关注今日：6 | 主题：483703
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】MTT筛选药物有效作用浓度中的问题
页码直达：
这个帖子发布于6年零290天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
用H2O2损伤模型筛选药物有效浓度过程中，在96孔板上筛选，分别在板子两侧设定了空白组和模型组，但是每次都会发现两边的差值很大，有统计学意义。跑过几次空板子，发现OD值或从左向右增高或降低，影响对实验结果的判断。为了弄清楚原因，分别作了板子放在孵箱中的位置和摆放方向，以及铺板时点板顺序对结果的影响，发现均无影响。现在，对筛选药物有效浓度的实验结果影响非常大。每次均设阳性对照组，阳性药物的结果非常好，但所筛选的药物的效果就时有时无了。而且，在用96孔板筛完有效以后，改在48孔板上时又会出现没有效的情况。请教各位，在我的实验中到底哪个环节中出现了问题。谢谢
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
有人帮忙没？谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
用多孔板筛选药物就这样，多做几个重复，药物处理过程会引入误差，另外酶标仪检测数据也不稳定，肯定会导致交大的误差
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：6 | 主题：483703
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】5-FU在细胞MTT实验中作为阳性对照组时的浓度
页码直达：
这个帖子发布于2年零233天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
我现在做肝癌细胞的MTT实验，需要设置5-FU作为阳性对照组，但是不知道5-FU的浓度该如何选择，此外，在做药物的抗肿瘤实验时，药物是应该用培养基稀释还是用PBS稀释。请各位有经验的学姐学长及老师指点一下，谢谢。急求！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们的药物都是用DMSO溶解后培养基稀释的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
本人做的是肠癌的。。也是需要基本确定要用多少的浓度。。。烦请各位大神帮忙啊。。。就算是类似的实验文章也可以贴上来啊。。。感恩感恩！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
有文献是用缓释5-FU微粒600mg。你可以试一下。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
那如果用的不是缓释剂型，是注射液，应该选多大浓度呢，wangyan师姐？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我咨询到之前有师兄用的剂量是5ug/ml，但是我还是没找到相关的文献，可以先按照这个浓度做。很感谢你们的回答！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问一下5-FU你现在用的是什么浓度啊
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我现在用的浓度是5微克/ml。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
5-Fu浓度为5微克每毫升的时候，MTT测的OD值多少？抑制率为多少？急需，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园有关MTT 谢谢 急(孵育,细胞培养基,阴性对照组,阳性对照组) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 有关MTT 谢谢 急(孵育,细胞培养基,阴性对照组,阳性对照组)
