琼脂扩散试验
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亦称“免疫扩散试验”。测定抗原、抗体的一种方法。利用抗原、抗体反应原理,让已知抗原或抗...
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这是指在含有电解质的琼脂中进行沉淀试验,以测定抗原性质的一种方法。常用的是玻片法,即先在玻片上辅以琼脂,待凝固后,用直径的穿孔器按一定距离在琼脂上打小孔,在孔中分别加入抗原和抗体,使它们对向扩散,相应的抗原、抗体以最适的比例相遇时,即形成白色沉淀线,如抗原、抗体不相应,则形不成沉淀线。根据沉淀线的形成与否及沉淀线的数量等,可分析抗原的成分,比较抗原的异同,抗原的纯度,测定抗原、抗体的相对含量等。这个技术称为“双...(本文共367字)
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系沉淀反应的一种试验方法。于3mm左右厚的琼脂平板上放置几个无底金属环,或用玻片代替平皿,将琼脂加在玻片上,在琼脂板上打孔,将免疫血清和抗原分别加入金属环或孔中,然后将平皿或玻片放在带有湿纱布或棉花的大平皿或有盖的平盘中,保持一定湿度,放室温或37℃,经一定时间后,观察结果。由于相应的抗原抗体分别呈放射状向四周扩散,相互接触,2者在比例最合适外形成白色沉淀线。当在试验物中含有1个以上的抗原抗体时,由于不同成分抗原抗...(本文共248字)
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Jorbb和 Chubb二氏早在 196 2年就报道用鸡抗ILT高免血清检查 IL T病毒抗原的双向琼脂扩散试验。此法虽然简单易行 ,但在目前缺少 SPF鸡群制备高免血清的条件下 ,鸡源高免血清中可能存在其它抗体的干扰 ,在现有条件下建立异源动物制备诊断血清是排除其他病原抗体干扰的一种途径。用家兔制备 IL T双向琼扩诊断血清的方法已有报道 ,但有关文献中还未见较为理想的血清制备规程。我们经试验摸索出了一套较为理想的血清制备规程 ,并用制备的高免血清作双向琼脂扩散试验检查 IL T患鸡的病毒抗原效果满意。1　材料与方法1.1　病毒来源IL T强毒株由中国兽医药品监察所提供。鸡新城疫 (ND)强毒株系分离鉴定的毒株。1.2　鸡胚由健康鸡蛋孵化的鸡胚。1.3　试验鸡本地鸡场孵化饲养的 4月龄以上的健康鸡。1.4　试验兔由兰州生物制品研究所提供的 6月龄体重 3kg左右健康白兔。1.5　病毒培养用鸡胚复壮两代以上的湿毒作 10倍稀释。...
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琼脂扩散试验通常是指双向双扩散试验,试验原理是通过抗原、抗体在琼脂凝胶中由近及远不断自由扩散形成浓度梯度,在适当比例处相遇形成沉淀线,并由此来检测抗体的效价或抗原鉴定和区分的一种技术。琼脂扩散试验在临床中常被用于多种疾病诊断和抗体效价检测,如传染性法氏囊病、新城疫、禽流感、传染性支气管炎、马立克氏病、鸭病毒性肝炎等。由于琼脂扩散试验操作简单、所用的仪器少、结果易判断,因此被越来越多的科研工作者所采用,成为临床中疾病诊断、抗体检测应用最广的实验方法之一。但是琼脂扩散试验容易受到多种因素的干扰而导致试验特异性、敏感性、精确性等受到影响,甚至试验结果无法判读的现象。本文就琼脂扩散试验的影响因素(如抗原、抗体、琼脂板、反应条件等)以及各因素实验结果的影响进行逐一分析,望能给临床工作者提供帮助。1抗原、抗体因素1.1抗原、抗体的水溶解性琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原与抗体在琼脂凝胶网格中的水中自由扩散,相互结合形成的沉淀线来判断结果的。该...
