(请问）关于免疫组化的详细操作步骤(免疫组化,淋巴结,组织石蜡切片,试剂盒) - 免疫实验 - 生物秀
标题: (请问）关于免疫组化的详细操作步骤(免疫组化,淋巴结,组织石蜡切片,试剂盒)
摘要: [(请问）关于免疫组化的详细操作步骤(免疫组化,淋巴结,组织石蜡切片,试剂盒)] 我是一个新手，现在做免疫组化遇到很多的问题，我也不知道是不是我的操作步骤有问题，想在这里问问各位大虾们，能不能提供一下免疫组化具体的操作步骤，很详细的那种。我现在做得是人淋巴结组织石蜡切片，用的是中衫的一抗和二抗试剂盒。谢谢！！！ 关键词:[免疫组化 组织石蜡切片 淋巴结 试剂盒 二抗 一抗]……
我是一个新手，现在做免疫组化遇到很多的问题，我也不知道是不是我的操作步骤有问题，想在这里问问各位大虾们，能不能提供一下免疫组化具体的操作步骤，很详细的那种。我现在做得是人淋巴结组织石蜡切片，用的是中衫的一抗和二抗试剂盒。谢谢！！！
操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将玻片放在60℃恒温箱中烘烤30分钟。 1）玻片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟；5）50%乙醇中浸泡5分钟2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织。 （1）高压热修复 在沸水中加入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾，放入玻片加热10~15分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将玻片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。3、免疫组织化学染色 SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2滴加，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液（根据你用的抗体选用血清）,室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）PBS洗3次各5分钟；13）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；14）PBS或自来水冲洗10分钟；15）苏木精复染30秒，盐酸酒精分化；16）自来水冲洗10～15分钟；16）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染30秒、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。祝试验顺利！回复
免疫组化操作规程（一）、设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅（二）、
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色
SP法 1）脱蜡、水化； 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复； 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 15）PBS或自来水冲洗10分钟； 16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 17）自来水冲洗10～15分钟； 18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 4)抗原修复。 5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 8)PBS洗三次每次2分钟。 9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 10)PBC洗3次每次2分钟。 11)滴加SABC，20℃～37℃20分钟。 12)PBS洗4次每次5分钟。 13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。回复你用的是中衫的一抗和二抗试剂盒，那么你肯定是SP法，又是用石蜡切片，故应采用以下详细步骤：1. 脱蜡、水化1）二甲苯Ⅰ15min2）二甲苯Ⅱ15min3）二甲苯：100％乙醇（1：1）15min4）100％乙醇Ⅰ10min5）100％乙醇Ⅱ10min6）95％、90％、80％、70％、50％、重蒸水各8－10min7）0.01M PBS（PH7.2－7.4）2次，5min/次2. 3%H2O2(甲醇配制：90ml甲醇＋10ml H2O2)灭活内源性过氧化物酶20min3. PBS洗涤3次×5min4. 枸橼盐缓冲液（pH6.0左右）热修复15min（具体见你的试剂盒而说明书）。5. 自然冷却后，PBS洗涤3次×5min。6. 滴加正常山羊血清封闭液，37度30min.7. 倾去多余液体，滴加合适稀释比例的一抗，37度2h（恒温箱中）或4度过夜。（4度过夜相对较好）8. PBS洗涤3次×5min。9. 滴加二抗，37度45－60min。10. PBS洗涤3次×5min。11. 滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液（有时也习惯称为三抗），37度45－60min。12. PBS洗涤3次×5min。13. DAB显色，显微镜下控制显色时间.14. 停显。自来水洗涤3次×5min停显。15. 苏木精复染（根据你的需要决定该步的取舍）16. 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。17. 观察、拍照等。