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标题: 染色体的制备和核型分析
摘要: [染色体的制备和核型分析]1． 熟悉小鼠骨髓或人外周静脉血染色体标本的制备方法。 2
熟悉正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。3． 了解人类染色体G显带标本制备与分析。 二、实验原理染色体是细胞分裂(cell pision)期高度凝集的DNA蛋白质纤维，是间期染色质结构紧密盘绕折叠的结果。核型是指一个体细胞内的全部染色体按其大小、形态特征排列起来构成…… [本文关键词:染色体 长臂 短臂 染色 着丝粒]……
1． 熟悉小鼠骨髓或人外周静脉血染色体标本的制备方法。
2. 熟悉正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
3． 了解人类染色体G显带标本制备与分析。
二、实验原理
染色体是细胞分裂(cell pision)期高度凝集的DNA蛋白质纤维，是间期染色质结构紧密盘绕折叠的结果。核型是指一个体细胞内的全部染色体按其大小、形态特征排列起来构成的图像。染色体标本经显带技术处理，可使染色体长轴上显示出明暗或深浅相间的带纹，每条染色体都有独特而恒定的带纹。将待检细胞进行染色体数目、形态结构分析，确定其核型是否与正常核型一致，称为核型分析。染色体核型分析，是遗传学科学研究和辅助临床诊断的重要手段之一，是分析染色体易位、缺失，诊断各种遗传病变的关键指标。
采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72h细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂(cell pision)，使细胞分裂(cell pision)停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色，在显微镜下观察。考虑到大多数学校很难采集人血，本章在实验步骤中也介绍了常规材料小鼠骨髓染色体标本的制备方法。此时制备的染色体标本，未经特殊处理，直接染色后镜下观察进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
染色体带型主要取决于DNA、蛋白质及染料三者的相互作用。显带技术不同，染色体上显示出的带纹也不同。染色体显带技术包括G显带、Q显带、R显带和C显带等。G显带技术简便易行，所显示的染色体带纹清晰、普通显微镜下可以分辨，标本可长期保存，因此被广泛应用。将上述制备的未经特殊处理的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，在普通光学显微镜下，染色体上可见明暗相间的G带带纹。
三、实验用品
1.材料：小鼠或人
2.试剂：秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、Giemsa染液（PBS：Giemsa原液=9:1）、肝素（500U/ml）、RPMI1640液体培养基（含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）、2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH。
眼科剪、眼科镊、注射器（带针头）、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、10ml离心管、乳头吸管、试管架、载玻片、玻片架、染色缸、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸。
四、实验步骤
(一）小鼠骨髓细胞或人外周血淋巴细胞染色体标本常规制备
1.收集细胞：
小鼠骨髓细胞的收集：实验前2.5～3h，往小鼠腹部皮下注射秋水仙素（每克体重注射0.02ml）。采取颈椎脱臼法处死小鼠，取其股骨（肱骨），将周围的肌肉剥净。剪断股骨（肱骨）一端，用注射器的针头从另一端注入4～5ml的37℃预先温热的KCl低渗溶液（0.075mol/L），冲洗骨髓于离心管中。
人外周静脉血的采集及接种培养：
1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。
1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。
1.3 在超净工作台中，预先将RPMI1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加0.3ml全血，水平摇动混匀。
1.4 置37℃恒温培养箱中培养72h。培养过程中每天水平摇动培养物1～2次，使血液均匀悬浮，再继续培养。
1.5 终止培养前2～4h，加入秋水仙素1滴。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养72h。
1.6 收集细胞：去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中，1000rpm离心8min。