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附红细胞体病(eperythrozoonsis,EH)是由附红细胞体引起动物出现高热、贫血、黄疸等主要临床症状的一类传染病。由于该病原体在动物体内多呈隐性感染,临床发病也不显性,因此以前没有引起人们的足够重视,但是至2001年以来,各地相继发生了家畜附红细胞体病大规模流行,给养殖业带来了巨大损失,并严重威胁着人类的身心健康。由于本病的免疫学方面研究较少,本研究的目的拟通过建立一种快速、简便的诊断附红细胞体的免疫学方法,为临床诊断本病提供依据。同时也通过本试验来检测猪附红细胞体免疫家兔后产生免疫应答的能力。1材料和方法1.1高免血清兔瘟、大肠杆菌和兔疥螨高免血清,由本实验室保存备用。1.2附红细胞体分离纯化无菌采集自然感染附红细胞体的猪血液, r/m in离心去上清液,收集的红细胞用PBS液洗涤2~3次,然后加入2倍量PBS液,于56℃恒温水浴锅中加热2 m in, r/m in离心,收集上层液...
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琼脂扩散法检测卵黄抗体效价影响因素的分析,
    
摘要：抗体琼脂扩散试验是当前卵黄抗体效价测定的主要方法之一，该方法简洁、快速非常适合于临床中应用，但是该方法轻易受到多种因素的影响而导致试验结果判定的不正确。本文就琼脂扩散试验中抗原抗体本身性质、反应特点、最适比例、可逆性、总量以及琼脂、水等所有能影响试验结果的因素进行了逐一分析。关键词：卵黄抗体；琼脂扩散试验；影响因素3卵黄琼脂扩散试验是通过抗原、卵黄抗体在琼脂凝胶中由近及远不断自由扩散形成浓度梯度，在适当比例处相遇形成沉淀线，并由此来判定抗体的效价的一种技术。琼脂扩散试验主要是用于可溶性胶原性抗原及其所对应抗体水平的检测，兽医临床中主要用于法氏囊、新城疫等抗体效价的检测。由于卵黄内抗体效价与鸡体内的效价几乎相同，所以我们通过琼脂扩散试验测定卵黄抗体的效价，可以在不刺激鸡体的情况下就可知道产蛋鸡的抗体水平和免疫效果。卵黄琼脂扩散试验操纵简单、所用的仪器少、结果易判定，因此被越来越多的养殖户、兽医工作者所采用，成为他们制定产蛋鸡免疫程序的主要依据。但是琼脂扩散试验的结果轻易受到抗原抗体因素、琼脂、反应条件以及其它因素的影响而导致抗体效价测定不正确。为了能使临床中广大实验操纵职员对琼脂扩散试验能有一个更深刻的熟悉，现将以上各种影响因素分析如下。1抗原抗体因素-lP& 琼脂扩散试验受抗原抗体本身性质、抗原抗体反应特点及其它因素的直接影响。1.1抗原抗体的性质[1.1.1抗体性质：抗体的特异性与亲和力是影响琼脂扩散试验的主要因素。抗体的特异性是由抗体可变区的原子空间排列以及它们的电子结构和极化特性决定的[1]，亲和力是复杂抗原与相应抗体之间的总的结合能力[2]。抗体的亲和力很低时不易用琼脂扩散试验测定。一般情况下，在免疫初期，卵黄抗体的特异性较高但亲和力不高，后期，卵黄抗体的亲和力高但相应的特异性变低。
1.1.2抗原性质：抗原的种类、抗原决定簇的数目和理化性质等因素都能影响琼脂扩散试验的结果。琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原与抗体在琼脂凝胶网格中的水中自有扩散，相互结合形成的沉淀线来判定结果的。这样就要求抗原与抗体必须都是可溶性的，由于一些颗粒性的抗原如细菌、红细胞等是不溶的，这样的抗原相对应的卵黄抗体效价就不能用琼脂扩散试验来测定。在琼脂扩散试验中要求抗原是多价的（抗原决定簇≥2），单价抗原不能形成抗原抗体复合物，因此不能产生可见反应。抗原的分子量、PH值等理化因素也直接影响到实验的结果。1.2抗原抗体的反应特征 &抗原抗体反应特征影响琼脂扩散试验结果的因素有:抗原抗体最适比、抗原抗体反应的可逆性、抗原抗体的量。r