回复谢谢上面的三位。我现在想说下我的情况，请大家给我指正一下，因为我的确没做出来，不知道是不是我操作的问题。但是别个这样做都能出结果的啊！！！我是用的中衫的一抗和二抗，SP法，石蜡切片步骤如下：1、脱蜡，水化：二甲苯3分钟－二甲苯10分钟－无水乙醇2分钟－95％酒精－80％酒精－75％酒精－自来水－蒸馏水PS：这步做完之后往往出现严重的脱片，很多片子都不能再用了。还有就是片子放在液体里是单纯的浸泡还是需要振荡？2、3％H2O2室温下孵育10分钟，蒸馏水洗2分钟×3次3、抗原热修复：枸橼酸盐缓冲液中置微波炉内加热至沸腾后断电，间隔10分钟后再加热，重复3次。取出室温冷却20分钟。PBS洗5分钟×3次。4、5－10％山羊血清封闭，室温孵育10分钟。5、倾去血清，滴加一抗工作液，4摄氏度过夜。6、PBS洗5分钟×3次7、加二抗工作液，37摄氏度30分钟。PBS洗5分钟×3次8、加辣根酶标记链霉卵白素工作液37摄氏度孵育20分钟，PBS洗5分钟×4次。9、显色剂显色：DAB显色5－10分钟。10、自来水充分冲洗，用苏木素复染5－10秒后自来水充分冲洗，自然晾干11、中性树脂封片。回复1、脱蜡之前需要 烤片；片子在脱蜡的时候不需要振荡的2、3％H2O2洗的时候可以适当的用摇床晃动，之后用PBS洗3、抗原修复的时候用高压修复效果比较好4、山羊血清封闭的时候孵育一般在半小时到45分钟5、4度过夜后拿出，室温复温半小时后再用PBS洗6、还有就是你组织本身的质量怎么样？或者说抗体有没有问题？回复谢谢上面的给我的建议，我想具体再问一下：1、脱蜡之前烤片具体怎么进行？温度和时间是怎么样的？2、抗原修复用热修复的具体操作是什么？3、过夜后取出室温复温是在室温下放置半个小时吗？回复1、烤片时将片子放入40度的烤片机或者烤片大概3小时，也可以60度烤片1小时左右，烤片温度最好不要超过60度。2、高压热修复是在高压锅中加入（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）加热。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，在小阀门将升起来时开始计时10分钟，后去除热源，自然冷却或将高压锅置入凉水中冷却，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。3、过夜后将湿盒从4度冰箱中取出，在室温下放置半小时～45分钟。
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下步如何治疗？
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希望提供的帮助：
最近（11月2日）体检b超，ct诊断两肝转移，下步如何治疗？现在进行放疗。现在马上放疗完毕。下步服什么中药好？
治疗情况：
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你好，最好加用化疗，化疗药物最好做适当调整，中药可以咨询正规医院中医科医生。
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谢谢您的答复，请您给我提供一个化疗方案（用什么化疗药物最好），再次深深的感谢您！
&副主任医师
不好意思让您久等了，针对乳腺癌复发转移患者没有最好的化疗药及方案，只有较适合的药物及方案，原则是尽量选用以前未用过或用后效果较好（临床无瘤期较长）的药物，能单药尽量单药开始，尽量选用对重要脏器损伤较小的药物，用药过程中要严密观察转移灶的变化，如无明显效果或反而临床进展，就需要及时换药。建议多西他赛或卡倍他滨单药开始。内分泌药物继续服用。祝早日康复！
状态：就诊前
再次谢谢您，听说肝转移对放疗不敏感，放疗停止吗?(正进行放疗（两肝各10次），已放疗10次)
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转移性乳腺癌没有过多限制，原则是有效，只要有效，就坚持做完。
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谢谢您的答复，目前正化疗（环磷酰胺0.6mg,表柔比星50mg,5-fu750mg,)更换内分泌治疗更换成什么好呢？
&副主任医师
内分泌药物可以换回三苯氧胺，也可以改用依西美坦。
状态：就诊前
阿那曲佐和三苯氧胺同时服可以吗？谢谢您！
&副主任医师
个人意见，不太赞同两类药物同时服用，如果经济条件好，可以换一种芳香化酶抑制剂，比如依西美坦（加或不加依维莫司），或雌激素受体下调剂氟维司群，如果经济条件一般，直接换三苯氧胺。
状态：就诊前
谢谢您，化疗行几个周期为好，再服口服化疗药行吗？
&副主任医师
开始化疗就最好做足量，如果转移灶明显缩小，建议六周期做全，结束后也可以服用希罗达（卡培他滨）。但希罗达较贵。
状态：就诊前
再次深深的谢谢您！口服希罗达从什么时候开始，化疗（环磷酰胺0.6mg,表柔比星50mg,5-fu750mg,)11月20日结束。
&副主任医师
患者现在一般情况好吗？有没有严重不良化疗反应，转移灶影像学表现有没有明显缩小，如果综合治疗有明显效果，可以暂时不用口服卡培他滨，继续坚持内分泌药物治疗，如果病灶变化不大或有进展，就换用卡培他滨继续治疗。
状态：就诊前
患者目前精神还可以，化疗没有严重不良反应，目前在家修养，转移灶影像学没做，想在家口服希罗达，行吗？内分泌药物治疗服三苯氧胺吗？还是其他。再次深深的谢谢您！
&副主任医师
在口服希罗达前最好有影像学检查，以备观察疗效，内分泌可以换回三苯氧胺。
状态：就诊前
谢谢您，口服希罗达从什么时候开始？还需要服中药吗？（我是甘肃正宁县人，我母亲病愈后，我来兰州看您）
&副主任医师
希罗达近期就可以开始口服，中药最好找正规中医咨询，欢迎来兰交流。
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