摘要: [有关MTT 谢谢 急(孵育,细胞培养基,阴性对照组,阳性对照组)] 各位老师好：
我看了园子里有关MTT大全，受益匪浅！我实验也要用MTT，我整理了下思路
各位老师帮我看下这样行吗？
1、培养细胞48小时
待细胞进入对数生长期后接种入96孔板培养约一周，细胞浓度调整为，加药物（浓度为1ug ml
)，各浓度设3个复孔，以后每天各个浓度取100ul细胞悬 关键词:[孵育 阴性对照组 阳性对照组 细胞培养基 上清 对数生长期 培养细胞]……
各位老师好：
我看了里有关MTT大全，受益匪浅！我实验也要用MTT，我整理了下思路
各位老师帮我看下这样行吗？
1、培养细胞48小时
待细胞进入对数生长期后接种入96孔板培养约一周，细胞浓度调整为，加药物（浓度为1ug/ml
)，各浓度设3个复孔，以后每天各个浓度取100ul细胞悬液做MTT，3个相同浓度的复孔MTT实验测得的数值取平均值。
2、MTT试验是设一个空白组、一个阴性对照组、阳性对照组。
3、其中空白对照是加100ul不含细胞培养基、再加MTT20ul、孵育4小时，吸取上述加的液体，加150ulDMSO振荡10分钟。而阴性对照组就是加100ul含细胞培养基、再加MTT20ul、孵育4小时，离心吸弃上清，加150ulDMSO振荡10分钟；阳性对照组加100ul含细胞及不同药物浓度的培养基、再加MTT20ul、孵育4小时，离心吸弃上清，加150ulDMSO振荡10分钟。最后读数。
各位老师，请帮我看看这样整个过程正确吗？麻烦了，万分感激！
回复有哪位老师帮我看看吗
谢谢啦回复你对空白对照，阴阳性对照的理解不正确。空白对照是用来调0用的，是为了在实验中消除由于洗板，由于培养基固有颜色而给实验结果带来的偏差，所以空白对照也要加培养基，也要和其他实验组一样用PBS洗，用DMSO溶解。与实验组的区别只是空白孔不加细胞而已。阴性对照是为了与加药组做比较的，相当于药物浓度为0的实验组。所以阴性对照只是比刚才的空白对照多了细胞。阳性对照是用来检测你的操作是否有误的，相当于质控。即一定能做出显著结果的。或者说目前已经公认这种药物能产生你想要的结果的。然后再分析你的实验结果，假如阴性孔也出现阳性，则结果无效；假如阳性孔也是一个阴性结果，则结果无效。对于你的实验过程，我觉的最好弃了上清后用PBS再洗1～2次，避免一些残留的药物对DMSO的影响而显色.孵育时间也不需要严格4小时，这个得看经验，2～4小时都可以。回复我做MTT种96孔板,不知道是什么原因,在培养瓶里长得好好的Hela细胞,一种到板里就不行了,细胞变得半死不活的,而且有种变透明的感觉,贴壁后不太长,有的孔里的细胞数量还减少,板里杂质特别多,我都觉得杂质比细胞都多,也不知是板的问题还是培养液的问题,但是同样的培养液在培养瓶里养的细胞蛮好的啊.也不像是污染.我用的是5%多点的血清,应该不会是营养不足吧.还有一个问题就是加到孔里的培养液放到温箱里没几个小时就变得很碱,会不会也与这个有关啊?我现在已经是做第二块板了,细胞状态仍然不好,估计还是不出结果,我都快郁闷死了,我的实验要筛选药物浓度,细胞种上去不长我可怎么筛选浓度啊?还请各位高手帮帮我,多谢了!回复好的
谢谢zjubell 空白对照不用加药物对吗？还有我们试验室没有平板，那怎么离心啊？吸到试管又怕细胞在这个过程有丢失啊回复你的血清浓度是否太低呀
一般都是10％或者15％的啊回复好的
谢谢zjubell 空白对照不用加药物对吗？:对还有我们试验室没有平板，那怎么离心啊？：你可以不离心，100培养基＋20MTT＋150DMSO=270，不会满出来的吸到又怕细胞在这个过程有丢失啊回复我们做MTT，一般都没有离心，效果一样好。而且eachother对空白、阴性、阳性对照的讲解很清楚，受益非浅，以前只知道做，对理论知识掌握少，现在明白了，感谢啊。yueyang_107 所提到的是否有两方面原因，一是你的板处理得不太干净呀，二是你接种到板里的细胞密度是否过大，以至于抑止了细胞的生长。杂质是不是因为细胞死亡造成的。而且你的培养基容易变碱，要看看是不是你的培养箱的问题，或者是二氧化碳的问题。回复谢谢