1.2.1抗原抗体的最适比[3]：抗原抗体的反应虽决定于两者的化学构型的相应性，但不同于一般的化学反应，其结合比例不完全符合化学反应的质量作用定律，由于抗原抗体的结合是一种多价相互作用的结合。抗原根据分子大小的不同，结合位点变化很大，由10－50不等，有的甚至达到200个；卵黄中的抗体成份主要是IgG，有两个结合位点，卵黄抗体除了常见的鸡传染性法氏囊炎抗体外，还有鸭病毒性肝炎、猪瘟[4]等高免卵黄抗体，这些抗体的效价都可以用琼脂扩散试验来测定。当抗原抗体的浓度比例适宜时，抗原抗体结合后尚未达到饱和的位点可与其它游离的抗原抗体继续结合，逐渐形成越来越大的复合物。最后在抗原与抗体孔之间形成肉眼可见的沉淀线。此时反应最快、最明显。但当两者的量不适合时，少的一方在聚合初期就达到饱和，沉淀线变得不清楚甚至没有沉淀线，而且沉淀线偏移，向量少的一方移动。u1.2.2抗原抗体反应的可逆性[3]：抗原抗体之间的结合是依靠分子间的近间隔力：氢键、范德华力、静电力、疏水作用力。两者的间隔越近，结合的位点越多，形成的近间隔力也越大，结合的也越牢固。这些作用力在生理状态下最大。由于抗原抗体反应是分子表面的非分子结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离的抗原抗体保持原来的生物活性，可与其它的抗原抗体再一次结合，在整个反应体系中形成动态平衡，平衡式为：Ag+AbPAgAb。这种平衡易受到温度、PH等物理的、化学的因素的影响而改变。当温度大于60℃，PH值降到3以下时，由于同离子效应等因素，使抗原抗体蛋白质的近间隔力遭到破坏，结构发生改变，导致抗原抗体复合物重新解离。
1.2.3抗原抗体的总量：琼脂扩散试验中所形成的沉淀线的粗细、清楚度与抗原抗体的量成正比例关系。由于我们这篇文章主要是讨论影响卵黄抗体效价测定的因素，所以主要考虑影响抗原的外界因素。抗原反复冻溶以及长期把它放在室温下都能使大量的抗原破裂失往活性。所以在保存与运输抗原时应放在冷冻条件下进行。/1.3抗原抗体的纯度：抗原与其对应的抗体的反应属于特异性反应。但是假如两者含有过多与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质，往往抑制抗原抗体的特异性反应，而出现一些非特异性反应。
2琼脂因素WA琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到琼脂的成份、琼脂板厚度、琼脂的浓度、实验用水质量、PH值、电解质浓度、抗原抗体孔间间隔及琼脂水分的影响。{2.1琼脂的成份：影响琼脂扩散试验结果的琼脂成份因素主要是不溶性杂质。一些大的不溶性杂质能直接堵塞琼脂的网格，这样的杂质过多会影响抗原抗体的扩散，为了避免这些杂质的影响，应在琼脂粉融化后用脱脂棉或纱布过滤，或者选择高质量的琼脂粉加工琼扩板。S0f2.2琼脂板的厚度：琼脂板的厚度应为3mm左右，由于由于重力作用，加进孔中的抗原抗体会发生沉淀，导致上下层的浓度形成差，浓度大的向琼脂网格中扩散的速度要比浓度小的快，同时又由于抗原抗体的质量与体积的差异，所以两者形成的浓度差是不同的，扩散速度的差异也不同，假如琼脂板很厚，同一孔上下层扩散速度差异及抗原抗体之间扩散速度的差异都很大，致使抗原抗体孔之间形成的沉淀线上下层之间就不在同一平面上，影响琼脂扩散试验的结果的观察；相反假如琼脂板太薄，所加的抗原抗体量很小，沉淀线不清楚甚至不出现沉淀线。
2.3琼脂的浓度：琼脂凝胶网格答应通过物质的最大分子量与琼脂浓度成反比（见表1），卵黄抗体IgG的分子量为1.8&#215;105[5],1％－1.5％的琼脂溶液网格能答应尽大多数大分子抗原自由扩散，大于这个浓度范围的琼脂网格太小不利于大分子抗原如鸡马立克氏病病毒（分子量为1.03&#215;108）、鸡传染性喉气管炎病毒[6]的扩散，浓度太小琼脂骨架太少不利于抗原抗体复合物的沉淀，从而影响琼脂扩散试验的结果。,\表1琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据[7]h型号 &Bio-Gei A琼脂糖含量%分级范围 （球蛋白）~rFA-0.5m101&#215;104～5&#215;105XNgA-1.5m81&#215;104～1.5&#215;106);A-5m61&#215;104～5&#215;106:fFpjA-15m44&#215;104～1.5&#215;1079yDR^A-50m21&#215;105～5&#215;107_A-150m11&#215;106～1.5&#215;108]8 J2.4实验用水的质量：琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到实验用水的影响。