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血化验单解读
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检验科 超氧化物歧化酶（SOD）检测的临床意义
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检验科 超氧化物歧化酶（SOD）检测的临床意义
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生化练习题0912_答案
相蛋白质。 血浆蛋白的多态性：是指在同种属的个体或人群中出现两种或多种不同表型的某种蛋白质。 非蛋白氮：除蛋白质以外的含氮化合物中所含的氮总称为非蛋白氮（NPN）。血液中非蛋白含氮物主要是尿素，另外含有尿酸、肌酸、肌酐、氨基酸、胆红素、氨等，它们绝大部分是蛋白质和核酸分解代谢的产物。由血液运送到肾排泄，当肾功能严重损伤时，因排出受阻使血中NPN升高，临床上通过测定血中NPN含量了解肾的排泄功能。 2，3-BPG旁路：2，3-BPG旁路是成熟红细胞特有的代谢途径。由糖酵解产生的1，3-BPG在2，3-BPG变位酶催化下生成2，3-BPG，然后再由2，3-BPG磷酸酶催化，水解生成3-磷酸甘油酸，又重新回到酵解通路，构成2，3-BPG旁路。由于2，3-BPG变位酶的活性大于2，3-BPG磷酸酶的活性，故成熟红细胞中的2，3-BPG的含量很高； 内源性凝血途径：血管内膜受损或血管外与异物接触时触发的凝血过程。此过程所有参与激活因子Ⅹ的成分都存在于血液中。 外源性凝血途径：组织损伤后组织因子（因子Ⅲ）进入血液而启动凝血过程； 卟啉症：铁卟啉合成代谢异常而导致卟啉或其中间代谢物排出增多，称为卟啉症。分先天性和后天性两类。 凝血因子：是参与血液凝固的因子的总称。共有14种凝血因子，除因子Ⅲ、Ⅳ外，均为糖蛋白。 ? 问答题： 1、 试述红细胞的氧化还原系统。 红细胞氧化还原系统包括：NAD+/NADH+H、NADP/NADPH+H,GSSG/GSH等。它们具有抗氧化剂的作用，维持含有巯基的酶及膜蛋白的还原状态，防止血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白。 （1）谷胱甘肽和NADPH：当细胞内产生H2O2时，GSH使H2O2还原成H2O，自身被氧化成氧化性谷胱甘肽（GSSG）。GSSG在谷胱甘肽还原酶催化下还原成GSH，辅酶是NADPH。NADPH主要来源于磷酸戊糖途径。 （2）高铁血红蛋白的还原主要依靠NADH脱氢酶，辅酶是NADH。糖酵解的过程产生的NADH主要用于丙酮酸还原为乳酸，而糖醛酸途径中产生的NADH主要用于高铁血红蛋白的还原。 2、 试述抗凝血成分的种类及抗凝血的作用机制。 体内有三种主要的抗凝成份：抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、蛋白C系统和组织因子抑制物。 （1）抗凝血酶Ⅲ：AT-Ⅲ是血浆中最重要的生理性抗凝物质，它是一种α球蛋白。主要由肝合成。AT-Ⅲ除能持久的灭活凝血酶以外，还能抑制凝血因子Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa、Ⅻa、纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶，引起抗凝。 （2）蛋白C系统：蛋白C系统包括蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、蛋白C抑制物。PC、PS都由肝脏合成，都是依赖Vk的糖蛋白。激活的PC（APC）通过蛋白水解作用可使凝血因子Ⅴa、Ⅷa、灭活，从而阻碍了因子Ⅹa与血小板结合，大大降低因子Ⅹa的凝血活性。PS作为APC的辅因子加速APC对因子Ⅴa的灭活。蛋白C抑制物能与PC结合形成复合物而灭活APC。 （3）组织因子抑制物（TEPI）：主要来自小血管内皮细胞，能直接抑制因子Ⅹa而抑制凝血。其化学本质是单链的糖蛋白。 3、 简述成熟红细胞糖代谢的特点及红细胞中ATP的主要生理功能。 糖代谢的特点：不进行糖的有氧氧化，糖酵解是其获得能量唯一途径。糖酵解存在2，3-BPG旁路，此旁路占糖酵解的15%-50%,其主要功能在于调节血红蛋白的运氧功能。 ATP的主要生理功能：维持红细胞膜上钠泵（Na+-K+-ATPase）、钙泵（Ca2+-ATPase）的正++常运转；维持红细胞膜上脂质的更新；谷胱甘肽与NAD的合成；葡萄糖的活化，启动糖酵解通路。 4、 血红素的合成有何特点？ （1）血红素主要在骨髓的幼红细胞和网织红细胞合成，成熟红细胞不含线粒体，不能合成血红素。 （2）血红素合成的原料是琥珀酰CoA、甘氨酸和Fe等简单小分子物质，其中间产物的转变主要是吡咯环侧链的脱羧和脱氢反应。 （3）血红素合成的起始和终末阶段均在线粒体中进行，这种定位对终产物血红素的反馈调节作用具有重要意义。 5、 参与血红素生物合成的调节因素有哪些？ 血红素合成的最主要调节步骤是ALA的合成。参与血红素生物合成的调节因素有 （1）ALA合酶的调节：ALA合酶是血红素生物合成的限速酶，受血红素的反馈抑制。如果血红素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，过多的血红素氧化成高铁血红素，后者对ALA合酶有强烈的抑制作用。磷酸吡哆醛是ALA合酶的辅酶，VB6的缺乏将减少血红素的合成。某些类固醇激素能诱导ALA合酶的合成，从而促进血红素的生物合成。 （2）ALA脱水酶及亚铁螯合酶的调节： ALA脱水酶及亚铁螯合酶不属于血红素合成的关键酶，但对铅和重金素的抑制非常敏感。血红素合成的抑制是铅中毒的重要体征。还原剂的缺乏也会抑制血红素的合成。 （3）促红细胞生成素（EPO）的调节：EPO主要在肾脏合成，缺氧时释放入血。能加速有核红细胞的成熟以及血红素和血红蛋白的合成，促进原始红细胞的繁殖和分化，是红细胞生长的主要调节剂。 6、 概述血浆蛋白质的生理功能 （1） 维持血浆胶体渗透压；(2)维持血浆正常的pH；(3)运输；(4)免疫；(5)催化；(6)营养；(7)凝血、抗凝血和纤溶作用。
第十七章 肝的生物化学 思考题： 1.肝功能不良时，下列哪种蛋白质的合成受影响最小 A.清蛋白；B.凝血酶原；C.凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ等；D.免疫球蛋白；E.纤维蛋白原 2.肝脏进行生物转化时活性硫酸供体是 A.H2SO4；B.PAPS；C.牛磺酸；D.半胱氨酸 3.急性肝炎时血清中哪种酶的活性改变最显著 A.LDH；B.CPK；C.GPT；D.GOT； 4.下列哪种不是肝在脂类代谢中的特有作用 A.酮体的生成；B.LDL的生成；C.VLDL的生成；D.胆汁酸的生成；E. LCAT（）的生成 5.在正常生理条件下，在肝外仍可进行的代谢是 A.酮体的生成；B.糖异生作用；C.尿素合成；D.胆固醇合成； 6.肝昏迷时，患者血液生化指标升高的有 A.支链氨基酸；B.芳香族氨基酸；C.血NH3；D.尿素 7.狗切除肝脏后，在未死亡前，可观察到哪些物质代谢指标会有重大变化 A.血氨升高；B.血清游离胆红素增高；C.血酮体增高；D.血浆蛋白质降低 8.严重肝功受损时，血中可能出现 A.血中类固醇激素水平增加；B.胆固醇酯增高；C.凝血酶原减少；D.清蛋白/球蛋白降低 9.主要在肝脏进行的物质代谢有 2++A.血糖合成；B.酮体生成；C.尿素合成；D.激素灭活 10.下列哪些酶只存在于肝脏中 A.葡萄糖激酶；B.G-6-P酶；C.己糖激酶；D.精氨酸酶 11.胆汁酸合成的限速酶是 A.26-α羟化酶；B. 1-α羟化酶；C.7-α羟化酶；D.还原酶 12.可转变为胆汁酸的物质是 A.胆红素；B.胆固醇；C.维生素D；D.类固醇激素 13.A.胆汁；B.胆固醇；C.胆绿素；D.血红素；E.胆素 （1）在体内转变生成胆色素的原料是
