谷氨酰胺转胺酶生产菌种的选育和其基因的表达--《浙江大学》2010年硕士论文
谷氨酰胺转胺酶生产菌种的选育和其基因的表达
【摘要】：谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶,EC 2.3.2.13)是一种能够催化酰基转移的酶,它们广泛分布在各种生物,包括人类、动物、植物和各种微生物体内。通过这种酰基转移反应可以使得体外多种蛋白质、多肽和各种氨基酸之间产生共价交联作用,从而改变各种食物蛋白的功能性质,因而其在食品工业中有着广泛的应用前景。
本文以获得谷氨酰转胺酶高产菌株为目标,通过对茂原链霉菌紫外诱变来选育高产菌株,并对产谷氨酰胺转胺酶发酵培养基和发酵条件进行了优化,初步研究了利用基因工程手段构建基因工程菌生产谷氨酰胺转胺酶。
将购买的菌株活化后,通过自然选育获得一株产酶能力为0.66 U/ml的原始菌株,并对该菌株孢子进行紫外线处理,经诱变筛选得到一株相对高产稳定的菌株,产酶能力达到0.88 U/ml,比原始菌株提高了33%。
以筛选得到的高产菌株为出发菌株,通过单因素和正交试验确定了产谷氨酰胺转胺酶培养基的最佳碳氮源组成为：淀粉25g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨15g/L黄豆饼粉30g/L,最佳培养条件为：以48h种龄的液体种子按8%的量接种,初始pH为7.0,培养温度为28℃,摇床转速为200rpm,培养时间为48h。谷氨酰胺转胺酶酶活力达到1.4U/ml。
以茂原链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到一条长为1224bp的谷氨酰胺转胺酶的基因片段,成功构建原核表达载体pGEX-TGase,并转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌经IPTG诱导产生GST-TGase融合蛋白,并对表达条件进行了优化,应用亲和层析方法纯化融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的蛋白获得了较高水平的表达。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：TQ925【目录】：
致谢4-5摘要5-6Abstract6-7目录7-9第一章 绪论9-23 1.1 概述9-15
1.1.1 谷氨酰胺转胺酶的来源9-10
1.1.2 TGase的结构10-12
1.1.3 TG的反应机理12-13
1.1.4 酶活检测方法13-15 1.2 谷氨酰胺转胺酶研究进展15-19
1.2.1 动植物组织中提取15
1.2.2 微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶15-17
1.2.3 基因工程表达生产MTG17-19 1.3 MTG的应用19-22
1.3.1 在肉制品中的应用19-20
1.3.2 在水产品中的应用20-21
1.3.3 在乳制品中的应用21
1.3.4 在大豆制品的应用21
1.3.5 在小麦制品中的应用21-22 1.4 研究意义和研究内容22-23第二章 产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选23-32 2.1 引言23 2.2 材料与方法23-27
2.2.1 实验材料23-25
2.2.2 实验方法25
2.2.3 分析方法25-27 2.3 结果与讨论27-31
2.3.1 谷氨酰胺转胺酶产生菌的初筛27-28
2.3.2 诱变育种28-31 2.4 本章小结31-32第三章 发酵条件的优化32-41 3.1 引言32 3.2 材料与方法32
3.2.1 实验材料32
3.2.2 实验方法32
3.2.3 分析方法32 3.3 实验结果与讨论32-40
3.3.1 种龄的确定32-33
3.3.2 培养基优化33-37
3.3.3 摇瓶发酵工艺条件的优化37-40 3.4 本章小结40-41第四章 谷氨酰胺转胺酶基因的融合表达41-54 4.1 引言41 4.2 材料与方法41-49
4.2.1 实验材料41-44
4.2.2 实验方法44-48
4.2.3 分析方法48-49 4.3 结果与讨论49-53
4.3.1 TGase基因的扩增49
4.3.2 诱导表达及条件优化49-52
4.3.3 目的蛋白的纯化52-53 4.4 本章小结53-54第五章 结论与展望54-56 5.1 结论54 5.2 展望54-56参考文献56-61攻读硕士学位期间的科研成果61
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京公网安备74号组织型转谷氨酰胺酶与人非小细胞肺癌细胞侵袭力的关系及其机制--《实用医学杂志》2013年21期
组织型转谷氨酰胺酶与人非小细胞肺癌细胞侵袭力的关系及其机制
【摘要】：目的:研究组织型转谷氨酰胺酶(tTG)表达与人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549和PAα侵袭力的关系,及其与表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)等肿瘤侵袭相关基因之间的关系。方法:Transwell法检测细胞株A549和PAα的侵袭力;RT-PCR法、Real-Time PCR法及Western blot检测A549和PAα细胞株中tTG、EGFR和MMP-2的转录和表达水平,观察使用tTG或EGFR抑制剂后PAα细胞中tTG、EGFR、p-EGFR和MMP-2的表达水平变化。结果:PAα细胞株的侵袭能力为A549的165.3倍(P0.05)。PAα细胞株的tTG、EGFR转录水平为A549细胞株的650.68(P0.05)和34.4(P0.001)倍。PAα细胞株的tTG、p-EGFR表达水平高于A549细胞株,MMP-2的转录水平在A549和PAα细胞株之间的差异没有统计学意义(P0.1),但PAα的MMP-2表达水平高于A549。结论:PAα相对于A549具有高的侵袭力;其机制可能与EGFR的高表达和磷酸化、tTG和MMP-2的高表达有关;tTG可调控MMP-2的水平但它本身不受EGFR信号通路的调控。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R734.2【正文快照】：
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占多数。组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)是转谷氨酰胺酶家族中的一员,是可以存在于细胞外、细胞浆内和细胞核内的一种多功能蛋白质,除催化蛋白质谷氨酰胺残基与赖氨酸残基
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组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中的作用研究