2.1 低渗：弃上清液，加入8ml 37℃预温的KCl低渗溶液（0.075mol/L），用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理25min。
2.2 预固定：加入 1ml新配制的Carnoy固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8min。预固定可防止细胞在固定时聚集成块。
2.3 固定：弃上清液，加入8ml Carnoy固定液，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20min。1000rpm离心8min。弃上清液，重复固定一次。
2.4 制备细胞悬液、制片：弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的Carnoy固定液，吹打细胞制成悬液。吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，空气中自然烘干。
2.5 染色和镜检：将标本置Giemsa染液（PBS：Giemsa原液=9:1）中，染色8min，水洗去浮色，空气中自然烘干，并于显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。
(二）人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备
1.1 标本选择：上述常规制备的人染色体标本未染色时镜检，如显示长度适中、分散好、重叠少、姐妹染色单体适度分开，这样的标本片可用于G显带。选取未经染色的、片龄3-7天的人染色体非显带标本片可制备G显带。
1.2 烤片：将标本片置70℃烤箱中干烤2h，自然冷却至室温。
1.3胰酶预温：取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45ml生理盐水，用 HCl或NaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH=6.8～7.2），置 37℃预温。
1.4 显带：将玻片标本放入胰酶溶液中处理25～45s，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中，然后用蒸馏水冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。
1.5 染色和镜检：将玻片标本放入37℃预温的Giemsa染液（PBS：Giemsa原液=9:1）中，染色5～10min。自来水冲洗，空气中自然烘干，并在显微镜下观察。
五、实验结果
1.小鼠或人染色体非显带核型分析
取一张染色体玻片标本，先在低倍镜下观察，再用高倍镜寻找清晰分散的中期分裂相，然后转换油镜仔细观察，寻找10个分散好的分裂相进行染色体计数。小鼠染色体数目2n=40，而正常人染色体数目为2n=46。为了便于计数和避免计数时发生重复和遗漏，在计数前应先按染色体的自然分布图形大致划分几个区域，然后按顺序数出各区染色体的实际数目，最后加在一起求出该细胞的染色体数。按显微镜中所看到的图像，在报告纸上描绘出各染色体的快速线条图，在草图中，应保持各染色体的原有方位和相对长度。
小鼠染色体呈“U”形，全部为端部着丝粒染色体。依据人类细胞遗传学的国际体制（ISCN），按照染色体的大小和着丝粒的位置等特征，人类染色体分成A、B、C、D、E、F、G共7组，各组所包含的染色体及染色体的结构特征如下：
A组：包括1～3号3对染色体。1号最大，为中央着丝粒染色体，长臂有时可看到次缢痕；2号较1号小，为最大的亚中央着丝粒染色体；3号是比1号小的中央着丝粒染色体。
B组：包括4～5号2对染色体。较大，均为亚中央着丝粒染色体，短臂较短，这二对染色体不易区分。
C组：包括6～12号7对染色体和X染色体。中等大小，几乎都是亚中央着丝粒染色体。6、7、8、11号染色体短臂较长，9、10、12号染色体短臂较短，9号染色体长臂常出现次缢痕，11号染色体有时也出现次缢痕；12号染色体最小，但不易与组内其它4对较短的区分。X染色体的大小在第6、7号染色体之间；女性体细胞中有2条X染色体，所以C组为16条染色体；男性体细胞中有1条X染色体，因此C组为15条染色体，C组染色体最难区分。
D组：包括13～15号3对染色体。中等大小，均为大的近端着丝粒染色体，染色体短臂上有时可见随体。彼此间不易区分。
E组：包括16～18号3对染色体。较小，16号为中央着丝粒染色体，长臂常有明显的次缢痕。17、18号为最小的亚中央着丝粒染色体，18号染色体短臂很短，较易于17号相区别。
F组：包括19～20号2对染色体。为小的中央着丝粒染色体，彼此不易区分。
G组：包括21～22号2对染色体和Y染色体。为最小的近端着丝粒染色体，21、22号染色体长臂呈分叉状，短臂末端有随体。Y染色体无随体，着色深，长臂末端常靠拢。