（2）在体内转变生成胆汁酸的原料是 14.对于胆汁酸盐的叙述恰当的是 A.它可经肠肝循环被重吸收；B.它是胆色素的衍生物；C.它是在肝脏由胆固醇转变而来；D.它是乳化剂 15.下列属于次级胆汁酸的有 A.7-脱氧胆酸；B.牛磺胆酸；C.石胆酸；D.鹅脱氧胆酸 16.苯巴比妥治疗新生儿黄疸的机制是 A.诱导葡萄糖醛酸基转移酶的生成；B.肝摄取胆红素能力增加；C.使Y蛋白合成减少；D.使Z蛋白合成增加； 17.胆红素在血液中主要与哪一种血浆蛋白结合 A.清蛋白；B.α2-球蛋白；C.γ-球蛋白；D.β-球蛋白 18.肝中与胆红素结合的最主要基团是 A.硫酸根；B.乙酰基；C.葡萄糖醛酸基；D.甲基；E.以上都不是 19.体内胆色素主要来自于下列哪一种物质的分解 A.铁卟啉化合物；B.胆固醇；C.类固醇激素；D.胆酸；E.肌酸 20.下列哪种物质是结合胆红素 A.胆红素-清蛋白；B.胆红素-Y蛋白；C.胆红素-Z蛋白；D.双葡萄糖醛酸胆红素；E.胆红素结合珠蛋白 21.有关游离胆红素的叙述，正确的是 A.又称为间接胆红素；B.属于脂溶性物质，易通过细胞膜对脑产生毒性作用；C.镇痛药及抗炎药等可降低其对脑的毒性作用；D.不易经肾随尿排出； 1.D；（2001）2.B；3.C；4.B（2002）（LCAT：卵磷脂脂酰转移酶）；5.D；6.BC（1993）；7.ABD（1994）；8.ACD；9.ABCD；10.ABD；11.C；12.B；13.DB（1999）;14.ACD；15.AC（1996）；16.A；17.A；18.C（1992）（胆红素2/3以上与葡萄糖醛酸基结合）；19.A（1989）；20.D（2006）；21.ABD（2002） 名词解释 生物转化：机体对内外源性的非营养物质进行的氧化、还原、水解以及各种结合反应，增加其水溶性和极性，利于从尿或胆汁排出体外； 加单氧酶系：此酶系统存在于肝细胞微粒体，由细胞色素P450（血红素蛋白）和NADPH-细胞色素P450还原酶（黄酶）组成。又称羟化酶或混合功能氧化酶，属于氧化还原酶类； 微粒体乙醇氧化系统：是乙醇-P450加单氧酶，其催化的产物是乙醛，仅在血中乙醇浓度很高时此系统被诱导而显示催化作用，乙醇诱导MEOS活性不但不能使乙醇氧化产生ATP，还可加大对氧和NADPH的耗竭。而且还可催化脂质过氧化产生羟乙基自由基，后者可进一步促进脂质过氧化，引发肝损伤； 初级胆汁酸：由肝细胞以胆固醇为原料合成的胆汁酸及其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物，包括胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸； 次级胆汁酸：初级胆汁酸经肠菌作用产生的胆汁酸及其结合产物，包括脱氧胆酸、石胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊脱氧胆酸等。 胆汁酸的肠肝循环：在肝细胞合成的初级胆汁酸，随胆汁进入肠道并转变为次级胆汁酸。肠道中约95%胆汁酸可经门静脉被重吸收入肝，并与肝新合成的胆汁酸一起再次被排入肠道，此循环过程称胆汁酸的肠肝循环。 游离胆红素：在血浆中主要与清蛋白结合而运输的胆红素称为游离胆红素或未结合胆红素，为脂溶性，不能经尿排出，易透过细胞膜产生毒性作用。 结合胆红素：胆红素在肝细胞内与葡萄糖醛酸结合生成的葡萄糖醛酸胆红素称为结合胆红素，为水溶性，无毒性，可从尿中排出。 黄疸：胆红素为橙黄色物质，血浆胆红素高于正常水平可扩散进入组织造成黄染，这一体征称为黄疸。根据黄疸病因不同可将黄疸分为：溶血性黄疸、肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸。 ? 问答题 1.简述结合胆红素与游离胆红素的区别及其临床诊断意义。 区别：①游离胆红素是指在血浆中主要与清蛋白结合而运输的胆红素。具有脂溶性、不能透过肾小球滤过随尿排出、易透过细胞膜产生毒性及与重氮试剂呈间接反应等特点。 ②结合胆红素是指在肝细胞内与葡萄糖醛酸结合生成的葡糖醛酸胆红素。具有水溶性、能透过肾小球随尿排出、无毒性及与重氮试剂成直接反应等特点。 临床意义：①血浆游离胆红素增高主要来源于胆红素的来源过多如溶血性黄疸；其次见于游离胆红素处理受阻如肝细胞性黄疸；②血浆结合胆红素增高主要见于阻塞性黄疸，其次见于肝细胞性黄疸；③血浆游离胆红素和结合胆红素均轻度增高见于肝细胞性黄疸。 2.如何理解肝系多种物质代谢之中枢？ ①肝是维持血糖相对稳定的重要器官，主要通过肝糖原合成、分解及糖异生作用实现。②肝在脂类消化、吸收、分解、合成和运输中均其重要作用。酮体是肝特有的代谢中间物。③肝可合成多种血浆蛋白质，又是氨基酸分解和转变等方面起的重要场所；肝是合成尿素的唯一器官。④肝在维生素的吸收、储存和转化等方面起重要作用。⑤肝参与激素的灭活以及非营养物质的生物转化等。 3.简述肝微粒体加单氧酶系的组成、作用特点生理意义。 ①加单氧酶系至少包括两种组分：一种是细胞色素P450（血红素蛋白），另一种是NADPH-细胞色素P450还原酶（以FAD为辅基的黄酶）。 ②此酶特点在于催化O2中一个氧原子加到底物中形成羟化物，另一个氧原子则被NADPH还原成水，故又称羟化酶或混合功能氧化酶。 ③意义在于参与体内很多重要物质的合成以及非营养物质的生物转化等。 4.简述胆汁酸的主要生理功能。 ①促进脂类物质的消化与吸收；②维持胆汁中胆固醇的溶解状态以抑制胆固醇结石形成。 5.简述胆汁酸的肠肝循环及其生理意义。 ①肠道中95%的胆汁酸经门静脉重吸收入肝，并同新合成的胆汁酸一起再次被排入肠道，此循环过程称胆汁酸的肠肝循环。 ②生理意义在于可使有限的胆汁酸库存循环利用，以满足机体对胆汁酸的生理需要。 6.何谓生物转化？其生理意义、影响因子及特点是什么？ 生物转化是指机体对内、外源性的非营养物质进行氧化、还原、水解以及各种结合反应，增加其水溶性和极性，利于从尿或胆汁排出。肝是生物转化重要器官。
生理意义在于：一是可对体内的大部分非营养物质进行代谢转化，使其活性降低或丧失（灭活），或使有毒物质的毒性减低或消除（解毒）。两者可使这些非营养物质的水溶性和极性增加，易于从尿或胆汁中排出。但不能笼统的将肝的生物转化看作是“解毒作用”。
生物转化受年龄、性别、营养、疾病、遗传以及异源物诱导等影响，并具有转化反应的连续性、反应类型的多样性及解毒与致毒的双重特点。 7.为何甲亢病人血清胆固醇浓度会降低？
甲状腺素可诱导胆汁酸合成的限速酶7α-羟化酶的合成，促进胆固醇转变成胆汁酸，因此甲亢病人血清胆固醇含量偏低。 8.胆固醇和胆汁酸之间的代谢有何关系？ ①胆汁酸是以胆固醇为原料在肝内合成；②胆汁酸的合成受肠道向肝内胆固醇转运量的调节。胆固醇在抑制HMG-CoA还原酶从而减少体内胆固醇合成的同时，还增加胆固醇7α-羟化酶基因的表达，从而使胆汁酸的合成量亦增多。③胆固醇的消化、吸收及排泄均受胆汁酸盐的影响。 9.简述肝在胆红素代谢中的作用。 肝脏通过对胆红素的摄取、结合转化与排泄，使血浆的胆红素不断经肝细胞处理而被清除。①肝细胞特异性膜载体从血浆中摄取游离胆红素；②胆红素进入肝细胞胞浆后与Y蛋白或Z蛋白结合，并运至内质网与葡萄糖醛酸结合转化为结合胆红素；③结合胆红素从肝细胞经胆小管排泄入胆汁中。 10.胆汁酸和胆素原肠肝循环有何异同点？ 相同点：两者均系代谢物在肠道与肝脏之间的循环过程。 不同点：①在胆汁酸肠肝循环中，由肝脏分泌到肠道的各种胆汁酸一起排入肠道。而胆色素肠肝循环中，肠中产生的胆素原10%-20%被肠重吸收，其中大部分又以原形重新随胆汁排入肠，仅小部分进入体循环从尿排出；②胆汁酸的肠肝循环可使有限的胆汁酸库存循环利用，以满足人体对胆汁酸的生理需要。而胆色素的肠肝循环没有任何生理意义。 11.简述胆红素的来源和去路。 来源：①80%以上源于衰老红细胞释出的血红蛋白的降解；②其余来自其他铁卟啉类化合物。去路：①胆红素入血后与清蛋白结合成血胆红素（又称游离胆红素）而被运输；②被肝细胞摄取的胆红素与Y蛋白或Z蛋白结合后被运输到内质网，在葡萄糖醛酸转移酶催化下生成胆红素-葡萄糖醛酸酯，称为肝胆红素（又称结合胆红素）；③肝胆红素随胆汁进入肠道，在肠道细菌作用下生成无色胆素原，大部分胆素原随粪便排出。小部分胆素原经门静脉被重吸收入肝，其余的大部份又被肝细胞再分泌入肠，构成胆素原的肠肝循环；④重吸收的胆素原少部分进入体循环，经肾由尿排出。 12.试述三种黄疸时血、尿及粪中胆色素的实验室检查变化。 指标 血清胆红素 浓度 结合胆红素 游离胆红素 尿三胆 尿胆红素 尿胆素原 尿胆素 粪便颜色 正常
<1mg/dl 极少 0-0.7mg/dl
- 少量 少量 正常 溶血性黄疸
- ? ? 深 阻塞性黄疸
>1mg/dl ??
++ ? ? 完全阻塞时白陶土色 肝细胞性黄疸
>1mg/dl ? ?
