检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较()
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本试题来自：（2009年临床检验士专业实践能力模拟试题，）一
以下每一道考题下面有A、B、C、D、E五个备选答案。请从中选择一个最佳答案。下列哪一种致泻性大肠埃希菌所致的疾病很像痢疾，腹泻呈脓血便，有里急后重，故曾称志贺样大肠埃希菌(
)A．肠产毒型大肠埃希菌ETECB．肠侵袭型大肠埃希菌EIECC．肠致病型大肠埃希0菌EPECD．肠出血型大肠埃希菌EHECE．肠集聚型大肠埃希菌EAEC正确答案：有， 或者
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2011年5月起，德国出现新型肠出血性大肠埃希菌（enterohhaemorrhagic Escherichia coli, EHEC）感染的疫情，来势凶猛，很快蔓延到英国、荷兰、法国、奥地利、挪威、西班牙、瑞士、丹麦、芬兰、捷克等几乎整个欧洲国家，美国也发现了确诊病例。截止6月底，已报告有3600余人发病，死亡52人。更为严重的是，有852例感染者（约20%）发生了溶血性尿毒综合征（haemolytic uremic syndrome, HUS）。患者在腹泻、发热后很快出现急进性的肾功能衰竭、血小板减少和血管内溶血等症状而危及生命[2]。因此，及时的诊断和进行抢救性治疗成为关键。
1 新型病原菌的确定
已知的致病性大肠埃希菌有产毒素性、致病性、侵袭性、肠出血性和肠聚集黏附性5种。我国学者[3]报告的产志贺毒素且具侵袭力者尚需更多研究证实。EHEC有200余种血清型，通常流行的是O157∶H7血清型，此血清型引起的爆发性流行在世界许多国家和地区，包括我国的安徽省等地均发生过。这次欧洲大范围流行的病原体经过有我国科学家参与的全基因组测序发现它是O104∶H4血清型，其基因有80%来自O104型细菌，另20%来自肠聚集黏附性大肠埃希菌（enteroaggregative Escherichia coli, EAggEC）。代表菌株TY年自中非的艾滋病患者的腹泻标本中分离的EAggEC（代表菌株55989）有超过93%的同源性。EAggEC常引起儿童和成人的急性或持续性腹泻。目前所形成的基因杂交变种缺失了EHEC毒力岛上的eae基因和pO157大质粒上的ehxA基因，却获得了EAggEC的数种毒力基因，包括aggA至aggD的4个基因等。可以认为，它结合了EHEC和EAggEC的基因特性[5]。人们对此新型菌株缺少免疫力，故形成产志贺毒素肠聚集性大肠埃希菌（shiga toxin-producing enteroaggregative Escherichia coli, STEAEC）的爆发流行，震惊了世界。
2 新型病原菌的致病机制
2.1 新型病原菌的致病机制主要是能在患者体内产生志贺毒素。志贺毒素以前也被称为Vero细胞毒素，类志贺毒素，故EHEC与Vero细胞毒素大肠埃希菌和志贺毒素大肠埃希菌实为同义词。志贺毒素作用于肠道引起腹泻，其病理表现为肠黏膜出血和水肿，伴有和致病性大肠埃希菌引起的与紧密黏附/擦伤（A／E）相似的细胞损伤，使细胞内Ca2+和IP3升高，进一步加剧损伤。编码志贺毒素的基因主要有stx1和stx2，还有一些变异体。志贺毒素与痢疾菌的毒素性质相近，由A、B两个亚单位组成。相对分子质量为32&103的A亚单位为蛋白溶解性，B亚单位为五聚体，与肠道细胞上的糖脂性受体结合而起作用。志贺毒素是引起肠出血和HUS的重要因子，stx2在导致HUS中比stx1更为重要，且对肾脏血管内皮细胞有更大毒性，其编码基因分为stxA2和stxB2。已证明，此次新型菌株流行易造成肾脏急性损伤，与其可产生更多的stx2有很大关系[6]。
