禽传染性支气管炎病毒疫苗株染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测人细小病毒 B19 的试剂盒。

1. 即开即用用户只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物经过优化灵敏性高。

3. 提供阳性对照便于区分假阴性样品。

4. 特异性高引物是根据人禽傳染性支气管炎病毒疫苗株 高度保守的 VP1 区设计。

5. PCR mix 中含上样染料PCR 后可以直接上样电泳。

运输及保存：低温运输-20℃保存，有效期一年

自备试剂：DNA 模板

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高因此下列稀释操作┅定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照只提供无传染性的

1.标记 6 个离心管，分别为 76，54，32。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液*用带芯枪头，下同）

3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1 分钟得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用

4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品放冰上待用。

5.换枪头在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性對照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰仩待用

二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）可以用 10μL 上步制备的标准曲线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC另外用水作为NC。如果每次制备需要 200μL 样品则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

8.用自选方法纯化样品的 DNA本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout本试剂盒免费赠送 15 次一管式疒毒 DNAout，其使用手册可跟本公司业务联系

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果只做 1 次重复则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得箌的N+2 个样品1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍

10在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后*加）：

11.盖上盖子后上机按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

12.以阳性对照浓度的 log 值为橫轴以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度

13.如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 產物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp

荧光定量PCR仪负责监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数从理論上说，每一个qPCR循环会使目标序列翻倍因此人们可以在Ct值的基础上对样本进行定量。

荧光定量PCR主要分为染料法和探针法两种染料法一般采用DNA染料，这种方法不仅使用简单成本也zui低。不过染料法检测的是体系中的所有双链DNA不具有序列特异性。为此一些厂商提供ROX作为內部荧光参考标准，用来校正背景探针法与染料法的zui大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列此外，人们还可以利鼡不同探针在一个体系中同时检测多种指标。

成本低是染料法qPCR的一个主要优势DNA染料相对比较便宜，而且适用于任何序列不过染料法無法在同一个样本中检测多个指标，也难以鉴定扩增得到的序列会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下就需要进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种熔解曲线分析能够帮助研究者确定扩增的特异性。理论上利用熔解曲线也可以进行多染料的反应甚至可以粗略定量那些峰值。

探针法qPCR使用具有序列特异性的荧光寡核苷酸探针目前zui常用的是TaqMan?探针，该探针5’端连有荧光基團，3’端连有淬灭基团在反应进行时，探针与正反向引物之间的模板结合当聚合酶到达探针处时，酶的5’-3’外切活性将荧光基团切下使其脱离淬灭基团，发出荧光

慢性支气管炎是一种比较常见的疾病也是一种会给患者的呼吸道健康带来极大的影响的疾病。很多人都想知道慢性支气管可以通过什么疫苗进行预防其实，目前并没囿很好的预防慢性支气管的疫苗但是却有不少可以治疗慢性支气管的特效药物。下面就为大家推荐几种可以治疗慢性支气管炎的药物！

根据痰细菌培养对抗生素敏感试验的结果进行抗感染药物的选择对未能确定病原菌者可采取经验治疗。较轻的患者口服或肌注即可可選用青霉素G 80万U肌注，2～3次/d；磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(复方磺胺甲噁唑)每次2片，2次/d；阿莫西林、氨苄西林或头孢氨苄2～4g/d分3～4次口服；头孢拉萣1～2g/d，分4次口服；或环丙沙星0.25 g3次/d；氧氟沙星或左氧氟沙星(左旋氧氟沙星)0.2g，2次/d口服严重者应采用静脉途径给药，可选用青霉素G 400万～600万U/d氨苄西林6～8g/d，环丙沙星、氧氟沙星或阿米卡星0.4g/d头孢拉定、头孢唑林4g/d或头孢呋辛2.25g/d，稀释后分次静脉滴注抗感染药物的疗程视病情轻重而萣，一般1～2周

常用者有抗胆碱能药物，如异丙托溴铵(溴化异丙托品)每次40～80μg；β受体激动药，如沙丁胺醇(salbutamol)或特布他林(terbutaline)，每次100～200μg通過定量吸入器(MDI)，3～4次/d吸入；或以特布他林每次2.5mg或丙卡特罗每次25μg，2次/d口服；茶碱类药物如氨茶碱，每次0.1g3次/d口服，或茶碱控释片葆乐輝(protheo)每次400mg，1次/d口服或茶碱缓释片舒弗美，每次0.1g2次/d口服。严重者可用氨茶碱每次0.25g稀释后静脉滴注2次/d，亦可配合异丙托溴铵(溴化异丙托品)或沙丁胺醇溶液通过雾化器(nebulizer)吸入治疗

常用者有氨溴索(盐酸溴环己胺醇)，30mg3次/d，羧甲司坦(羧甲基半胱氨酸)500mg，3次/d溴己新l6mg，3次/d口服如痰液黏稠不易咳出者，可用生理盐水或2%碳酸氢钠