++ 不一定 不一定 变浅或正常
第十八章 维生素与微量元素 ? 思考题 1.B族维生素的主要生理功能是参与组成辅酶，下列哪项叙述是不正确的
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不饱和脂肪酸修饰超氧化物歧化酶的制备和性质研究
⑧谢己工工誓女莓硕士学位论文论文题目：丕丝独盥堕酸丝笪超氢丝堑蝗丝堕的剑备塑性亟盟窒作者姓名 指导教师旦查型兰焦鲞塾蕉 圭生！蕉型墼蕉学科专业 所在学院麴堑垡堂药堂瞳提交日期２ＱＱ９生垒旦１２旦浙江工业大学硕士学位论文不饱和脂肪酸修饰超氧化物歧化酶的制备和性质研究摘要过量的活性氧的产生容易损害生物大分子物质如蛋白质、脂质、 核酸等，引起各种各样的疾病如炎症、糖尿病、癌症和神经变性性疾 病。超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）是一类能够专一清 除超氧阴离子自由基的金属酶，在机体的抗氧化防御体系中占有重要 的地位，被广泛的用作药用酶预防和治疗上述疾病。然而，由于ＳＯＤ 存在半衰期短、稳定性差、不易透过细胞膜等缺陷，实际应用价值受 到了极大的限制。 本实验采用两种不同的合成方法用亚油酸和仪．亚麻酸修饰 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ，以期提高ＳＯＤ的稳定性和亲脂性。对修饰后ＳＯＤ的活 性保持率，热稳定性，耐酸碱性和抗胃蛋白酶，胰蛋白酶水解稳定性，表观油水分配系数研究表明，亚油酸和０【．亚麻酸较大分子物质修饰ＳＯＤ活性保持率高，修饰后ＳＯＤ热稳定性，酸碱稳定性，抗蛋白酶 水解稳定性显著提高，特别是表观油水分配系数也增大了。这说明不 饱和脂肪酸修饰ＳＯＤ可以增强其稳定性，提高生物利用度，有望作 进一步药学性质研究。关键词：超氧化物歧化酶，不饱和脂肪酸，化学修饰，稳定性，油水 分配系数浙江工业大学硕士学位论文ＰＲＥＰＡＲＡＴＩｏＮ ＡＮＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩｏＮ ｏＦ Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＵＰＥＲＯＸＩＤＥＤＩＳＭＵＴＡＳＥ ＣＯＶＡＬＥＮＴＬＹＭｏＤＩＦＩＥＤＢＹ ＰｏＬＹＵＮＳＡＴＵＲＡ，ｒＥＤ Ｉ诌ＴＴＹ ＡＣＩＤＳＡＢＳＴＲＡＣＴ，”１．‘＾●●１ ｈｅｇｅｎｅｒａｔｍｎｔｏ０ｔｅｘｃｅＳＳｌＶｅｒｅａｃｔｌＶｅ ｏｘＶｇｅｎｓ１９ｅｃｌｅｓｉｎｈｕｍａｎ，ｌｅａｄｉｎｇ ｓｕｃｈ ａｎｄａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ，ｉｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｙ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓｓｅｎｓｅ，ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓａｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ｄｉｓｍｕｔａｓｅｓａｒｅＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｓｔｈａｔｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ，ａｎｄ ｔｈｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇａｓ ａｎｉｄｅａｌａｎｄ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｈｅｓｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｕｎｆｏｒｔｕｎａｔｅｌｙ，ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＯＤ ｗａｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｙｉｔｓ ｓｈｏｒｔ ｐｌａｓｍａ ｈａｌｆ ｌｉｆｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ６ ｍｉｎ ｉｎｖｉｖｏ，ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｉｍｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＩＩ浙江工业大学硕士学位论文Ｉｎｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄＣｕ，Ｚｎ－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｗｉｔｈ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ０ｃ―ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅａｃｈｉｅｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃｉｆｙ．Ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＤ．Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅｔｏｈｅａｔ，ａｃｉｄ，ａｌｋａｌｉ，ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ， ａｎｄｉｔｓ ａｐｐａｒｅｎｔｏｉｌ―ｗａｔｅｒｐａｒｔｉｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓａｌｓｏｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅａｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ａｎｔｉ―ｐｅｐｓｉｎ，ａｎｄ ａｎｔｉ―ｔｒｙｐｓｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＤ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆａｐｐａｒｅｎｔ ｏｉｌ―ｗａｔｅｒ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｎａｔｕｒｅｏｎｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅｗａｓｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｂｅＲｅｒｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｓｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．ＫＥＹ＿●ＷＯＲＤＳ：ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ● ●●ｆａｔｔｙ●一ａｃｉｄｓ，ｃｈｅｍｉｃａｌ…ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，一一一●Ｊｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｏｉｌ―Ｗａｔｅｒｐａｒｔｉｔｉｏｎｃｏｅｆｊ［ｉｃｉｅｎＩＩＩ浙江工业大学 学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。作者签名：问右－驯日期：母ｊ月 矽日 ｝学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 １、保密口，在 ２、不保密ｒ－１。 （请在以上相应方框内打“√”） 年解密后适用本授权书。作者签名： 导师签名：，胡岛例，Ｊ日期： 日期：，玛叼Ｂ，月＜］日 １圈浙江－Ｔ业大学硕士学位论文第一章绪论１．１引言超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，简称ＳＯＤ）是一类广泛存在于生 物体内的金属酶，是目前国际上普遍公认的一种重要的自由基清除剂。 它最初由Ｍａｎｎ和Ｋｅｉｌｉｎ于１９３８年从牛血中分离出来，由于含有铜离子， 被称为血铜蛋白。１９６９年ＭｃＣｏｒｄ和Ｆｒｉｄｏｖｉｅｈ发现ＳＯＤ具有特异性清除超氧自 由基（０２‘）的生物活性，并对其化学结构、理化性质、药理机制进行了广泛的 研究，从而正式命名为超氧化物歧化酶【ｌ】。目前证据表明，ＳＯＤ的存在对于治疗 类风湿性关节炎、家族性肌萎缩性侧索硬化、缺血再灌流综合症具有明显疗效 【２训。此外在抗肿瘤、治疗心血管疾病、糖尿病和预防衰老等方面具有较好疗效 【５－８】。因此，ＳＯＤ是一种很有发展前途的生化药物【９１。１．２ＳＯＤ的种类和分布ＳＯＤ属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性 部位的金属离子。按其所含金属辅基的不同，这些ＳＯＤ至少可以分为四种类型： Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ、Ｍｎ．ＳＯＤ、Ｆｅ．ＳＯＤ和Ｎｉ．ＳＯＤ［１０１。四种酶都可催化０２－歧化成Ｈ２０２和 ０２，但性质有所不同，其中Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ与Ｍｎ―ＳＯＤ、Ｆｅ．ＳＯＤ差别较大【ｌｌ】，而 Ｍｎ．ＳＯＤ与Ｆｅ．ＳＯＤ却差别比较小，Ｎｉ．ＳＯＤ与上述三种ＳＯＤ的氨基酸序列和结构差别较大【１２，１３】。１．２．１ Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤＣｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ最初是由Ｍａｎｎ和Ｋｅｉｌｉｎ分离得到，并由ＭｅＣｏｒｄ和Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ发现浙江工业大学硕十学位论文其生物活性。含有Ｃｕ和Ｚｎ，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞质中。动物 血液（主要有猪ｉ牛、羊、禽类）、牛肝、猪肝、牛心、菠菜叶、面包酵母、刺 梨等动植物体内均含有Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ。在某些原核生物中，如Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ中也发现ＹＣｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ［１４】。目前国内外开发的ＳＯＤ绝大多数都是Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ，他们分别来自动物血液、 猪肝、野生刺梨。我国动物血液资源丰富，从血液中提取ＳＯＤ符合国情，有实用 价值。植物中ＳＯＤ含量也很丰富，如大蒜、辣椒、蔬菜等，均有一定的开发价值。１．２．２Ｍｎ．ＳｏＤＭｎ．ＳＯＤ是由Ｋｅｅｌｅ、ＭｃＣｏｒｄ和Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ首先分离得到。含有Ｍｎ，呈紫红 色，主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中。