假如实验用水中含大量重金属离子如铅、汞、铜等，会使蛋白质成份的抗原抗体变性失往活性，不能再发生特异性反应，影响琼脂扩散试验的结果。v02.5 PH值：抗原抗体大部分是蛋白质，蛋白质在一定的PH处所带的净电荷数为零，此时的PH值为蛋白质的等电点，大部分蛋白质的等电点在PH5-5.5之间，在等电点处，蛋白质分子之间静电斥力减少，趋于凝集状态而发生沉淀，所以蛋白质在等电点处的溶解度最低。当琼脂的PH在抗原抗体等电点处时，抗原抗体会发生非特异性的沉淀，影响琼脂扩散试验的实验结果。一般琼脂扩散试验的PH为6－8（比等电点稍高）[2]。当PH小于3时，往往使抗原抗体结合物变性或再次解离，如IgG在PH4.0－11.0稳定，马立克氏病毒在PH3或PH11处理10分钟失活[6]。见本文1.1.2。_2[s82.6电解质的浓度：电解质的浓度对琼脂扩散试验的结果影响也很大。抗原抗体具有胶体性质，含有氨基、羧基、肽链等极性基团，与水相互结合，形成水化层，由于蛋白质带有相同的电荷，所以胶体所带电荷相同，互相排斥，在水中稳定存在，抗原抗体带有相反的极性，等两者结合后，表面的电荷减少或消失，水化层也减弱，由亲水型变为疏水型，此时如有适当浓度的电解质，能进一步降低抗原抗体表面的电荷，促进他们沉淀，最常用的电解质为氯化钠，哺乳动物血清学反应浓度为0.15mol，即生理盐水，禽类8％[8]。但过高浓度的电解质反而不利于抗原抗体沉淀物的形成，有两个原因：○1过高浓度的电解质阻止蛋白质与水分子的相互作用，破坏蛋白质表面的水化层，产生盐析效应，使抗原抗体发生非特异性的沉淀。○2过高浓度的电解质浓度（大于或即是15％）可使抗原抗体结合物离解。见本文1.1.2。92(K<2.7孔间间隔：抗原抗体的孔间间隔也能影响琼脂扩散试验的结果。当两者之间的孔距为3mm时，抗原抗体既能形成合适的浓度梯度又能充分结合。当两者的孔间间隔过大时，固然能形成合适的浓度梯度，但由于抗原抗体量太少却不能充分结合，相反孔距太小，固然结合的量很大却不能形成合适的浓度梯度，都能影响琼脂扩散试验的结果。I2.8琼脂水分：琼脂凝胶网格内含有大量水分，假如琼脂板储存时间太长或储存环境太干燥又没有放在密闭环境中，水分就会大量的挥发，直接影响抗原抗体扩散的效果。6/k}3抗原抗体反应条件kz7y& 一些培养条件如反应温度、反应湿度、反应时间也是影响琼脂扩散试验结果的重要因素。‘3.1反应温度 &影响琼脂扩散试验结果的温度因素包括:反应温度的高低与反应温度波动情况。z3.1.1反应温度的高低：抗原抗体的反应速度、结合程度与反应温度高低有密切关系。温度高，分子运动加快，增加抗原抗体碰撞几率，反应会加快，但当温度超过56℃时反应速度反而变慢，温度再高，抗原抗体复合物往往会重新解离，甚至会被破坏。例如卵黄抗体在≥65℃情况下性质就会变得不稳定，鸡马立克氏病毒从感染鸡皮肤中制备的脱离细胞制剂在56℃处理30分钟或在60℃处理10分钟都能失活，传染性法氏囊炎病毒在70℃处理30分钟失活[6]。反应温度低时，反应速度变慢，但抗原抗体结合完全，沉淀量增多，结果清楚。但温度过低，反应无法进行，也不会出现结果。最适的反应温度为37℃[8]。o=bCX3.1.2反应温度的波动情况:琼脂扩散试验的培养温度应恒定，假如波动太大，会使抗原抗体在扩散时形成不连续的浓度梯度，影响两者产生最适比，终极影响到实验结果。Eb^23.2空气湿度：琼脂扩散试验是抗原抗体在琼脂网格中的水中扩散时形成的结果，假如空气中湿度太低，琼脂中的水分很轻易蒸发，使琼脂网格中的水分减少，不利于抗原抗体的自由扩散，同时加到琼脂孔中的抗原抗体的水分也很轻易蒸发，使卵黄中的抗体及抗体被固定在孔中不轻易向琼脂凝胶中扩散。所以在培养时，往往颠倒平皿，然后放在一个有湿棉纱布的有盖搪瓷盘中，以防水分蒸发。SnDj}3.3反应时间：抗原抗体在琼脂中的扩散需要一定时间。假如反应时间太短，使抗原抗体没有完全扩散以致结合的不充分或结合后还没有达到沉淀的程度，导致本应形成的沉淀线没有出现；时间太长，在室温条件小，大量抗原抗体会失往生物活性，已经形成的沉淀带发生解离消失而出现假像。