作&&&&者：
来&&&&源： 华中科技大学
摘&&&&要：
第一部分tTG抑制剂对人晶状体上皮细胞表达FN、Col-Ⅳ的影响研究
目的观察组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)抑制剂单丹磺酰尸胺monodansyl-cadaverine (MDC)对转化生长因子β2 (transforming growth factor-β2, TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells, HLECs)表达纤维连接蛋白(Fibrone-ctin, FN)和Ⅳ型胶原(collagenⅣ, Col-Ⅳ)的影响。
方法将体外培养的人晶状体上皮细胞株HLE-B3分为5组：无血清培养基中培养的HLE-B3为正常对照组；加入10μg/L TGF-β2处理36h的HLE-B3为TGF-p2组;10μg／LTGF-p2与100、200和400μmol/L MDC共同处理36h的HLE-B3为不同浓度MDC组。用半定量RT-PCR检测tTG、FN、Col-Ⅳ在HLE-B3细胞中表达的变化。
结果正常体外培养的HLE-B3细胞中可表达一定量的tTG, FN及Col-Ⅳ。与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG, FN和Col-Ⅳ的表达明显增强,差异有统计学意义(P0.01)。与TGF-β2组相比,100、200和400μmol/L MDC组中FN和Col-Ⅳ的表达含量明显减少(P0.01)。100、200和400μmol/L MDC组各组间FN和Col-Ⅳ的表达差异亦具有显著性意义(P0.01)。
结论MDC可剂量依赖性的抑制TGF-p2诱导的LECs中FN和Col-Ⅳ表达的增加。tTG可能通过促进HLECs表达FN和Col-Ⅳ等细胞外基质成分参与白内障术后后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO)的形成。
第二部分RNA干扰对人晶状体上皮细胞tTG表达的影响研究
目的研究RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)对人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells, HLECs)中tTG表达的影响。
方法设计并合成特异性针对tTG的3对小干扰RNA(short interfering RNA, siRNA): siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3,用Real-time RT-PCR和Western blot法检测转染了siRNA后人晶状体上皮细胞株(HLE-B3)中tTG基因在mRNA水平和蛋白水平的变化。
结果转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-348h后,tTG mRNA的表达分别下降为空白对照组的46.60%,12.84%,66.75%,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-360h后,tTG蛋白的表达含量分别下降为空白对照组的60.49%,27.87%,55.91%(P0.01)。Real-time RT-PCR与Western blot检测结果一致显示了siRNA-2对tTG基因的抑制效果最佳。
结论我们设计并合成的靶向tTG的siRNA可以显著降低tTG的表达。
第三部分tTG-siRNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的作用研究
目的探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)的表达对人转化生长因子β2(transforming growth factorβ2, TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells, HLECs)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。
方法将体外培养的人晶状体上皮细胞株HLE-B3分为正常对照组,TGF-β2组和TGF-β2+siRNA组。Western blot法检测各组细胞tTG、α平滑肌肌动蛋白(a-Smooth muscle actin, a-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)和Ⅳ型胶原(collagen IV, Col-IV)的表达。
结果与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显增加(P0.01)；与TGF-β2组相比,TGF-β2+siRNA组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显减少(P0.01)。
结论靶向tTG的siRNA可以明显抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞合成a-SMA、FN、Col-Ⅳ。提示tTG是介导TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的重要分子,tTG蛋白有望成为预防和治疗后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO)的新靶点。
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? 摘要12-15
? Abstract15-18
? 第一部分 tTG抑制剂对人晶状体上皮细胞表达FN、Col-Ⅳ的影响研究18-35
1 材料与方法18-23
2 结果23-24
3 讨论24-27
参考文献27-31
? 第二部分 RNA干扰对人晶状体上皮细胞tTG表达的影响研究35-54
1 材料与方法35-44
2 结果44-45
3 讨论45-48
参考文献48-50
? 第三部分 tTG siRNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的作用研究54-70
1 材料与方法54-61
2 结果61-62
3 讨论62-65
参考文献65-68
? 综述70-96
? 附录96-97
中国学术期刊网络出版总库[1] 王辉;刘哲丽;郝旭红;徐丽;;;国际眼科杂志;2007年02期[2] 陈春林;叶剑;;;眼科新进展;2008年01期[3] 王欣玲,张劲松,于韬;;中华眼科杂志;2005年04期
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人抗组织转谷氨酰胺酶抗体IgA(tTG-IgA)ELISA定量检测试剂盒
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