人和狒狒肝细胞的胞液、线粒体 内及某些真核生物的叶绿体中也有一定的含量。１．２．３ Ｆｅ．ＳｏＤＦｅ．ＳＯＤ是由Ｙｏｓｔ矛ＩＦｒｉｄｏｖｉｃｈ首先分离得到，含有Ｆｅ，呈黄褐色。Ｆｅ．ＳＯＤ一 般存在于叶绿体基质中，不存在于线粒体中，近年来陆续发现在某些真核生物， 例如一些真核藻类，甚至在某些高等植物，如油菜、柠檬、银杏和水百合等体内也存在Ｆｅ．ＳＯＤ。１．２．４ Ｎｉ－ＳＯＤＮｉ．ＳＯＤ是近年来新发现的又一种ＳＯＤ，它最初是由Ｙｏｕｎ等从Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ中分离得到，目前也只有在链霉菌中才能分离得到这种新型的ＳＯＤ［１５，１６］。 实验表明，不同生物ＳＯＤ含量不同。以红细胞为例，各种动物红细胞中 Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ活性大小，依次为鼠（３３０ Ｕ／ｍＬ）＞兔（３１６ Ｕ／ｍＬ）＞牛（２８６ Ｕ／ｍＬ） ＞猪（２００ Ｕ／ｍＬ）＞人（１５５ Ｕ，ｍＬ）＞鸽子（１００ Ｕ／ｍＬ）＞鸡（７１ Ｕ／ｍＬ）。即使同 一生物的不同组织或同一组织的不同部位，其含ＳＯＤ的种类和数量也有很大差２浙江工业大学硕士学位论文别。以人体为例，肝脏中的Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ含量最高，肥大组织最低；Ｍｎ．ＳＯＤ也以 肝脏中含量最高，红细胞中不含Ｍｎ．ＳＯＤ［１７１。１．３ＳＯＤ的理化性质ＳＯＤ在受到外界各种物理化学因素的影响时，也会像一般的酶蛋白分子那样 发生亚基的解聚、变性或其他方面的构象变化。当然，伴随着结构的改变必然导 致酶活性的下降或丧失。与一般酶相比，ＳＯＤ在承受上述种种变性因素的攻击方 面表项出异常的稳定性，这种稳定性主要来源于金属辅基的存在。ＳＯＤ的部分理化性质见表１．１。１．３．１热稳定性ＳＯＤ的辅酶是金属辅基，因此对热比较稳定，是目前发现的热稳定性最高的 球蛋白之一。从牛血中提取的Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ在７５℃下加热数分钟，其活性损失很少 【１８】，在提纯Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的方法上提供了加热法除杂蛋白等改进工艺及进一步的研究依据。１．３．２ｐＨ对ＳＯＤ活性的影响一般认为ＳＯＤ在ｐＨ ５．３＂－＇９．５范围内，其稳定性较好，对ｐＨ不甚敏感。Ｓａｌｉｎ等报道Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ在ｐＨ ５．３＂－＇９．５范围内基本稳定，在此范围内可见紫外光谱和电子自旋共振波几乎不会发生改变，显示较强的结构稳定性【１９】。李泽浩报道在ｐＨ 为３．６时，Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中的Ｚｎ要脱落９５％，在ｐＨｄ＇于６．０时Ｃｕ的结合位点仅要移动， ｐＨ大于１２．２时，ＳＯＤ的构象发生不可逆转变，从而导致酶活性丧失ｆ２０ｊ。这与酶辅 基为金属辅基关系极大，如果除去Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ等金属离子，其稳定性 也大大降低。１．３．３某些变性剂对ＳＯＤ活性的影响３浙江工业大学硕士学位论文氯仿一乙醇可以使Ｍｎ．ＳＯＤ活性丧失，但不会影响Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的活性。Ｂ．巯 基乙醇可以使Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ失活，但不会影响Ｍｎ．ＳＯＤ的活性。金属螯合剂ＥＤＴＡ 非常容易同金属离子结合，使酶失活。尿素对ＳＯＤ的活性影响也很大，一般６ ｍＭ 的脲就可以使ＳＯＤ开始变性失活。１．３．４ＳＯＤ的紫外吸收ＳＯＤ具有特殊的紫外吸收峰，它在２８０ ｎｌＴｌ处没有吸收峰，这是因为分子中酪 胺酸和色氨酸含量很低的缘故。表１－１ ＳＯＤ的理化性质Ｔａｂｌｅ １－１ Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｌｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ＳＯＤ１．４ＳＯＤ的化学结构１．４．１一级结构与序列同一性 迄今为止，人类至少已经完成全部氨基酸序列分析工作的超氧化物歧化酶共 二十个，其中七个是Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ，分别来源于牛红细胞【２Ｉ】、人的红细胞【２２】、马肝 【２３１、面包酵母【２４１、箭鱼肝、菠菜叶、果蝇；四个是Ｍｎ．ＳＯＤ，来源于大肠杆菌【２５】、嗜热杆菌Ｂ㈣、人肝和Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓａｅ；一种是Ｆｅ．ＳＯＤ，来源于Ｐｌｅｉｏｇａｔｈｉ。通过对４浙江工业大学硕士学位论文多种来源的Ｍｎ．ＳＯＤ和Ｆｅ－ＳＯＤ进行的Ｎ．末端序列分析【２７。２９】揭示了这两类ＳＯＤ在 氨基酸序列上具有高度一致性，从而判断进化上可能来源于同一祖先。 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ与上述两类ＳＯＤ没有这种进化上的相关性，但不同来源的Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ之间却呈现出明显的进化保守性和高度的序列同一性。在人和牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ之间，全序列同一性高达８０％，在人、牛和马三种来源的酶之间， 全序列同一性为７４．５％，而酵母与牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ之间，同一性也高达５５％，同时考虑四种不同来源Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ，全序列同一性为４９．６％。从这四种来源的细 胞色素Ｃ的序列同一性为５５．７％【３０ｌ。细胞色素Ｃ是进化上高度保守的典型蛋白质，所以说，Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ也是一类进化上高度保守的酶。 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的结构同一性还进一步表现在以下三个方面：（１）与金属辅基Ｃｕ、Ｚｎ相连接和参与肽链内部二硫键形成部位附近的氨基酸残基都相同。在牛红细胞活性中心，另外有２个Ｈ，与酶活性无直接关系。在酵母Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中，这两个Ｈ 被取代了，而６个与活性直接相关的Ｈ却一个不缺‘２３’２６１。（２）氨基酸序列中都有 一个超可变区，共有２３．３５个残基。从Ｘ射线晶体结构分析表明这个超可变区位于 分子的主要结构的表面，可能与酶的免疫性质有关【勿。与此相对应的是，Ｃ末端 有一个序列同一性程度更高的区域，在此区域中都有一个精氨酸残基。（３）富含 甘氨酸残基是Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ氨基酸组成的一个共同特点，也是与Ｍｎ．ＳＯＤ、Ｆｅ．ＳＯＤ 氨基酸组成上的重要区别之一【２１１。 甘氨酸的存在对于蛋白质肽链的折叠和形成发夹状结构有关【３１４３１。牛红细胞 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的主要结构特征是八股反平行的伊折叠，这当然是与甘氨酸的存在 和均匀分布有关。这一特性在人、马肝和酵母的Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中都保留下来了。人、马和酵母中的甘氨酸的数目分别为２５、２６和２１，而且其中的１９个是均匀分布在相同的位置上。这意味着Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ之间不仅在一级结构上，而且在空间结构上也具有相同性，事实也正是如此。生命体系在设计ＳＯＤ的结构时至少通过三条途径以确保清除０２咱由基功能的顺利发挥。其一是采取金属辅基形式的多样性，这样一旦某类ＳＯＤ的合成由于其金属辅基的缺乏而受阻时，就可以 由另外一类ＳＯＤ来补偿；其二是在进化上高度保守，防止发生变异；其三是在 与催化活性直接有关的部位上表现出高度的结构同一性，以利于催化功能的顺利 进行。５浙江工业大学硕上学位论文１．４．２三维结构 Ｘ一射线衍射晶体结构分析对牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ的三维结构提供了详细可 靠的信息。在这方面，１９７２年Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ实验室首先获得了可供ｘ一射线晶体结 构分析的单晶【３４】。１９７４年得到了５．５ Ａ粗分辨率的电子密度图，表明该酶的两个 亚基结构上是相同的，整个结构由伊片层组成，几乎没有Ｑ．螺旋成分【３引。１９７５ 年获得的３ Ａ分辨率电子密度图可以分辨肽链骨架的走向和金属配位体的组成， 进一步表明两个相同亚基之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合【３６１。肽链内部 由半胱氨酸Ｃ５５和Ｃ１４４的．ＳＨ基构成的二硫键对亚基的缔合起重要作用。整个结 构特征是由八股反平行的∥折叠围成的圆桶状结构，称之为伊桶（，８－ｂａｒｒｅｌ），其 一侧尚有两个无代表性结构的环。由ｘ．射线结构分析计算出整个结构含５％的Ｑ． 螺旋和４５％的反平行∥折叠结构。在每个亚基中，Ｃｕ分别与四个组氨酸残基 （Ｈ４４，４６，６１，１１８）配位，而Ｚｎ则与三个组氨酸（Ｈ６１，６９，７８）和一个门 冬氨酸残基（Ｄ８１）配位。Ｃｕ，Ｚｎ之间相距约６ Ａ。根据Ｘ射线衍射结构分析 给出的每个亚基中１５１个氨基酸残基的Ｑ一碳原子和金属结合位点的分子坐标【３¨， 据此可以构筑起一个牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ分子的空间结构模型，如图１．１所示。 Ｍｎ．ＳＯＤ、Ｆｅ．ＳＯＤ、Ｎｉ．ＳＯＤ和Ｃｕ．Ｚｎ．ＳＯＤ在一级结构上明显不同，在空间 结构上也表现出差异，如图１．１、１．２、１．３和１－４。Ｆｅ．ＳＯＤ［３８，３９】和Ｍｎ．ＳＯＤ［加】的 圆二色性谱表明，这两类ＳＯＤ含有较高程度（＞３２％）的ｃ‘．螺旋结构，较少夕折叠， 整个结构比较紧凑。初步的Ｘ．射线晶体结构分析【４１。４３１表明Ｆｅ．ＳＯＤ和Ｍｎ―ＳＯＤ 每个结晶学不对称单位是一个酶分子，而Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ则是由两个酶分子（四个亚 基）组成。表明晶体堆积程度不同，而且各种来源的Ｆｅ－ＳＯＤ、Ｍｎ．ＳＯＤ与牛红细 胞Ｃｕ．Ｚｎ。ＳＯＤ的单晶胞参数也各不相同，可以肯定在整个空间结构上Ｆｅ―ＳＯＤ、 Ｍｎ．ＳＯＤ与牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ、Ｎｉ．ＳＯＤ将有明显的不同。６浙江工业大学硬±学位论文图１－２Ｍｎ－ＳＯＤ结构示意图Ｆｉｇｕｒｅ １－２Ｔｉｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＭｎ－ＳＯＤ新ⅡＴ业大学硕士学位论文图１４Ｎｉ－ＳＯＤ结构示意图Ｆｉｇｕｒｅ １４Ｔｈｅ ８ｔｌＲｌＣｔｕｌ＿ｅｏｆＮｉ?ＳＯＤ４３活性中心 在３ Ａ分辨率的基础上，１９８０年获得的２ Ａ分辨率电子密度图，可以比较清晰地看到牛红细胞ｃｕ．Ｚｎ．ＳＯＤ活性中心附近位置的排列舭】。结合底物０２。