆红素样本。2、如果血清和血浆样品收集后7天内检测，可置于2～8℃保存；大于7天须置-20℃以下冷冻保存。【试验方法】1、将试纸条取出，水平放置并作好标记。2、直接吸取约60μl标本血清（浆）滴在平放的试纸条箭头端的玻璃纤维上。3、加样20分钟后最终观察并判断结果。20分钟后试验结果无效。【结果判定】A、阳性：出现两条紫红色线，请参照下图判读结果。B、阴性：只有一条紫红色线在对照区出现。C、无效：不出现紫红色线。&【试验方法的局限性】本试剂只是定性筛选乙肝表面抗体的存在，不能确定样本中抗体的含量。【灵敏度和特异性】对血清（浆）中HBsAb的检测灵敏度是10mIU/ml。【注意事项】1、实验环境应保持一定湿度，避风。避免在过高温度下进行实验。2、试纸条从铝箔袋中取出后，应尽快进行实验，置于空气中时间过长，纸条会受潮失效。3、试纸条可在室温下保存，谨防受潮。低温下保存的试纸条应平衡至室温方可使用。二、产品应用范围：&&&本公司生产的乙型肝炎病毒表面抗体全血诊断试剂（胶体金法），以定性的方法快速检测全血中乙肝表面抗体（HBsAb），临床常用于无偿献血员现场初筛及临床急症手术前检测HBsAb。三、产品优势：全血、血清或血浆多种加样选择检测快速、操作方便、无需特殊仪器特异性强、灵敏度高（最低可检出0.1年）、有效期长（18个月）GMP、ISO双重认证、质量更有保证。HBeAg一通用名：乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂（胶体金法）【用途】临床检测人血清、血浆中的乙型肝炎病毒e抗原。【试验原理】HBeAg金标试纸条采用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上的检测区分别包被e
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合物所致的病理损害 ，红细胞对CIC的清除是通过红细胞膜结 marchOilthegonadotrophinsandmoods~tesofarmyofficers．MilMed，
构中的C3b受体识别与黏附GIG，并将其重运至患者肝脾内网 ：49―495．
状内皮系统 ，通过巨噬细胞破坏CIC，以达到清除免疫复合物的 目的，使机体保持免疫平衡状态。新兵训练是武警部队的主要 收稿：2010一O1―20 训练阶段之一，我们以武警部队实际训练为应激源，对军事应 本文编辑 ：方弘 激条件下新战士红细胞免疫功能的改变进行研究，结果显
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