2.2 来自EAggEC的聚集黏附菌毛I型基因簇（AAF/I） AAF/I是感染菌黏附于肠壁的重要因子，同时在肠壁发生紧密黏附/擦伤（A／E）样的细胞损伤。据Qin等[7]研究，上述两基因（簇）是新型流行菌株的重要特征。经对54株欧洲流行菌的检验，有52株同时检出stx2和AAF/I两种基因，认为可以常规应用于对该菌的检验和鉴定。
2.3 其他毒力因子 如质粒编码的肠溶血素，EHEC通常具有相对分子质量为60 000&103的质粒，编码溶血素。原在德国发生的感染，90％的产志贺毒素菌株有此质粒，质粒的基因为ehxA，ehxB，ehxC，ehxD。溶血素可溶解红细胞以供应EHEC更多的铁并促其生长。ChuA基因即大肠杆菌含铁血红蛋白利用基因编码相对分子质量为69&103的外膜蛋白，可使EHEC利用溶血的铁促进生长。细菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是菌体O抗原结构的组成部分，可增强志贺毒素的细胞毒性。
3 临床表现
EHEC可导致急性出血性腹泻、出血性结肠炎和HUS。可出现的并发症有胆囊炎、肠穿孔、胰腺炎、阑尾炎、肺炎、出血性膀胱炎、肺水肿、心肌损伤和神经症状，最严重的是发生HUS。过去流行中的EHEC感染者只有不足10％发生HUS（多发生在16岁以下儿童或老年人），其潜伏期3-4 d，也可短至1-2 d。患者出现肠绞痛、低热、血便，约半数有呕吐。发生HUS的患者表现为微血管异常溶血性贫血、血尿、少尿或无尿、皮下黏膜出血、血小板减少和急进性肾功能减退，可迅速出现肾功能衰竭，常危及生命。尤其值得注意的是，抗生素的应用可使菌体裂解释放出更多志贺毒素，易引起HUS以及菌群失调，给治疗带来困难，应特别注意。
4 检验诊断
4.1 粪便常规检验 粪便常规检验有肉眼可见的鲜血或显微镜下的红细胞，这是提示该菌感染的重要线索。镜下白细胞也较多。
4.2 粪便培养 ①细菌的分离培养应尽早进行，在发病2 d内分离率可达100％，3-6 d则由91.7％降至30.3％。常规应用的麦康凯和中国蓝琼脂培养基适用，而SS琼脂培养基因可抑制部分大肠杆菌生长而不适用。美国疾病预防控制中心建议对血便应用山梨醇麦康凯琼脂（sorbitol macconkey agar, SMAC）选择性培养基。EHEC不发酵山梨醇，在此培养基上生长为白色的菌落为可疑，再进一步鉴定其O、H抗原。②增菌培养。粪便接种于含50 ng/mL头孢克肟和40 &g/mL万古霉素的 GN肉汤或胰酶大豆汤内，经4 h增菌后分离可提高检出率。③改良SMAC选择性培养基。培养基中加入亚锑酸盐或加入新生霉素以选择性地抑制其他大肠杆菌生长。由于EHEC也不发酵鼠李糖，故含有头孢克肟、山梨醇和鼠李糖的培养基有更佳的选择性。
4.3 生化反应初步鉴定EHEC一般不发酵山梨醇和鼠李糖，其&葡萄糖醛酸酶也为阴性。可用&葡萄糖醛酸酯的发色或荧光底物来检测，是快速鉴定EHEC的一种手段。在非选择性的肠溶血素琼脂培养基温育3 h和过夜出现溶血的菌落也有提示作用。但应注意这些生化指标对检验STEAEC的结果尚无报告。发酵山梨醇和&葡萄糖醛酸酶阳性的EHEC菌株均曾出现过。
4.4 确定细菌的O、H抗原 这是确定菌型的关键。传统方法应用大肠埃希菌的O、H分型血清与菌落进行凝集试验，但H抗原的检出常需进行诱导。现有用O和H抗原的单克隆抗体致敏的胶乳凝集法。已报告有商品ELISA试剂盒直接自粪便中检测O抗原的快速方法。