AU6?#S4其他因素`?68K-&抗原抗体加的多少、打孔后琼脂底部融封效果都能影响琼脂扩散试验的结果，本文1.3所述。当抗原抗体的量加的多时，所产生的沉淀线粗，为了减小各个实验的相对误差，加样时，都应加到满而不溢程度。此外，打孔后琼脂板底部松动，假如不加热封好，在实验过程中，抗原抗体就不通过琼脂网格扩散，而是直接在底部流出，不会产生沉淀线。Wr~5E&总之，琼脂扩散试验能有效的指导养殖户、兽医工作者制定公道的免疫程序，但是由于受到以上诸多因素的影响，因此，为了得出真实的实验结果，操纵者应本着科学、严谨的态度进行操纵，以克服不良因素的影响。;
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常用琼脂扩散试验的琼脂浓度为多少？
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出门在外也不愁影响琼脂扩散试验的因素--《黑龙江畜牧兽医》2001年05期
影响琼脂扩散试验的因素
【摘要】：
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【分类号】：S852.4【正文快照】：
目前 ,我国大多数的生物制品厂没有建ＳＰＦ鸡场。因此 ,生产疫苗时 ,多数厂家还是使用不免疫鸡蛋。在使用不免疫鸡蛋生产疫苗以前 ,一定要对该蛋进行监测 ,以免影响所生产疫苗的效价。在监测时 ,我们将卵黄中的抗价提取出来后 ,再根据适当的免疫技术进行监测 ,例如 :ＮＤ采
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京公网安备74号关于抑菌实验（纸片琼脂扩散法）的标准问题 - 微生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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关于抑菌实验（纸片琼脂扩散法）的标准问题
请问抑菌实验（纸片琼脂扩散法）有标准的吗？我现在想做原料的抑菌试验，求出来的MIC有什么界定标准啊？我查阅了资料，都是说药剂量给药途径而定的，分为“敏感”、“中介”、“耐药”等，但是我那个不是药来的，是饲料添加剂，请问也能用上这个吗？还有做这个抑菌试验有菌种要求吗？就是CMCC和ATCC~请各路英雄出手相助啊，万分感激！:hand::hand::hand:
沉下去了！提一下！ 我也做过纸片法的，不过是根据菌圈大小大致判断抑菌活性强弱。6mm滤纸片，直径d<=6,-,d<=10,+,d<=16,++,d26,++++,一般我们认为++以上就是具有抑菌活性。 : Originally posted by wpf1230 at
我也做过纸片法的，不过是根据菌圈大小大致判断抑菌活性强弱。6mm滤纸片，直径d&=6,-,d&=10,+,d&=16,++,d&=16+++,d&26,++++,一般我们认为++以上就是具有抑菌活性。 不是具有抑菌圈都算有抑菌作用吗？ 我做过滤纸片扩散法抑菌，牛津杯抑菌，这两种方法的敏感 中介 耐药&&楼上已说。这两种方法中滤纸片失败率很高主要是抑菌圈不圆，滤纸片含药量不均一，建议用牛津杯法。MIC是最低杀局浓度&&是一个数值，可以用稀释到平板法，做药物的梯度浓度。菌种基本上没有要求。 : Originally posted by zhaocunyang at
我做过滤纸片扩散法抑菌，牛津杯抑菌，这两种方法的敏感 中介 耐药&&楼上已说。这两种方法中滤纸片失败率很高主要是抑菌圈不圆，滤纸片含药量不均一，建议用牛津杯法。MIC是最低杀局浓度&&是一个数值，可以用稀释到 ... 谢谢你的回复！但是我想再清楚一点怎么区分敏感、中介、耐药等等级！~稀释到平板法具体怎么理解？ : Originally posted by chouzhou at
不是具有抑菌圈都算有抑菌作用吗？... 我也觉得是有大于6mm滤纸的抑菌圈就有效果，有抑菌活性。
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