收获不少回复谢谢
再有个问题：我的试验是检测某种药物对肿瘤细胞凋亡(Apoptosis)机制的影响的，我现在做MTT是为了能摸索出一个较好的浓度，我如果再测这种药物对肿瘤抑制率有何意义呀？因为我曾看过别人的论文，做MTT后，选出最佳浓度，之后在药物对肿瘤抑制率最低的那天收集细胞进行后面的检测。我不理解为什么，可以帮我指点迷津吗？回复谢谢
再有个问题：我的试验是检测某种药物对肿瘤细胞凋亡(Apoptosis)机制的影响的，我现在做MTT是为了能摸索出一个较好的浓度，我如果再测这种药物对肿瘤抑制率有何意义呀？因为我曾看过别人的论文，做MTT后，选出最佳浓度，之后在药物对肿瘤抑制率最低的那天收集细胞进行后面的检测。我不理解为什么，可以帮我指点迷津吗？回复麻烦各位老师看看
谢谢回复我觉得细胞接种浓度是一关键问题，建议做一下细胞增殖与OD值的关系，确定一个细胞浓度回复接种入96孔板培养约一周???为什么要在孔板里培养一周再加药呢？一般都是第一天种板第二天加药，如果分别要处理24h,48h，72h，那就用三块板，每个时间点一块。第一天种三块板，第二天加药，以后每天检测一块板如果时间点比较多也可以用一块板，处理时间短的组后加药，最后一起收样，这么讲可能你不明白，需要的话可以联系我，详细给你讲讲三个副孔在初筛浓度的时候是可以的，但细筛的时候最好增加副孔，我一般都设5个以上的副孔
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-吴春扬 吴风娟 李大伟（上海交通大学药学院 上海闵行 200240）
【摘要】我们提出一种新型的基于体外细胞株增殖抑制的药物筛选方法，该方法使用了绿色荧光蛋白 (GFP)，既简单又省时可靠。我们的实验数据显示，使用绿色荧光蛋白的结果比 MTT测定法更加一致可靠。我们的数据还证实了新的检测方法在细胞生长曲线的灵敏度和精度、抗癌药物的抑制作用、剂量反应。
【关键词】体外细胞株 药物筛选 EGFP MTT
【中图分类号】R979.【文献标识码】A 【文章编号】（2-03
&&&&&&& 药物筛选是药物研发领域中的主要方法。可靠性和有效性是评价药物筛选方法好坏最重要的两个指标。目前，MTT法已经成为一种被广泛使用的检测细胞增殖抑制的标准方法 [1]。这个经典细胞增殖检测方法的可靠性和灵敏度取决于很多因素，存在的一些易出错步骤也为其他更有效、更可靠、更方便的药物筛选方法提供了足够的发展空间 [2]。
&&&&&&& 在本文中，我们研发了一种简单的基于体外细胞株的荧光检测法，获得使用稳定转染 U2OS-EGFP细胞的细胞成活率。运用此方法，我们可以通过测量细胞裂解物的绿色荧光来确定细胞增殖或抑制的情况，因为细胞裂解物的荧光读数直接反映了成活细胞的个数 [3]。EGFP中的绿色荧光 (GF)，激发主峰值在 488nm，发射主峰值在 507nM ，和其他绿色荧光蛋白相比有更长的半衰期 [4]。
&&&&&&& 一 实验材料和方法：
&&&&&&& MTT溶液（5mg/ml用磷酸缓冲液(PBS)配制，pH=7.4)，DMSO购买自 Sigma-Aldrich化学品有限公司（St. Louis, MO），由杜尔贝科改良的鹰培养基（DMEM）购买自Gibco(Grand Island,NY)，胎牛血清（FBS），NP40细胞裂解缓冲液购买自Sigma。阿霉素，戊烷脒。所有的药品和化合物均溶解于DMSO中。1%的 DMSO常被用于药物筛选方法的样本管理，因为大多数细胞培养基能溶解于这个浓度 [5]。
&&&&&&& 二 培养稳定的U2OS - EGFP细胞株(UGFP-DK1)
&&&&&&& U2OS细胞是由pEGFP-N1 感染病毒核酸的细胞株质体放在24单元格培养皿中培养。在感染病毒核酸后的24小时内 细胞株就被转移到10厘米培养皿中培养2周 培养基中含有400&g/毫(,) 升G418为主的培养液 辅以增加10%胎牛血清(,) 和1%的抗生素 (购自北京Solarbio科学和技术(,) )，每隔2-3天更换一次培养基。通过对受感染细胞株稳定增殖过程中选择和测量不同浓度细胞的荧光度。我们选择高荧光度增殖细胞用作药物筛选。U2OS-EGFP 4F12G细胞株 (UGFP-DK1)被选为药物筛选细胞株。