的是 一个椭球形“口袋”，长１ ５Ａ，宽９Ａ，深６Ａ，口袋外缘一边是由苏氨酸Ｔ１３５， 甘氨酸Ｇ１３６，丙氨酸Ａ１３８和甘氨酸Ｇ１３９组成，另一边由甘氨酸Ｇ ５９，脯浙江工业大学硬±学位论文氨酸Ｐ ６０，组氨酸Ｈ ６１以及苯丙氨酸Ｆ ６２和天冬酰胺Ｎ ６３组成，赖氨酸Ｋ １３４和精氨酸Ｒ １４１的侧链构成口袋的两侧，口袋底部排列着ｃｕ。矗，天冬氨酸Ｄ ８１，以及Ｈ１１８、Ｈ４４、Ｈ７８和Ｈ ６９。在已知一级结构的全序列的四个ｃｕ．Ｚｎ―ＳＯＤ中，上述活性部位的氨基酸残基的排列方式都相同。高分辨率的‘Ｈ核磁共振（ＮＭＲ）研究已经证明，人红细胞的㈣、酵母【删和麦胚的Ｃｕ√Ｚｎ．ＳＯＤ［４７］与牛红细胞ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的活性中心构象是相同的。上述不同来源的ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ 中与组氨酸咪唑环上Ｃ．２质子有关的核磁共振信号其化学位移明显相同，而且组 氨酸质子的滴定行为以及除去金属辅基后的酶蛋自在重组时所引起的吸收光谱 的变化也都相同【”Ｉ，这表明活性中心确实具有相同的环境，同时也肯定了上述活 性中，Ｉｉ，的排列方式对于发挥催化功能是很关键的。 对ＳＯＤ中金属辅基配位场几何构型研究是讨论活性中心结构的另一方面， 主要应用顺磁共振（ＥＰＲ），ＮＭＲ、化学修饰结合ｘ－射线晶体结构分析，确定了 ｃｕ是与四个组氨酸残基咪唑环的Ｎ原子构成近似四方平面的配位结构，ｃｕ和 ｚｎ之间通过共同连接组氨酸Ｈ ６１而形成所谓的“咪唑桥”结构，见图１－５。 Ｍｎ．ＳＯＤ、Ｆｅ．ＳＯＤ和Ｎｉ．ＳＯＤ活性中心如图１－６、图１．７和图１－８所示。囤１－５牛红细胞ｃｕＺｎ．ＳＯＤ活性中心的“眯唑桥”结构示意图Ｆｉｇｕｒｅｌ ５Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ＊ｏｆＣｕ，Ｚｎ―ＳＯＤｏｆｂｏｖｉｎｅｅｒｙｔｈｒｃｃｙｔｅｓ浙江Ｉ业大学碗±学位论文●ｌ ●●●●●?、”＜絮●●●ＦｉｇｕｒｅＩ－６Ｔｈｅ ａ“ｉｖｅ ｓｉｔｅ＋～。‰：一√●、● ●㈡．ｔ．??：商削ｌ巧ＡｎａｂａｅｎａｓｐＭｎ－ＳＯＤ活性中心结构示意图ｒ髑ｄｕ％ｏｆＭｕ－ＳＯＤｏｆＡｎａｂａｅｎａｓｐ● ●●ｊ● ●● ● ● ●Ｉ．、０、。．●●●●０?●、 ●●●●●圜１―７ Ｔｈｅｒｒｎｏｓｙｎｏｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎａｇｔｕｓ Ｆ争ＳＯＤ活性中心结构示意图Ｆｉｇｕｒｅｌ４Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆＦｃ－ＳＯＤ ｏｆＴｈｅｎａｏｓｙｎ∞ｈｏｃｏｃｃｕｓ＊ｌｏｎａｇｔｕｓ浙江工业大学硕士学位论文一图１－８Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｏｕｌｅｎｓｉｓＮｉ―ＳＯＤ活性中心结构示意图Ｆｉｇｕｒｅ １－８ Ｘ－ｒａｙ ｓｔｍｃｔＩｌｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆＮｉ－ＳＯＤ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｏｕｌｅｎｓｉｓ在应用组氨酸Ｃ．２质子交换技术【４９，５０］和丫．射线扰动角关联技术１５１，５２］研究酵母 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中金属与酶蛋白的配位关系后，有人对活性中心的“咪唑桥”结构提出 了不同看法，认为Ｈ ６３很可能单独与Ｚｎ配位。由于不同来源的Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ之 间具有结构的同一性，所以推测由酵母酶所得到的结论可以推广到其它来源的 Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ，即酶的活性中心不一定呈现“咪唑桥”结构特征。 当然，“咪唑桥”结构的提出是基于Ｘ．射线晶体结构分析，而酵母酶的工作 是基于溶液构象研究，晶体结构与溶液构象之间出现某些差别是可以理解的，更 重要的是“咪唑桥”活性中心绝非刚性的固定结构，而应该是一种柔韧的灵活的连 接方式，任何化学，物理的因素都可能影响它，而这种若接若离的结构灵活性可 能正是酶发挥催化功能所必需的。 ＥＰＲ和电子能谱测定１５３，．５４］Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中Ｃｕ的超精细偶合常数么ｌｌ为Ｏ．１４３ ｃｌｎ～，这是典型五配位Ｃｕ络合物的值，而ＮＭＲ对Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ水溶液中水的质 子交换弛豫时间测定【５５，５６】，发现Ｃｕ与组氨酸咪唑环Ｎ原子构成的四方平面配位 场的轴向位置上还结合有一分子水，从２ Ａ分辨率电子密度图上也发现Ｃｕ的轴 向位置上有一水分子的吸收峰，而Ｆｅ―ＳＯＤ和Ｍｎ．ＳＯＤ的金属离子上也都结合有 一个水分子，这一水分子的存在可能与催化机理有关。对Ｆｅ．ＳＯＤ的化学修饰表浙江工业大学硕士学位论文明色氨酸残基是与Ｆｅ形成配位关系的，ＥＰＲ和ＮＭＲ研究揭示了Ｆｅ－ＳＯＤ和 Ｍｎ．ＳＯＤ中的金属离子是处于高自旋态的三价铁Ｆｅ３＋和］Ｖｌ＿＿ｒ１３＋，但有关这两类酶 活性中心的结构细节目前所知甚少。 １．４．４氨基酸残基与酶活性１．４．４．１组氨酸组氨酸是首先被发现与金属辅基Ｃｕ和Ｚｎ相连且与酶的催化活性直接相关 的氨基酸残基。这主要来自三方面的实验证据：一是光敏氧化失活；二是化学修 饰失活；三是辐射失活实验。 在有光敏染料亚甲兰存在下，去Ｃｕ，Ｚｎ后的酶蛋白经光照后组氨基残基遭到破坏，这时再加入Ｃｕ、Ｚｎ重组，酶活性不能恢复【５７１。用组氨酸特异性试剂重氮１Ｈ．四唑（ＤＨＴ）修饰发光细菌中提取的Ｆｅ．ＳＯＤ，发现经过ＤＨＴ修饰后的酶完 全失去活性，而且去Ｆｅ后的酶蛋白经修饰后再加入Ｆｅ就不能重组复活。李益新 等对牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ的重组研究表明，去除Ｃｕ，Ｚｎ后的酶蛋白经较低剂量丫．射线照射后就丧失了再与Ｃｕ，Ｚｎ重组复活的能力。１．４．４．２芳香族氨基酸芳香族氨基酸主要指色氨酸和酪胺酸。牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中含有２个酪 胺酸，没有色氨酸，而人的Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中含有２个色氨酸，用化学的或光学的方法使这些残基氧化破坏后，并未引起ＳＯＤ活力有大的改变。这表明芳香族氨 基酸并不直接与酶活力有关。１．４．４．３半胱氨酸和ＳＨ基Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ和Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ［５８１用对一氯汞苯磺酸修饰半胱氨酸的ＳＨ基后，发现 牛红细胞的、麦胚的和猪的Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ并不丧失活性，对鸡肝Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ的修 饰也得同样结果。顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基旋标记物可以特异地与蛋白质分子１２浙江工业大学硕士学位论文中半胱氨酸ＳＨ基结合，并根据ＳＨ基所处不同环境给出特征性的ＥＳＲ波谱，李 益新【５９】对细胞Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ的游离ＳＨ基进行自旋标记，只能给出弱固定化的ＥＳＲ 信号，表明该．ＳＨ基并不是包埋在蛋白质分子疏水内部而是位于比较接近溶剂的 表层中，标记后的酶仍然有酶活性，其紫外图谱也未发生大的变化，表明ＳＨ基 与酶的活性无直接联系。１．４．４．４精氨酸１９７５年对牛红细胞Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ的Ｘ．射线晶体结构就发现有一个精氨酸 Ｒ１４１是位于溶剂接近酶活性中心Ｃｕ的通道口上，与Ｃｕ相距约６ Ａ，但是真正 确认精氨酸与酶活性有关则是７０年代末和８０年代初的化学修饰实验。 由于精氨酸本身带正电荷，可以诱导０２’负离子进入活性中心，并可在催化 过程中提供质子，使催化速度大大加快。用精氨酸试剂丁二酮或苯乙二醛进行修 饰，可使Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ的活力丧失９９％以上，而且探明这个精氨酸在啤酒酵母提 取的Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ中为Ｒ１４３，对应于牛酶中的Ｒ１４１，前文已经提到这个关键性的Ｒ １４１为目前己知氨基酸序列的所有Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ所共有，位于超同一性的Ｃ末端区域内。 Ｋｏｐｐｅｎｏｌ［删分析了Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ活性中心部位的电荷分布，考察了精氨酸对 于催化活性的重要性。比较Ｒ１４１被修饰前后活性中心部位的电势分布图可以看出，当Ｒ１４１被修饰后中和了活性中心大部分的正电荷，对吸引０２。催化歧化反应十分不利。１．５ＳＯＤ的生理功能及其应用１．５．１ＳＯＤ的生理功能四类超氧化物歧化酶都能催化０２‘发生歧化反应，生成Ｈ２０２和０２， Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ催化歧化反应式如下： Ｃｕ２＋＋０２‘＿Ｃｕ＋＋０２ Ｃｕ＋＋０２。＋２Ｈ＋＿Ｃｕ２＋＋Ｈ２０２１３浙江工业大学硕上学位论文总反应式为：０２。＋２Ｈ＋＿Ｈ２０２＋０２ ＳＯＤ是目前为止所发现的唯一以自由基０２‘为底物的酶，它在维持生物机体内０２’产生与消除的动态平衡中起着极其重要的作用。超氧阴离子自由基是所有氧自由基中的第一个自由基，但可以经过一系列反 应生成其它较活泼的氧自由基（?ＯＨ、Ｈ２０２、ＲＯ、Ｒ０２及ＲＯＯＨ）【６ｌ】。０２‘在水溶 液中的存活时间约为１秒，在脂溶性介质中的存活时间约为１小时，因而它有足 够的时间扩散到较远的距离，经过一系列反应生成其它氧自由基，可对细胞内的 膜脂、蛋白质、酶、核酸和线粒体等进行广泛的攻击，因而产生了极大的毒害作用，可引起溶酶体裂解，线粒体衰老，染色体断裂和膜脂崩溃等。而ＳＯＤ的作用就是专一有效地清除超氧阴离子自由基【６２，６３】。在正常生理情况下，机体要通过 ０２‘的产生与清除来维持有利无害的、生理性低水平的、稳定平衡的０２’浓度。ＳＯＤ 清除０２。的能力与其含量的多寡有关。生物体合成ＳＯＤ常受０２‘浓度的影响，例 如经常处在０２分压较高的环境中生物体内０２’浓度高于正常水平，在０２。的诱导 下，ＳＯＤ的生物合成能力增高。必须指出的是，ＳＯＤ清除０２’的能力总是有限度 的，如果０２。的产生超过ＳＯＤ清除０２。的能力，就会发生０２＂对机体的危害。另外， 在某些病理情况下，机体ＳＯＤ活性降低，也会打破这种平衡，造成对机体的损害。正是ＳＯＤ这一独特的生物学功能，吸引了世界各国的科学家从不同的角度， 不同的领域，不同的范围和深度，采用不同的方法和手段，对其化学性质、生物 学功能、分子结构、药理、实际应用等方面展开研究，取得了一系列的成就。１．５．２ＳＯＤ临床应用研究１．５．２．１早产儿氧中毒ＳＯＤ作为药物在美国、日本等地已经批准进入临床实验阶段，用于治疗早 产儿氧中毒引起的呼吸系统疾病。对３３例早产儿通过气管表面吸附给药，剂量分别为２．