在进行染色体照片剪贴分析时，先根据ISCN规定的各组及各号染色体的结构特征进行分组、排号，依次找出A、B、D、E、F、G组，最后辨认C组，即在每条染色体旁用铅笔标出其组号；然后用剪刀将每号染色体剪下，将每组染色体按照大小顺序依次排列，此时如发现排组有误还可进行调整；最后将染色体组号剪去，并将各号染色体排在染色体核型分析表的相应位置上，用浆糊粘牢。粘贴时，应使染色体的短臂居上、长臂居下，并使着丝粒在一条直线上（见图20.1，20.2）。一般根据C组和G组的染色体数目来判断性别。而且常按G组最小染色体的数目判断。若最小染色体4条则为女性，若5条则为男性。
最后，验证核型分析是否正确，用圆规、直尺测量每条染色体的总长度、短臂和长臂的长度，代入相应的公式，计算如下染色体参数：
相对长度＝（单个染色体长度）/（22个常染色体长度＋X染色体长度）×100
臂比＝（长臂长度）/（短臂长度）
着丝粒指数＝（短臂长度）/（染色体全长）×100
图20-1 正常男性非显带（Giemsa染色，1000×）
图20-2 正常女性非显带（Giemsa染色，1000×）
作业：找一张分散良好的中期分裂相，观察计数染色体，并绘制一个核型草图。
2. G带显示的正常人显带核型图 （图20-3、20-4、20-）
短臂：近侧段有2条着色较深的带，远侧段可显出3～4条淡染的带。短臂分为3个区，近侧的第1深带为1p21，第2深带为1p31。
长臂：副缢痕紧贴着着丝粒，染色深，另外有4～5个分布均匀的中等着色带，中央一条带最深；长臂分4个区，中段深带为1q31。
短臂: 有4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分2个区，中段两条深带之间的浅带为2p21。
长臂：可见7条深带，第3和第4深带有时融合。此臂分3个区，第2和第3深带之间的浅带为2q21，第4和第5深带之间的浅带为2q31。
着丝粒深染，在长臂与短臂的近中段各具有1条明显的较宽的浅带，看上去似乎两臂带型呈对称分布，似蝴蝶状。
短臂：近侧段可见1条较宽的深带，处理较好的标本上，此带可分为2条；远侧段可见2条深带，其中远侧一条较窄，且着色浅，这是识别3号染色体短臂的显著特征。此臂分2个区，中段浅带为3p21。
图20-3 G显带染色体标准带型图
Giemsa染色，1000×）长臂：在近侧段和远侧段各有1条较宽的深带，在处理好的标本上，近侧段的深带可分为2条深带，远侧段的深带可分为3条深带。长臂分为2个区，中段浅带为3q21。
短臂：中央可见1条深带。
长臂：可见均匀分布的4条深带，其中近端的一条着色最深；长臂分为3个区，近侧第1和第2深带之间的浅带为4q21，远侧段深带之间的浅带为4q31。
短臂：可见2条深带，远侧带宽且着色深，此臂只有1个区。
长臂：近侧段有2条深带，染色较浅，有时不明显；中段可见3条深带，染色较深，有时融合为一条宽的深带；远侧段可见2条深带，近端的一条着色较深；此臂分3个区，中段第2深带为5q21，中段深带与远侧深带之间的宽阔的浅带为5q31。
短臂, , ：, 中段有1条明显宽阔的浅带，形如“小白脸”，是该染色体的特征，近侧段和远侧段各有1条深带，近侧深带紧贴着丝粒。在处理好的标本上，远侧段深带可分为2条深带；短臂分2个区，中段明显而宽的浅带为6p21。
长臂：可见5条深带，近侧一条紧贴着丝粒，远侧末端的一条深带着色较淡；长臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为6q21。
图20-4 正常男性G显带核型
Giemsa染色，1000×）×
着丝粒着色深。
短臂：有3条深带，中段深带着色较浅，有时不明显，远侧深带着色深，形似“瓶塞”；短臂分为2个区，远侧段的深带为7p21。
长臂：有3条明显深带，远侧近末端的一条着色较浅，第2和第3深带稍接近；长臂分3个区，近侧第1深带为7q21，中段第2深带为7q31。
图20-5 正常女性G显带核型（Giemsa染色，1000×） 8号染色体
短臂：有2条深带，中段有1条较明显的浅带，这是与10号染色体区别的主要特征；此臂分2个区，中段的浅带为8p21。
长臂：可见3条分界极不明显的深带，分2个区，中段深带为8q21。
短臂：远侧段和中段各有1条深带，在显带较好的标本上，中段可见窄的深带；此臂分2个区，中段的深带为9p21。
长臂：可见2条明显深带，着丝粒区深染，其下的次缢痕区浅染而呈现出特有的颈部区；此臂分3个区，近侧一条深带为9q21，远侧一条深带为9q31。
10号染色体
短臂：近侧段和近中段各有1条深带，在有些标本上近中段可见2条深带，与8号染色体相比，其上深带的分界欠清晰。此臀只有1个区。
长臂：可见明显的3条深带。近端的一条着色最深，这是与8号染色体区别的一个主要特征，分2个区，近端的一条深带为10q21。
11号染色体
短臂：近中段可见1条深带，在处理较好的标本上，这条深带可分为3条较窄的深带。此臂只有1个区。
长臂：近侧有1条深带，紧贴着丝粒，远侧段可见1条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体区别的一个明显的特征；在显带较好的标本上，远侧段的深带可分为两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是一个分区的界标，在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。此臂分为2个区，上述远侧两条深带之间的浅带为11q21。