&&&&&&& 三 绿色荧光检测
&&&&&&& 一开始在 DMEM中培养 UGFP-DK1，细胞培养基辅以 10%胎牛血清、1%抗生素，培养至观察到生长阶段（至少2代，每次有80%的细胞融合）。这些细胞使用胰蛋白酶缓冲进行胰蛋白酶化，期间需要对细胞计数并更换新鲜的培养基。然后使用多通道移液管移将细胞移进入96单元格培养皿中(一般为3&10 3个细胞/单元格 ,除非另有说明)，每个单元格拥有200&l培养基 (重复3-5次)。在37℃及5%CO 的恒定环境中培养4到6个小时。当细胞已经附在培养皿壁上，原有培(2) 养液被吸走，选择一定浓度的药物（化合物）和溶媒介质(用DMSO来控制)混合在培养基中(事先准备好)进行替换，然后继续在37℃及5%CO2恒定环境中进行培养。在选择培养好的细胞株后，培养基被完全吸走，加入 150&l溶菌液 (1%NP-40)进行补充。将培养皿振荡 20分钟。从培养皿的每个单元格中取100&l溶菌后的细胞转移到96单元格的白色条板中。用激发主波长为488纳米、发射主波长为507纳米、频带宽度为5的酶联免疫吸附测定仪测定萤光度。裂解缓冲液被用做对细胞荧光度的抑制作用。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重复测试3-5单元格。
&&&&&&& 四 MTT法检测
&&&&&&& 细胞株的培养要增殖两代，每次细胞的融合度要达到有80-90%。等细胞重复在新鲜的培养基中培养并胰酶蛋白化后 用多通道移液管将细胞移至体积为200&l微量滴定盘中，微量滴定盘具(,) 有96单元格，每单元格有个细胞。培养盘在37℃的恒定环境中培养4-6小时,使细胞贴壁。然后吸走原培养基，加入事先准备好的含有一定浓度药物的培养基200&l。这些细胞在37℃及5%CO 2的恒定环境中培养。在药物暴露前4小时加入20&l的 MTT溶液。当药物暴露结束时加入150&lDMSO溶液使细胞的酶反应停止。将盘子振荡15分钟后用 550纳米波长测量细胞外径。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重复测试3-5单元格。控制要求每个培养单元格中有培养基，每个单元格中的细胞都在 DMSO培养液中。
&&&&&&& 五 实验数据分析
&&&&&&& 所有数据均表示为平均数x-&SD。差异的意义由学生的 t -test结果确定。P&0.05被认为有显著不同。所有数据的计算使用了 GraphPad Prism. 软件。
&&&&&&& 六 结论
&&&&&&& 1、比较生长曲线
&&&&&&& 首先，比较 MTT法和绿色荧光法的细胞增殖测量。我们分别使用MTT法和绿色荧光法培养 UGFP-DK1细胞，并绘制出上述两种方法下的细胞生长曲线。我们在天第0天，第1天，第2天和第3天采集读数并绘制成（图1）。第0天的读数是在细胞贴附后记录的。两种方法均能产生可比较的生长曲线。绿色荧光法的实验结果显示和第0天相比，细胞数有了显著的增长，错误也更少。使用MTT法的U2OS细胞的生长曲线是类似的。（数据未显示）
&&&&&&& 图1：UGFP-DK1细胞的生长曲线是通过使用两个不同的检测方法，即荧光法检测（A）和 MTT 法检测 (B)测得的。这些数字说明，第0天-3天从细胞生长的发现有类似。图(C)和(D)显示分别使用绿色荧光和 MTT对第0天测的单元格数目加倍。误差线代表标准错误的 n=5 的值。&
&&&&&&& 图2：图所示由0.2&g/ml阿霉素 ( .) 和基质（■） 对细胞增殖的抑制作用超过四天。荧光检测（A）和MTT法检测 (B)产生了类似的结果。在浓度分别为1&g/ml ( .)、 0.2&g/ml( ■)、0.02&g/ml(▲)、0.01&g/ml( )、0.002&g/ml( .)阿霉素和基质(○)中 ；绿色荧光检测(C)和 MTT检测 (D)的结果是也是相似。误差线代表标准错误的n=5的值。&
