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宫颈癌患者外周血、肿瘤组织中Th17细胞的分布、表形及Th17Treg细胞失衡研究.pdf62页
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硕士学位论文
宫颈癌患者外周血、肿瘤组织中Thl7细胞的
分布、表型及Thl7／Treg细胞失衡的研究
The ofDistributionand
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采用流式细胞仪检测艾滋病病毒1型膜蛋白小鼠免疫后IFN-γ的表达
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Detection of IFN-& Expression of Mice by Flow Cytometry Primed with DNA and Boosted with Recombinant Vaccinia virus Expressing Gp120 gene of Human Immunodeficiency Virus 吴岚　 冯毅　 张旭东　 刘颖　 唐海丽　 李红梅　 姚均　 冯鑫　 邵一鸣　 摘　要：目的通过流式细胞技术检测艾滋病病毒1型(HIV-1)Gp120膜蛋白免疫小鼠后的IFN-&的表达.方法构建表达HIV-1gp120基因的复制型重组痘苗病毒.与DNA疫苗联合免疫小鼠,用流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞中IFN-&的表达.结果获得表达中国HIV-1流行株gp120基因的重组痘苗病毒rVVgp120、rWM304,能正确表达Gp120蛋白,与DNA疫苗p120-VRC、pM304-VRC联合免疫小鼠后,用流式细胞仪检测到小鼠脾淋巴细胞能特异性的表达IFN-&.结论用流式细胞检测技术成功检测到免疫小鼠的脾淋巴细胞特异性的表达IFN-&,用此方法可方便快捷地检测小鼠的细胞免疫效果. 关键词：艾滋病病毒1型疫苗 细胞因子 流式细胞仪 基金项目：本研究受基础研究重大项目前期研究专项(编号:2001CCA00600)课题资助. 作者单位：吴岚（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　冯毅（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　张旭东（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　刘颖（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　唐海丽（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　李红梅（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 　　　　　姚均（北京地坛医院）　 　　　　　冯鑫（北京地坛医院）　 　　　　　邵一鸣（中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒与免疫研究室,北京,100050）　 参考文献： ［1］UNAIDS. AIDS epidemic update: December 2001. www. unaids. org/epidemic update. ［2］International AIDS Vaccine Initiative. Scientific Blueprint for AIDS Vaccine Development. New York, 1998. ［3］Duradi D, et al. Cross-reactions between the cytotoxic T lymphocyte responses of human immunodeficiency virus-infected African and European patients. J Virol,
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- 4) :397 - 405. ［5］Chakrabarti BK, Kong WP, Wu BY, et al. Modifications of the Human Immunodeficiency Virus Envelope Glycoprotein Enhance Immunogenicity for Genetic Immunization. J Virol,
): 5 357 - 5368. ［6］Mascola JR, Louder MK, Winter C, et al. Human immunodeficiency virus type 1 neutralization measured by flow cytometric quantitation of single-round infection of primary human T cells. J Virol, ):4 810 -4821
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【关键词】 肺炎 获得性免疫缺陷综合征 诊断 误诊
[摘要] 经查阅古代文献并结合现代研究结果，著者发现艾滋病相关瘙痒性丘疹性皮疹（HIV...组织细胞做流式及western&blot&价格
& 本实验室提供流式细胞检测及western blot
技术服务，流式和western blot 技术只限动物或临床类样本（组织），以下是常做流式及western blot
的一些常规操作方法及费用：
流式细胞检测方法：
一、&&&&&&&&&&&
细胞表面标记：
细胞表面分子的流式检测，利用相应的流式抗体直接标记单个细胞群体。根据抗体的类型（荧光标记一抗/无标记一抗）分为直接标记和间接标记。表面标记的细胞无需固定，只需处理为单个细胞即可。需要注意的是细胞消化过程中，所使用的酶对表面分子的影响。有的表面分子会受到消化酶的影响，检测之前需要做预实验检测。另外就是非特异吸附的去除，一般用1%BSA或相应的血清封闭即可。