4.5 志贺毒素检查 志贺毒素的检验方法有ELISA法，反向胶乳凝集法（VTEC-RPLA，OXOID公司，日本SEIKEN公司）、检测LPS的ELISA法和免疫磁珠分离菌体再测毒素的方法等。经典的方法是用Vero细胞进行细胞毒试验，观察在毒素作用下细胞的特异性形态改变。
4.6 基因诊断 如上述，推荐用PCR扩增技术检测stx2和AAF/I两种基因，均为阳性即可确定为STEAEC。可用多重PCR同时检查多种基因。Paton等同时检查stx1、stx2、eae、ehxA、saa 5种基因对EHEC的鉴定取得满意结果。新兴起的基因芯片在菌种鉴别及流行菌株的确定和研究中起着重要作用，但目前尚不适宜常规应用。
4.7 流行菌株的确定 由于EHEC常发生爆发流行，所以流行病学调查，追踪感染源和确定流行菌株有着关键性意义。常需要用PCR-基因限制性片段多态性分析，PCR-随机扩增多态性分析，PCR-单链构象多态性分析，多位点序列分型技术和质粒DNA酶切指纹图谱等分子生物学技术来确定流行菌株的同源性。
4.8 血清学诊断 过去在诊断O157∶H7 EHEC的感染中用患者感染期和恢复期血清与流行菌株的菌液做凝集试验，有4倍以上凝集滴度升高者，可确诊。此法只能作为回顾性诊断和流行病学调查。在此次STEAEC的流行中的诊断作用尚未见报告。
4.9 抗菌药物敏感性试验 据现有资料，本菌对氨苄西林、多种头孢类、四环素类耐药，对氨基糖苷类、环丙沙星、碳青霉烯类、磷霉素敏感。
5 EHEC感染的防治
对感染患者的治疗中一个很重要的问题是不能随意使用抗生素。因为在抗生素作用下，菌体大量裂解，可增加菌体内志贺毒素的释放，使病情加重，以致促进HUS的发生。因此输液、补充电解质和调节肠道的细菌群是治疗的重要手段。如疑似发生了HUS，应该及时输入新鲜血浆、浓缩红细胞和血小板。抢救重症患者需采用血液透析疗法，使用肝素、蛋白酶抑制剂疗法。密切监测肾功能的改变，严重者要及时做肾切除或肾移植手术。德国报告研制成功一种对抗志贺毒素的单克隆抗体，在治疗危重患者中证明有效。
我国目前尚没有该病原菌感染报道，提高对该病的认识，加强预防十分重要。该菌存在于家畜（牛、鸡、羊、狗、猪等）的肠道。家畜粪便污染的食物是主要的感染源。蔬菜、水果是受污染的主要食品。多数患者是因生食了黄瓜、西红柿或生菜、沙拉等而被感染。在欧洲流行的初期，德国曾发布信息，认为流行菌株来源于从西班牙进口的黄瓜，但未有直接证据。后经检验证明德国产的豆芽等芽苗菜，是此次疫情的源头。被细菌污染的水源（包括饮用水、游泳池水、湖水、地表水等）也是重要的传播媒介。人与人间的密切接触也可传染，因未治愈的患者粪便和受污染的环境中也可带菌。要防止&病从口入&，要避免生食蔬菜和水果，或者在食用前认真洗涤和消毒。不要饮生水，注意饭前、便后的认真洗手。有关部门要切实加强食品卫生监督，搞好水源管理，加强对家畜、家禽、奶类和肉类产品的管理，避免经食品和水源而传播EHEC。我国卫生部已及时发出感染防控通知和初步的检验流程要求，应切实执行。
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资料简介随着社会的不断进步与发展，人们对医护人员的手部卫生程度要求越来越高，有文献报道，造成医院感染的原因中３０．０％是由于细菌或病毒通过医护人员手部传播，因此对医护人员手部清洁和消毒是控制医院感染最简便最重要的方法之一；而高效快速的细菌检测方法有助于提高细菌的检出率，为医护人员手部卫生消毒效果评价提供更确切的标准。
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