12号染色体
短臂：中段可见1条深带。此臂只有1个区。
长臂：近侧有1条深带，紧贴着丝粒；中段有1条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带。但与11号染色体比较这条浅带较窄，这是鉴别12号染色体的一个主要特征，在处理较好的标本上，中段这条较宽的深带可分为3条深带。其中间一条着色较深；在有些标本上，远侧段还可以看到1～2条染色较淡的深带；长臂分为2个区，中段正中的深带为12q21。
其长度介于6号和7号染色体之间，主要特点是长臂和短臂中段各有1条深带，有“一担挑”之名。
短臂：中段有1条明显的深带，如竹节状。在有些标本上，远侧段还可见1条窄的、着色淡的深带。此臂分为2个区，中段的深带为Xp21。
长臂：可见3～4条深带。近中段一条最明显；长臂分为2个区，近中段深带为Xq21。
13号染色体
着丝粒区深染。长臂可见4条深带，第1和第4深带较窄，染色较浅；中间两条宽而深，分为3个区，第2深带为13q21，第3深带为13q31。
14号染色体
着丝粒区深染。长臂近侧和远侧各有1条较明显的深带，长臂共有4条深带，但分布不同于13号染色体，近侧一条窄和一条宽的带常融合在一起，在处理较好的标本上，中段可见1条很窄的深带；长臂分3个区，近侧深带为14q21，远侧的较宽深带为14q31。
15号染色体
着丝粒区深染。长臂中段有1条较宽深带，染色较深，有的标本上近侧段可见一条较窄的深带。远侧一条较窄深带位于该臂最末端而有别于14号，长臂分为2个区，中段深带为15q21。
16号染色体
短臂：中段有1条深带，较好的标本上可见2条深带。此臂只有1个区。
长臂：近侧段和远侧段各有1条深带。有时远侧段一条不明显，次缢痕区着色浓，长臂分2个区，中段深带为16q21。
17号染色体
短臂：有1条深带，紧贴着丝粒。此臂只有1个区。
长臂：远侧段可见1条明显深带。这条深带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带；长臂分2个区，这条明显而宽的浅带为17q21。
18号染色体
短臂：有1条窄的深带。此臂只有1个区。
长臂：近侧和远侧各有1条明显的深带。此臂分为2个区，两深带之间的浅带为18q21。
19号染色体
着丝粒及周围为深带，其余为浅带；
短臂和长臂均只有1个区，该染色体为核型中着色最浅的染色体。
20号染色体
全为着色较浅的带型，着丝粒区较为深染；
短臂：有1条明显的深带。此臂只有1个区。
长臂：在中段和远侧段可见1～2条染色较浅的深带，有时全为浅带。此管只有1个区。此染色体有“头重脚轻”之名。
21号染色体
着丝粒区着色浅，其长度比22号短，其长臂上有明显而宽的深带且靠近着丝粒，分2个区，其深带为21q21。
22号染色体
着丝粒区着色深。其长度大于21号染色体，在长臂的中段有1条较窄的深带，长臂只有1个区。
其形态和长度变化较大，在人群中呈现多态性，一般整个长臂深染，在处理好的标本有时可见2条深带。长臂只有1个区。
作业：正常人G显带染色体核型照片剪贴。
六、注意事项
1. Carnoy固定液和Giemsa染液须现配现用。
2．采血时不要加入太多的肝素，因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。
3．培养过程中培养液逐渐变黄色，说明PH发生了较大变化，将不利于细胞生长，此时可加入适量灭菌的1.4% NaHCO3溶液调整，或再加入2～3ml培养液的办法来校正。
4．标本质量不佳的原因：①秋水仙素的处理不当，如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少；如浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难于进行分析；②低渗处理不当，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；如果低渗处理不够，则染色体分散不佳，难以进行计数分析；③离心速度不合适，收集细胞时离心的速度太低易丢失细胞，如果低渗后离心速度过高，往往使分裂相过早破裂，完整的分裂相减少；④标本固定不充分，如Carnoy固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；⑤玻片去污不彻底，冷冻不够，使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失，或染色体分散不佳。
5．制备G显带染色体标本时，要严格控制胰酶消化时间，时间不足显不出带纹，时间过长，使染色体不规则或形成空泡状。
【附】：G带歌诀
人类染色体G带识别歌谣
一秃二蛇三蝶飘，四像鞭炮五黑腰；
六号短空小白脸，七盖八下九苗条；
十号长臂近带好，十一低来十二高；
十三、四、五一二一，十六长臂缢痕大；
十七长臂戴脚镣，十八白头肚子饱；
十九中间一点腰，二十头重脚飘飘；
二十一好像葫芦瓢，二十二头上一点黑；
X染色体一担挑，Y染色体长臂戴黑脚。
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