二、&&&&&&&&&&&
细胞凋亡检测
细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（programmed cell death
,PCD），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。在形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折、卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前向角散射光与细胞大小有关，而侧向角散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
流式检测凋亡的方法：
1、早早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3），Caspases-3
又称半胱氨酸蛋白酶3，是细胞凋亡信号传导通路中的ICE 蛋白酶家族的重在细胞凋亡发生的早期被激活。
2、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：Annexin V-FITC/PI
法：在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外层表面。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA
可被PI 着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI
不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin
V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V
3、晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：TUNEL 法。细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链DNA
会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列3'-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal
deoxynucleotidyl tranferase,TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP 连接到DNA 的3'-OH
末端，用流式细胞术检测。近来的研究证实，Br-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。未凋亡的细胞因为没有暴露的3’未端，所以不会被检测到荧光。
4、晚晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法。细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA
广泛断裂。目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA
含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，或者用沉淀固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的DNA
不能完全封闭于细胞中，在细胞洗染过程中DNA 碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞DNA含量减少；加之由于DNA
的降解，与荧光染料的结合减少，故细胞DNA 荧光强度降低；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA
含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰。
5、细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测：
（1）Fas/FasL(Fas 配体)：Fas 抗原与Fas
配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径，它们的异常与免疫相关疾病、肿瘤、移植排斥、病毒性肝炎、肾小球肾炎等多种疾病高度相关。
（2）p53：p53 是细胞周期中的‘检查点’分子，其控制着细胞在DNA
损伤无法修复时启动细胞的‘自杀’进程。p53 的缺失或突变已被证明是多种肿瘤（如：乳腺癌、胃肠道肿瘤
及肝细胞癌等）发生的重要原因。其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标。
（3）Bcl-2：Bcl-2 是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切关系。
三、&&&&&&&&&&&
细胞增殖检测
细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。细胞增殖的流式分析方法大体分两类：
1、检测细胞增殖抗原标志物为基础的分析方法，Cyclins/DNA双参数法、Ki67/DNA双参数法、PCNA/DNA双参数法和BrdU/DNA双参数法等。
BrdU/DNA双参数法：BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类类似物，在DNA合成过程中能够掺入DNA链中，
细胞利用荧光标记的抗BrdU单克隆抗体和DNA荧光染料通过双参数进行流式分析。