５ ｍｇ／ｋｇ和５ ｍｇ／ｋｇ，ｆＥ，ＪＮ４８ｈ给药一次，连续给药１４天，检测分析各项指标，研究用药的安全性和动力学特性【６４１。结果显示，血清中的ＳＯＤ浓度在 第３天时达到最大，早产儿肺和气管的炎症反应较对照组有明显缓解，所有参试１４浙江工业大学硕士学位论文儿童均表现出良好的用药耐受性。目前临床上正对ＳＯＤ预防由于呼吸困难引发 的支气管发育异常的有效性进行研究。１．５．２．２神经系统疾病Ｐａｚｏｓ等【６５】研究发现ＳＯＤ突变体与家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化（ＦＡＬＳ）有 关，突变体Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ酶可以催化氧化反应引起神经病理性损害导致ＦＡＬＳ。治 疗ＦＡＬＳ可以采用免疫抑制剂、神经营养因子等，但ＳＯＤ是一种最有潜力的药 物ｍ】。另一个研究的重要方面是帕金森病，对早期和晚期帕金森病患者血液中的 ＳＯＤ活性检测发现晚期帕金森病患者体内ＳＯＤ活性显著下降，并与病史长短呈 负相关，而抗氧化机制的损伤可能是帕金森病形成的原因【６７１。Ｊｅｎｎｅｒ等【６８】对氧中 毒造成的脑损伤做了进一步的研究，帕金森病患者表现在大脑中铁含量改变，线 粒体功能受损，抗氧化保护系统改变（主要是ＳＯＤ和谷胱甘肽减少）。１．５．２．３对爱滋病的辅助治疗Ｅｄｅａｓ等【６９】研究发现，Ｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ因子（ＣＦｓ）在感染爱滋病的早期对基因表达 调空过程起着重要作用，ＳＯＤ能抑制ＣＦｓ因子从而消除病毒诱导因素。在感染 爱滋病早期如果能将ＳＯＤ与其他治疗药物联合使用，将大大延长潜伏期。三叠 氮二脱氧胸苷是目前治疗爱滋病的首选药物，但由于其毒性大，应用受到限制。 三叠氮二脱氧胸苷的治疗往往伴随着氧化损伤，进而引起组织细胞功能紊乱， ＳＯＤ作为其辅助用药有助于爱滋病的治疗【．７０】。１．５．２．４对其它类型疾病的影响随着研究的深入人们发现ＳＯＤ影响多种疾病的发生和发展。唐煦等㈣研究提示人血清中高铜，低锌，高铜／低锌比值，以及Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ活性降低与恶性肿 瘤的发生有关。胃癌的发生发展与机体氧化／抗氧化状态的失衡有密切联系，表 现为机体氧化应急损伤的亢奋状态和抗氧化能力的减弱。杨军等【７２１提出Ｃｕ和／１５浙江工业大学硕士学位论文或Ｚｎ的缺乏，导致Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ活力下降，可能是胃癌发生发展的另一生化机制。 ＳＯＤ对各种炎症、肺部疾病、心血管疾病等亦有重要影响。至于ＳＯＤ在大量临 床应用实验中产生的副作用可能是ＳＯＤ纯度不高引起的，使用高纯度的ＳＯＤ和 合理的给药方式可以有效地抑制副反应。 ＳＯＤ在化妆品及食品工业中的应用 据悉国内外不少化妆品添加了ＳＯＤ，如康妮ＳＯＤ，大宝ＳＯＤ蜜等。作为化 妆品的添加剂，ＳＯＤ的作用主要是【７３】：①有明显的防晒效果，ＳＯＤ可有效防止 皮肤受电离辐射的损伤；②有效防治皮肤衰老、祛斑、抗皱、起抗氧化酶的作用； ③有明显的抗炎作用，对防治皮肤病有一定疗效；④有一定的防治瘢痕形成的作 用。研究证实外源性ＳＯＤ能够渗入皮肤进入体内作用，且无不良反应和过敏现 象。 ＳＯＤ在食品工业中的应用主要有：①作为保健食品的有效成分，如作为添 加剂加入保健食品口服液、酸奶、啤酒等；②作为抗氧化剂，抑制过氧化酶的作 用，如用于果蔬菜后保鲜。 虽然ＳＯＤ具有重要的生理功能和广泛应用，但是由于ＳＯＤ存在体内半衰期 只有约６ｍｉｎ［７４１，稳定性差，容易失活，异源蛋白具有免疫原性，口服易被蛋白 酶水解等缺陷。因而无论作为药用酶还是作为食品添加剂或化妆品用，其实际效 果并不理想【７５１。为此近年来国内外应用酶工程方法，对ＳＯＤ进行化学修饰均取 得了比天然ＳＯＤ性质优越的修饰酶。１．５．３１．６ＳＯＤ化学修饰研究进展化学修饰是增强酶稳定性，降低免疫原性，改善其药学性质，以及增强其功 能的有效方法。成为当今酶结构与功能改进研究中的一个热点。酶分子中可供修 饰的功能基团主要是：氨基、毓基、胍基、咪唑基、酚基、羟基和吲哚基等，对 ＳＯＤ来说，目前主要限于Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ的氨基和胍基。１６浙江工业大学硕士学位论文１．６．１ＳＯＤ活性部位修饰 用化学修饰的方法研究酶的结构和功能已成为～种重要的手段，酶的某些基团被特异性试剂修饰后性质会发生改变，由此推测这些基团与酶活性关系。 Ｆｏｒｍａｎ等【７６１用亚甲蓝和选择性的组氨酸修饰剂重氮氨基苯磺酸酰胺修饰组氨酸 残基表明，组氨酸为ＳＯＤ活性所必需。Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ等【７７】用苯乙二醛和丁二酮对 ＳＯＤ的精氨酸进行修饰发现，精氨酸残基为Ｃｕ，Ｚｎ―ＳＯＤ活性所必需，Ｍｎ．ＳＯＤ和Ｆｅ．ＳＯＤ的活性则与精氨酸残基无直接关系。１．６．２ＳＯＤ非活性部位赖氨酸的修饰化学修饰ＳＯＤ非活性部位的重要作用是在保持ＳＯＤ活性的同时，克服酶的 缺陷，增强酶的功能，提高实际应用效果，扩大应用范围等。目前对ＳＯＤ的修 饰研究主要集中于各种来源的Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ非活性部位赖氨酸。主要的修饰剂有 聚７，－－醇、白蛋白、脂肪酸、伊环糊精、粘多糖、硼酸等［７８，７９】。以上研究证实，通过化学修饰的方法可以显著提高ＳＯＤ的稳定性、延长在血液中的半衰期、降低免疫原性和抗原性，更有利于实际应用。但是至今化学修饰ＳＯＤ的产品多用 作食品和化妆品添加剂，而作为临床治疗药物却一直无法得到广泛应用。主要原因是传统修饰剂修饰后的ＳＯＤ虽然半衰期显著延长，但是ＳＯＤ肾小球滤过率高，难以在体内维持药效；不易通过血脑屏障和细胞膜，无法被靶细胞吸收；以及容 易被自身歧化产物Ｈ２０２抑制，限制了其临床应用。近来对ＳＯＤ化学修饰的研究主要致力于开发新的修饰剂改善体内药代动力学性质，同时新的修饰方法也不断被开发，如：采用两种修饰剂修饰同一ＳＯＤ分子，发挥他们的协同作用。１．６．２．１聚乙二醇修饰ＳＯＤ聚乙二醇是一种水溶性强且无毒的线性分子，按引发剂的不同能够得到具有 两个羟基末端的双功能聚乙二醇或只有一个羟基末端单功能聚７１－－醇（Ｍ．ＰＥＧ）， 目前用于ＳＯＤ修饰的聚乙二醇主要是分子量为５０００的Ｍ．ＰＥＧ．５０００。ＰＥＧ修饰的 ＳＯＤ就是对ＳＯＤ赖氨酸残基的ＮＨ２进行修饰，修饰的合成路线有以下三种：１７浙江工业大学硕士学位论文一ｏｎ二艇，众?‘众Ｒ２．眦ｏｎ＋ｏ人阻一少Ｏ Ｑ磐ｓ一…．ｊ ｌ、ＰＥＧ―ＣＨ２０Ｈ――――――＝――――＝―善ＰＥＧ．ＣＯＯＨＨ２０２Ｍｎ０２／ＣＨ２ＣＩ，Ｎ‘ＯＨ ｏ ＤＣＣｌ嘲一审Ｏ掣‰们娟Ｇ路线Ｉ－３制备ＰＥＧ―ＳＯＤＳｃｈｅｍｅ １－３ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧ－ＳＯＤ路线１．１的方法得到的修饰ＳＯＤ氨基修饰率达到８０％，酶活力保持７５％，且可 以降低酶的免疫原性，同时增加了对蛋白水解酶的抵抗能力，提高在体内的半衰 期（Ｔｌ也为４０ｄ＂时）１８０］，但这种合成方法引入有毒的三氯均三嗪而限制了修饰产 品的应用。路线１．２的方法可以使酶活力保持９５％以上，但反应时间太长，修饰 产物易酶解，另外原料也不易获得，所以应用时有一定的困难【８１１。路线１．３的方 法可以使酶活力保持９０％以上，但反应步骤太长，操作繁琐，应用颇为不便‘８２１， 另ＰＦＰＥＧ修饰ＳＯＤ的方法的共同问题就是修饰产物分子量增大很多，使其体内吸 收性更差。 用聚乙二醇修饰ＳＯＤ其反应条件温和，酶活性保持较好，修饰后蛋白酶水溶１８浙江工业大学硕士学位论文性较好，同时，ＰＥＧ免疫原性降低，半衰期延长，有较好的生物相溶性。目前， ＰＥＧ．ＳｏＤ已投入工业生产，在Ｓｉｇｍａ公司已有试剂商品出售。 １．６．２．２右旋糖苷修饰ＳＯＤ 近年来，右旋糖酐（ＤＥＸ）和聚蔗糖修饰ＳｏＤ的研究进展迅速【８３＿８８１，采用不同 分子量的右旋糖酐和聚蔗糖修饰不同来源的ＳＯＤ取得了良好的效果。此法修饰的 ＳＯＤ较好的保持了酶的活性（达８１％），并且在耐热、酸碱和抗酶蛋白水解能力等 方面均优于天然酶，且修饰后的分子量显著增大，产物容易分离。缺点是修饰酶 的免疫原性有所增强，修饰操作复杂，反应难于控制，反应原料毒性较大。反应 路线如下：。Ｒ＿砭／ ＮａＩ ．ｏＨ ４０１厂… ／ＣＨｏＩＣ。ＨＯＳＯＤ－ＮＩ－１２ＮＲｌＯＨ墨子暑／ｏＨ’ｏＨｃＮＢｒ伽人丫伽／Ｏ―ｃｏＮＨ２ＯＨＳＯＤ―ＮＨ２ｓ…℃一Ｄ－Ｎ扯≥Ｒ路线ｌ－４制备ＤＥＸ．ＳＯＤＳｃｈｅｍｅ １－４ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＥＸ―ＳＯＤ１．６．２．３月桂酸修饰ＳＯＤ阎家麒［８９，９０】用月桂酸（ＬＡＡ）修饰ＳＯＤ，氨基残基修饰率达８０％，活性保持 在９０％（比活力６０００Ｕ），这种修饰方法路线简单，操作方便、原料易得且价格低 廉。修饰后的ＳＯＤ的稳定性有较大提高，修饰后ＳＯＤ在２０℃可保持２―３年， 而未修饰在相同条件下只能保持３．５月；在体内保留时间较长（Ｔｌ陀为１５小时）； 无免疫原性；且容易透皮吸收，使其在外用化妆品方面具有更好的效果。合成路线如下：ＲＣＯＯＨ―ＳＯＣｌ２ ＲＣＯＣｌ等ＳＯＤ－ＮＨＣＯＲ路线１．５制备Ｌ气Ａ．ＳＯＤＳｃｈｅｍｅ１－５ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆＬＡＡ－ＳＯＤ１９浙江工业大学硕士学位论文１．６．２．４低分子肝素修饰ＳＯＤ 低分子肝素（ＬＭｗＨ）是一种粘多糖，具有抗凝血酶和抗炎活性，临床上 广泛用于治疗心血管疾病，肺栓塞，急性缺血性座中等。采用高碘酸钠氧化活化 ＬＭＷＨ，然后与Ｃｕ，Ｚｎ．ＳＯＤ共价结合可以制得ＬＭＷＨ．ＳＯＤ。通过结合两种生物 活性分子旨在改善酶的药学性质，如延长半衰期、降低抗原性、增强抗炎活性等。与未修饰ＳＯＤ相比较，热稳定性、酸碱稳定性、抗胰岛素稳定性增科９１１。齐敬总等【蜘进一步研究证实了上述结论，通过ＬＭＷＨ修饰ＳＯＤ以期在改 进ＳＯＤ性能的同时，对ＳＯＤ在防治脑缺血再灌注损伤及抗辐射损伤的应用中发 挥ＬＭＷＨ的协同作用。该修饰方法原料易得、中间体稳定、反应温和、操作简 单，主要缺点是高碘酸钠氧化活化ＬＭＷＨ时生成不同分子量的醛，制得的 ＬＭＷＨ．ＳＯＤ分子量不均一。 １．６．２．５褪黑素等修饰ＳＯＤ 褪黑素（ｍａｌａｔｏｎｉｎ，ＭＴ）是一种主要在松果体合成的激素，具有广泛的生理 活性，能调节生物节律、改善睡眠以及抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤等作用【９３１。 借鉴免疫学中ＭＴ免疫原的制备方法，以甲醛为偶联剂，可以实现ＭＴ与ＳＯＤ 的偶联。修饰后每个ＳＯＤ分子上连有６－９个ＭＴ分子，酶活性保持率为６０％， 热稳定性和酸碱稳定性明显增强【９４１。研究表明，修饰后ＭＴ的活性几乎完全保留， ＳＯＤ活性增强，有望成为防治中风和神经系统退行性疾病的常规用药。 Ｔａｋｅｎａｇａ等【９５】将ＳＯＤ和卵磷脂（ＰＣ）合成为卵磷脂化的ＳＯＤ（ＰＣ．ＳＯＤ）， 结果显示ＰＣ．ＳＯＤ在血液中半衰期延长，对细胞膜和组织吸附能力提高，静脉注 射ＰＣ．ＳＯＤ能加快脊髓损伤导致的运动功能障碍康复。此外，ＰＣ．ＳＯＤ能逐渐聚 集于受伤部位清除过量氧自由基，能使神经保护因子的产生和ＨＩＦ．１ｅｔ基因表达 增加。应用羧甲基纤维素纳（ＣＭＣ）采用两种不同方法修饰ＳＯＤ后，抗炎活性 比天然ＳＯＤ分别提高了２．４倍和２倍，血浆半衰期从４．８ ｍｉｎ延长至３４．７ ｈ和６．６ ｈｔ９６，９７１。甘露聚糖经Ｎａｌ０４氧化活化修饰ＳＯＤ，修饰后ＳＯＤ抗Ｈ２０２失活能力增 强了５６０多倍，抗炎活性增强了２倍，血浆半衰期从４．８ ｍｉｎ延长至１．７ ｈ，而且 具有刀豆球蛋白ａ识别能力【９８ｌ。 综上所述，利用酶工程的原理对ＳＯＤ进行化学修饰，可使酶的物理化学性浙江工业大学硕上学位论文质发生一些有益于药用的变化。