&&&&&&& 2、绿色荧光法检测药物反应
&&&&&&& 一个有效的筛选模型，不仅要能计算细胞的生长曲线还要能显示药物反应浓度和时间上的较大差异。本实验中我们使用一种标准的抗癌药物阿霉素（Doxorubicin）进行实验。首先在同等浓度下使用不同的时间梯度，然后在特定的时间点使用不同的浓度梯度。在这两个实验中，我们的荧光法对阿霉素的抗增殖活性产生了明显差异。而MTT法在相同的实验中，结果相似，并未有大的差异（图2）。
&&&&&&& 3、荧光法检测的优点
&&&&&&& 为了确保筛选检测工作或实验数据的一致性，必须对检测方法进行优化。荧光法检测系统优化了检测需要的细胞数和时间间隔。要确定荧光度的细胞数的对应关系，需要制定 UGFP -DK1细胞株的标准曲线。我们将50000细胞接种在96单元格培养皿的第一行单元格中，后面几行依次稀释（后面每行单元格中的细胞数是前面的一半 )直到接种到第12行。细胞被培养一整夜后并测定他们的荧光度(图 3）。48小时后的测定结果显示，在未经处理的单元格中的细胞对高浓度和低浓度药物反应后测得的荧光度差异显著（图4）。
&&&&&&& 图 3：最佳测定时间，分别在 24小时和 48小时对使用 0.2&g/ml( ) 和 1&g/ml() 的阿霉素和基质 ( )进行测定。48小时测定获得较好的效果。误差线代表标准错误的 n=5值。p 值对应基质（＊）和 0.2&g/ml药品 (#)*/ #p&0.05, **p&0.01, ***/###p&0.001
&&&&&&& 八 讨论
&&&&&&& 由于药物筛选是新药研发领域最重要的步骤之一。在本文中，我们描述了我们使用新荧光法的细胞筛选系统进行抗癌药物筛选。我们称这种测定方法为UGFP-DK1 检测法或缩写&绿色荧光蛋白 (GFP) 检测&。我们证明了这种测定方法的简单、有效、可靠。与被广泛使用的标准检测方法-MTT 相比，我们用新的基于荧光法的检测系统得到了相同的结果，但错误要少得多。我们实验室中抗癌化合物的小尺度药物筛选由我们荧光法测定，每次重复的实验结果是一致的，证明我们新测定检测系统的可靠性。
[1]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, - 2): p. 55-63.
[2]Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancer Inst, ): p. .
[3]Kain SR. Green fluorescent protein (gfp): Applications in cell-based assays for drug discovery. Drug Discov Today, ): p. 304-312.
[4]Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods, ): p. 905-909.
[5]Wang X, Ge J, Wang K, Qian J, Zou Y. Evaluation of mtt assay for measurement of emodin-induced cytotoxicity. Assay and drug development technologies, ): p. 203-207.
您可能感兴趣的其他文章
&&站长推荐
&&期刊推荐
&&原创来稿文章
&&网络读者服务
转寄给朋友
朋友的昵称:
朋友的邮件地址:
您的邮件地址:
写信给编辑
您的邮件地址:不同浓度药物刺激筛选最佳浓度的话，用流式还是MTT好？
我要检测TLR4,要用不同浓度去刺激，来筛选出最佳浓度，还要做时间点，这样的话，选用流式好还是MTT好？ 另外，我看有文献报道，有用westernblot、流式检测TLR4的，而TL...
Copyright &
All Rights Reserved.网站备案号：}