Ki-67/DNA双参数法：Ki-67抗原是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原，与细胞DNA半保留复制相偶联，在有丝分裂的G1、G2、M、S期都表达，其中G2、M其表达最强，G0期不表达。流式检测中有多种标记方法，如Ki-67/细胞表面抗原染色法、Ki-67/DNA双参数色法、Ki-67/PCNA双参数色法。
PCNA/DNA双参数法：PCNA是一种分子量为36kD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。其功能是将DNA单链连接成双链。在G0/G1期无明显表达，在G1晚期表达增加，S期达到高峰，G2/M期明显下降，其变化同DNA合成一致。
2、以检测细胞分裂情况为基础的分析方法，如CFSE单参数/多参数法、PKH67或PKH26单参数/多参数法。
CFDA-SE单参数/多参数法：CFDA-SE是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带负电荷的CFSE，CFSE可自发不可逆的通过赖氨酸侧链或者其他胺偶联到细胞膜蛋白质上。在细胞分裂的时候CFSE标记物可平均分配到两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞以荧光强度的2倍递减为特征。
流式收费价格（标准）：
上机费：50元
&以下为代为标记收费标准：
&胞膜标记：30元/样
&胞内核内标记（如CD4IL-17,CD8IFNIL-2) ：100元/样
&Treg：55元/样
&细胞凋亡：25元/样
&试剂费用: 10元/管
&细胞周期：25元/样
&试剂费用：10元/管
&100管以内不优惠，100-500管8.5折，500管以上8折
&以上收费标准不包含抗体等试剂费用。
western blot 操作步骤：
收集蛋白样品
1、裂解细胞或组织，将其收集到EP管中，加入适量的裂解液，12000rpm/15min。将上清移至新的EP管中，加入LoadingBuffer稀释，混匀。（以上操作均在冰盒内进行）
2、沸水里加热5-10min，以充分变性蛋白。取出后直接放入冰盒内或者-20℃保存,如果需要长期保存，放于-80℃即可。
测蛋白浓度
比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。根据试剂盒调整蛋白浓度，使内参一致。
& 1、 将玻璃板洗净后晾干按要求装配好垂直电泳板，检查电泳板是否漏水。
& 2、 配制所需%浓度凝胶的毫升数。
&配制分离胶时，加入TEMED后，立即混匀，用枪从玻璃板的一端缓缓加入，待胶面升到绿带中间线高度，再加入异丙醇封压液面至排出气泡。待30min左右，看到异丙醇与分离胶之间有一条明显的界限，说明胶已凝固。然后倒去异丙醇用水轻轻冲洗，再沥干。
配制浓缩胶时，加入TEMED后，立即摇匀开始灌胶，直到液体接近溢出时为止。
立即插入适当的梳子，注意防止梳齿下产生气泡。
等浓缩胶室温凝固一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向内。）槽内倒入1X缓冲液。
& 4、 轻轻向上取出梳子，开始加样。
电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，我们通常设置在60V，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳，通常设置在100V左右。通常电泳时可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
1、将胶轻轻从玻璃板中取出，切取所需条带的分离胶后再剪差不多大小的滤纸，把滤纸浸泡在倒有甲醇的玻璃皿内。
2、把转膜用的夹子、滤纸、分离胶都泡在转膜液里，然后依次把滤纸、分离胶轻轻移到转膜的夹子上使重叠覆盖并排出气泡后，把夹子合上。
& 3、将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。一般设置电流200mA，转膜时间90min。
&&转膜完后，把膜泡在预先准备好的脱脂牛奶里，室温摇床晃动5min至过夜都可。&
1、用TBST浸泡一下后倒去，加入稀释好的一抗，过夜4℃摇床，慢慢摇晃。
2、次日回收一抗，用TBST冲洗一次后倒去，再加适量的TBST摇床20min/3次，快摇。
& 3、加入稀释好的二抗，过夜4℃摇床，慢慢摇晃。
4、次日回收二抗，用TBST冲洗一次后倒去，再加适量的TBST摇床20min/3次，快摇。
用显影液试剂盒（A液：B液=1：1配制），曝光即可检测出蛋白分子量。
western blot 收费（价格）：
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出门在外也不愁人体正常组织的流式细胞术DNA含量参数检测--《肿瘤学杂志》2002年01期
人体正常组织的流式细胞术DNA含量参数检测
【摘要】：[目的]建立人体各种正常组织的流式细胞术细胞动力学参数。[方法]用流式细胞术检测337例恶性肿瘤或良性疾病患者某些正常组织的DNA指数(DI)、DNA倍体类型、细胞凋亡水平和增殖活性。[结果]在337例患者的正常组织中DI值为1.00±0.00,DNA倍体为2倍体 ,其细胞凋亡水平为2.67%±2.50% ,S期细胞比率为5.00%±4.59 %。在不同类组织中 ,某些组织的SPF检出率有显著性差异(P0.05或P0.01)。恶性肿瘤患者正常组织的Apo和SPF均显著高于良性疾病患者的正常组织(P0.01和P0.05)。[结论]在肿瘤研究中选择正常对照组织时 ,恶性肿瘤患者的“正常”组织未必能
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R730.4【正文快照】：
在采用流式细胞术对恶性肿瘤细胞生物学特性进行研究时 ,一般很难找到正常人的组织作为肿瘤的同型对照组织。在过去发表的文章中 ,有的作者利用癌旁组织作为参考对照组织［１］,有的采用正常人外周血淋巴细胞来代替 ［２］。这些组织细胞往往不能真正反映肿瘤同源正常组织的
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