现今ＳＯＤ的化学修饰的研究主要集中在３个方 向：（１）新的修饰剂的开发：寻找或合成没有生物毒性，且具有一定的生理药理 功能的修饰剂，以求发挥其与ＳＯＤ的协同作用，同时要求修饰剂在修饰过程中 对ＳＯＤ活性的不利影响尽可能低。而带负电荷的修饰剂因为有助于降低ＳＯＤ在血液中的消除率，成为了近期研究的热点。（２）新的修饰方法的开发：可以用合适的交联剂对体内的抗氧化酶系ＳＯＤ、ＣＡＴ、过氧化物酶（ＰＯＤ）进行交联， 以降低Ｈ２０２对ＳＯＤ的底物抑制作用。也可以将ＳＯＤ与其他具有抗炎活性，抗 血栓活性和抗肿瘤活性的酶结合，发挥他们的协同效力。（３）修饰酶新的应用方 向：如开发成为病理指示剂。我们可以根据应用情况的不同，选择不同的修饰剂 和不同的修饰方法，选择性地对ＳＯＤ进行定向改造，为其应用开拓出广阔的领域。１．７不饱和脂肪酸简介亚油酸（１ｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＬＡ），即９，１２一十八碳二烯酸，ａ．亚麻酸（ａｌｐｈａ．１ｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＬＡ），即全顺式９，１２，１５一十八碳三烯酸，两者是广泛存在于自然界中 的不饱和脂肪酸。按照羧基远端的碳原子编号定位方式将不饱和脂肪酸分类，ＬＡ和ＡＬＡ分别属于ｎ－６，ｎ－３族系的多不饱和脂肪酸，具有重要的生理作用。ＬＡ 和ＡＬＡ只能通过食物供给，人体不能自身合成，因此被称为必需脂肪酸。它们 主要以复合脂的形式存在于机体组织当中，部分作为人体内某些活性物质的前体 物质，少量以脂蛋白形式存在于血液当中，微量部分以自由脂肪酸形式与血浆清 蛋白结合，成为脂肪酸在体内运输载体。人体自身酶可以将亚油酸转化为花生四 烯酸，将仪．亚麻酸转化为二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸ｔ９９１，因此具有重要的生理功能，如抗肿瘤作用【１００，１０１】、降血糖作用、降血压作用‘１０２，１０３】、抗炎作用［１０４，１０５】、免疫和抗衰老作用等。这可能是因为不饱和脂肪酸具有抗氧化活性，可以保护细 胞免受攻击【１０６１。 基于亚油酸和ａ．亚麻酸的生理功能和抗氧化活性，本文用小分子亚油酸和ａ． 亚麻酸作为修饰剂是本研究的特点。本文采用两种不同的方法活化不饱和脂肪酸 并修饰ＳＯＤ，对其性质进行初步鉴定，不仅有一定理论研究价值，而且具备较２ｌ浙江工业大学硕士学位论文好的实际应用前景。其中Ｎ一羟基琥珀酰亚胺活化不饱和脂肪酸的方法，修饰 ＳＯＤ反应条件温和，ＬＡ．ＳＯＤ、ＡＬＡ．ＳＯＤ活性保持率分别为１ ０４％和９８％。两 种修饰方法制备的修饰ＳＯＤ热稳定性、酸碱稳定性、抗蛋白酶水解稳定性显著 增强，表观油水分配系数增大。浙江工业大学硕士学位论文参考文献【１】ＭｃＣｏｒｄ ＪＭ，ＦｒｉｄｏｖｉｃｈＩ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：Ａｎｅｎｚｙｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒｅｒｙｒｏｅｕｐｒｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１ ９６９，２４４：６０４９―６０５２． 【２】ＳａｌｉｎＭＬ，ＭｃＣｏｒｄＪＭ．Ｆｒｅｅｒａｃｉｃａｌｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｎｇ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ １３ １９．１３２３．ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７５，５６：【３】Ｗｉｅｄａｕ－Ｐａｚｏｓ Ｍ，ＧｏｔｏｄｉｓｍｕｔａｓｅｉｎＪＪ，Ｒａｂｉｚａｄｅｈ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａｌｔｅｒｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅＦａｍｉｌｉａｌＡｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃＬａｔｅｒａｌＳｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１ ９９６，２７１（５２４８）：５１５－５１８． ［４】邱晓阳，公茂青，王延华．脑缺血再灌注引起大鼠脑细胞水肿及脑组织超氧 化物歧化酶的变化［Ｊ】．中国康复，２００５，９（２５）：２４８－－２４９．【５】ＨｕａｎｇＰ’ＦｅｎｇＬ，Ｏｌｄｈａｍ ＥＡ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅａｓａｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７：３９０―３９５．【６】ＶａｎＤｅｅｌ ＥＤ，Ｌｕ ＺＢ，Ｘｕ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓｓｔｒｅｓｓｔｈｅ ｈｅａｒｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅＦｒｅｅａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ 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【２７】 Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＨＭ，ＨｉｌｌＲＬ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓａｍｏｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１ ９７３，７０（１ ２）：３７２５―３７２９．［２８】ＢｒｉｄｇｅｎＪ，Ｈａｒｒｉｓ ＪＩ，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ Ｆ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｌｅｔｔ．，１ ９７５，４９（３）：３９２－３９５． ＥＣ，Ｂｏｎｉｃｅｌ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ｎ?ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳ【２９】Ｂｒｕｓｃｈｉ Ｍ，Ｈａｔｃｈｉｋｉａｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｉｃｔ ａｎａｅｒｏｂｅ ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９７７，７６（１）：１２１－１２４．Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ［３０］Ｓｍｉｔ ＪＤ，Ｐｕｌｖｅｒ－Ｓｌａｄｅｋ Ｊ，Ｊａｎｓｏｎｉｕｓ ＪＮ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１９７７，１ １２（３）：４９１－４９４． 【３ １】ＳｍｉｔｈＥＬ．ｉｎ ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ（Ｂｏｖｅｒ，Ｐ．Ｄ．ｅｄ．），３ｍ ｅｄ，Ｖ０１．１［Ｍ】．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ［３２】ｎａｇｌｅｒＰｒｅｓｓ，１ ９７０．ｏｎ ａＡＴ，Ｈｏｎｉｇ Ｂ．Ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｏｍｐｕｔｅｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９７８，７５（２）：５５４―５５８． 【３３】Ｒｏｓｓｍａｎ ＭＧ Ａｒｇｏｓ Ｐ．Ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ １０９（１）：９９－１２９． 【３４】ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＤＣ，Ｂｉｅｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１ ９７７，ＣＪ，ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪＳ．Ｔｗｏｃｒｙｓｔａｌｆｏｒｍｓｏｆｂｏｖｉｎｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．，１ ９７２，２４７（１ ９）：６３６８―６３６９．［３５１ＴｈｏｍａｓＫＡ，Ｒｕｂｉｎ ＢＨ，Ｂｉｅｒ ＣＪ，ｅｔａｔ ５．５．Ａａ１．Ｔｈｅｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ５６７７―５６８３．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．，１９７４，２４９（１ ７）：２５浙江＿Ｔ业大学硕上学位论文［３６】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｊ，Ｔｈｏｍａｓｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ‘ｄｉｓｍｕｔａｓｅＫＡ，Ｒｕｂｉｎ ＢＨ，ｅｔ ａ１．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ Ｃｕ，Ｚｎａｔ ３Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｃｈａｉｎ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎｄｍｅｔａｌ ｌｉｇａｎｄｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９７５，７２（４）：１３４９－１３５３． 【３７】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＳ，Ｔｈｏｍａｓ ＫＡ，ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＤＣ．Ａｌｐｈａ―ｃａｒｂｏｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｆｏｒｂｏｖｉｎｅ Ｃｕ，Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７５，６３（４）：９８６－９９２．Ａ，Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ Ｊｒ，Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ［３ ８】ＡｎａｓｔａｓｉＷＨ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｉｒｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７：５４１．５４６．【３９】ＹａｍａｋｕｒａＥＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆｉｒｏｎ―ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ １ ９７６，４２２（２）：２８０－２９４．ｏｖａｌｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，【４０】ＳａｔｏＳ，Ｎａｋａｚａｗａ Ｋ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｃｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７８，８３（４）：１１６５一１１７１．【４１】Ｙａｍａｋｕｒａ Ｆ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ，Ｍｉｔｓｕｉ Ｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｉｒｏｎ―ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍｃｒｙｓｔａｌ ｄａｔａ ｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．，１９７６，２５１（１５）：４７９２－４７９３． ［４２】ＰｏｗｅｒｓＴＢ，Ｓｌｙｋｈｏｕｓｅ ＴＯ，Ｆｅｅ ＪＡ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａｌｌｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃｃｒｙｓｔａｌ ｆｒｏｍ ｏｆ ｉｒｏｎ―ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｂ［Ｊ】．Ｊ．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１ ９７８，１ ２３（４）：６８９－６９０． 【４３】Ｂｅｅｍ ＫＭ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＳ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＤＣ．ＭａｎｇａｎｅｓｅｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ Ｘ－ｒａｙｃｏｌｉ ａｎｄｆｒｏｍｙｅａｓｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１９７６，１０５（２）：３２７－３３２． ＫＭ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｔｈｅ ２［４４】ＴａｉｎｅｒＪＡ，Ｇｅｔｚｏｆｆ ＥＤ，Ｂｅｅｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｃｏｐｐｅｒ，ｚｉｎｃ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｍ０１．Ｂｉ０１．１９８２，１６０：１８１－２１７．［４５】ＨｉｌｌｂｙＨＡＯ，Ｌｅｅ １ＨＷＫ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅｎｕｃｌｅａｒ－ｍａｇｎｅｔｉｃ．ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１ ９８０，１ ８５：２４５．２５２．［４６】ＣａｓｓＡＥＧ，Ｈｉｌｌ ＨＡＯ，ＨａｓｅｍａｎｎＶ２６ｅｔ ａ１．１Ｈ Ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ浙江工业大学硕士学位论文ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｗｉｔｌｌ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅｃｏｐｐｅｒ－ｚｉｎｃ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］．Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７８，４３（６）：４３９－４４９．ＢＥ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ１【４７】Ｃａｓｓ ＡＥＧ，Ｈｉｌｌ ＡＯ，Ｓｍｉｔｈｃｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｂｙＨｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，１６（１４）：３０６１―３０６６． ［４８］ＤｕｎｂａｒＪＣ，Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＪＴ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｕ，Ｚｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒｏｐ．Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈ．ｒｅｓｐ．，１ ９８ １，１ ７（ｓｕｐｐｌ）：５ １―６１． ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆＨｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｃ－２ ｐｒｏｔｏｎｓ ｉｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ【４９】ＣａｓｓＡＥＧ，Ｈｉｌｌ ＨＡＯ．Ｔｈｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｓ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ―ｍｅｔａｌ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｎｌ．Ｊ．，１９７９，１８３：１２７－１３２．【５０】ＤｕｂａｒＪＣ，Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＪＴ，Ｕｃｈｉｄａ Ｔ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔＣＵＥ，Ｚｎ２－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ．Ａｐｐａｒｅｎｔ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｌｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８２，４７（３）：１６３－１７１． ［５ １】Ｂａｕｅｒ Ｒ，Ｌｉｍｋｉｌｄｅ Ｐ，ＪｏｈａｎｓｅｎＪＴ．Ｌｏｗａｎｄ ｈｉ曲ｐＨ ｆｏｒｍｏｆ ｃａｄｍｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１ ９７６，５（２）：３３４―３４２．［５２】ＢａｕｅｒＲ，ＤｅｍｅｔｅｒＩ，Ｈａｓｅｍａｎｎ Ｖ ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅ ｉｎＣｕ，Ｚｎ―ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ｐｅｒｔｕｒｂｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｏｎａｎｇｕｌａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆ ｇａｍｍａｒａｙｔｈｅ Ｃｕ，１ １ １ Ｃｄ－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８０，９４（４）：１２９６―１３０２． 【５３】Ｐｕｇｅｔ Ｋ，Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ ＡＭ．Ｉｒｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｉｕｍｉｎｏｕｓｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９７４，５６（９）：１２５５－１２６７． 【５４】ＬａｖｅＵｅ Ｆ，Ｍｃａｄａｍ ＭＥ，Ｆｉｅｌｄｅｎ ＥＭ，ｅｔｃａｔａｌｙｔｉｃ ａ１．Ａ ｐｕｌｓｅ－ｒａｄｉｏｌｙｓｉｓ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｉｒｏｎ－ｘｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｆｒｏｍＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１ ９７７，１ ６ １：３－１ １．ＲＤ，Ｋｏｅｎｉｇ ＳＨ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ【５５】Ｇａｂｅｒ ＢＰ，Ｂｒｏｗｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｖ Ｂｏｖｉｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７２，２７１（１）：１－５． 【５６】Ｔｅｒｅｎｚｉ Ｍ，Ｒｉｇｏ Ａ，ＦｒａｎｃｏｎｉＣ，ｅｔ ａ１．ｐＨｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｐｒｏｔｏｎｓ ｉｎ２７ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ浙江工业大学硕士学位论文ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７４，３５１（２）：２３０―２３６． 【５７】砌ｇｏＡ，Ｓｔｅｖａｎａｔｏ Ｒ，。Ｖｉｇｌｉｎｏ Ｐ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕ，Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｂｙ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１ ９７７，７９（３）：７７６－７８３． ［５８】ＭａｌｉｎｏｗｓｋｉＤＰ，Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｏ．ｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ５９０９．５９１７．ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１ ９７０，１ ８（２６）：【５９】李益新，方允中，刘智峰．铜锌超氧化物歧化酶的重组研究ＩＩ．电离辐射对 重组的影响［Ｊ】．生物化学与生物物理学报，１９８４，１６：４８０－４８４．【６０】Ｋｏｐｐｅｎｏｌ ＷＨ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅａｎｄ ｏｘｙｇｅｎｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｂｕｌｌ，ｅｕｌ＇．Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈ．Ｒｅｓｐｉｒ．，１ ９８ １，１ ７（ｓｕｐｐｌ）：８５―９０．【６１】方允中，}