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&&&二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响
二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响
Effects of diazoxide pretreatment on apoptosis in rat myocardial microvascular endothelial cells exposed to hypoxia-reoxygenation
目的 探讨二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响.方法培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板(100 μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=12),正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)和二氮嗪预先给药+5-羟葵酸组(DZ+5-HD组)均进行缺氧2 h复氧2 h,DZ组和DZ+5-HD组在缺氧前2 h分别加入100 μmol/L二氮嗪和100 μmol/L二氮嗪+100 μmol/L线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸.于复氧2 h时测定细胞活力和凋亡率.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P＜0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P＜0.05或0.01);5-羟葵酸可抑制二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药可抑制大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,从而减轻缺氧复氧损伤,其机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关.
摘要： 目的 探讨二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响.方法培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板(100 μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=12),正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)和二氮嗪预先给药+5-羟葵酸组...&&
Abstract：
Objective To investigate the effects of diazoxide pretreatment on apoptosis in rat myocardial microvascular endothelial cells exposed to hypoxia-reoxygenation (H/R) . Methods The SD rat myocardial microvascular endothelial cells were cultured. The cells were seeded in 96-well plates (100 μl/hole) or in 6 cm diameter dishes (2 ml/dish) with the density of 1×106/ml and randomly divided into 4 groups ( n = 12 each) : normal con trol group (group C), H/R group, diazoxide pretreatment group (group DZ) and diazoxide pretreatment + 5-hydroxydecanoate (5-HD, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel blocker) group (group DZ + 5-HD) .The cells were exposed to 2 h hypoxia followed by 2 h reoxygenation. Diazoxide 100 μmol/L and diazoxide 100 μmol/L + 5-HD 100 μmol/L were added to the culture medium 2 h before hypoxia in groups DZ and DZ + 5-HD respectively. The cell viability and apoptotic rate were detected at the end of reoxygenation. Results Compared with group C, the cell viability was significantly decreased, while the apoptotic rate increased in group H/R ( P ＜ 0.01) . Compared with group H/R, the cell viability was significantly increased, while the apoptotic rate decreased in group DZ (P ＜ 0.05 or 0.01) . 5-HD could inhibit diazoxide pretreatment-induced changes mentioned above ( P ＜ 0.05 or 0.01). Conclusion Diazoxide pretreatment can reduce H/R injury through inhibiting apoptosis in rat myocardial microvascular endothelial cells, and the mechanism is related to the activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels.
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为照顾一些还没有入门的朋友，写的十分简单易懂，老少皆宜。学生才浅，贻笑大方。
第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。1 U( M- @8 ^: u8 ]- j5 o
心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。& s" M( j&&v+ A
②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。
③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！% t& L2 Z&&x1 k* B# W
④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。) m" }8 }/ t' W/ V: u8 w
第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。+ S4 @3 G% Q% b3 K. j- M
⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。' V5 b" F% q, ^, c
⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。( ^2 ^* X2 V$ {% e9 O2 X! p# R
心得体会：1 G! P- @6 G* l" G
①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。
②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。
③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。
④以上的细胞生长液5ml具体配制为
DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计)8 C7 {8 q& A$ j
低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml, ^6 t& T2 z" R8 @. p
胎牛血清（HYCLONE公司的，500ml一瓶，大约3600元）浓度为10%，5ml细胞生长液中大约需要0.5ml
L-VC(自己配) 浓度为50ug／ml，5ml细胞生长液中大约需要 25ul# m# g& s* o$ @6 A
青链霉素(HYCLONE公司的，100ml一瓶，大约190元) 浓度为10万U／ml，5ml细胞生长液中大约需要5ul
至于NaHCO3，一般是加的，浓度为7.5%，使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间，但是我不加，因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物，最好先拿试纸测一下。2 K! w. ~& O% T
再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少，可以忽略不计，但只是在配小剂量的范围内，大剂量的话就要酌情改变。# ^( g! {; p/ }+ H# V
第三步：细胞计数。①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个培养皿。②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水，滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中，用枪头在这三者的混合液中抽吸几次，充分搅匀。④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中，刚好填满。开始计数并算出细胞数数量及浓度。并按浓度分装到培养皿中。&&{+ F& u$ K1 A- B
心得体会：①计数的这个培养皿可以是污染的，只要看的干净就行。7 j5 W$ A1 C( a1 ~# h4 s
②混合的液体为20+170+10=200ul。其中细胞悬液的浓度为10%，也就是说细胞悬液被稀释了10倍（也可以稀释至20倍，稀释的越多，更容易数清楚，但误差也随之增大）。
③计数公式 : 细胞数×104／ml=（四个大方格细胞数÷4）×稀释倍数×104／ml
比如，你数了四个大方格中有拒染细胞400个，那么根据公式算出: ]4 l& D# [9 W
（400÷4）×10×104／ml = 1×107／ml，现在有5ml的细胞悬液，也就是有1×107／ml×5= 5×107 个细胞。当然这么多细胞，不全是我们需要的骨髓间充质干细胞，还有很多其他像红细胞之类的，所以这就要设计到以后的换液纯化了。&&y4 Q2 i8 N" e&&]&&U& w
④按6-8×l06/ml的浓度接种，故 5×107 ÷ 6-8×l06/ml = 8.3 – 6.25 ml 。因为一般60mm的培养皿承载最多5ml的液体，故将5ml的细胞悬液再加入3ml的细胞生长液稀释成8ml的细胞悬液，各取4ml分装至两个60mm的培养皿。此刻每个培养皿的细胞浓度为：; T2 b) s1 w- t1 R( A% X9 P- L
（5×107）÷8 =6.25×l06/ml,正好在要求的接种密度6-8×l06/ml范围内。
⑤将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。/ r3 }2 \( |# V% R: N/ f
第四步，48h后半量更换细胞生长液。以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代，大约周期为7天。, z/ }" t, N$ S1 {
这个方法如何？大家怎么看？
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我看这个方法可以，我们基本也这样。可否放一两张你们的图看看
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写的很好，连细节也说到了。方法都差不多。
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请高手看下细胞状态如何，里面的圆的亮的是造血干细胞吗？怎么去除？第一次传代应该在什么时候？
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成纤维细胞比较多，但是出现球形细胞是好事，我本人观点：继续不断取材并培养，手法娴熟的情况下一定会养出漂亮的MSCs
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您也是做MSC方面的吗？希望今后与您多交流
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球形的折光性比较强的是不是单个核细胞的污染？比如巨噬细胞？我处理过，一般这种细胞贴壁比较晚，但是比较紧，应该不是干细胞
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骨髓MSC不是爆炸性铺展吗？我记得以前养这种细胞是，骨髓吹出来后，稍微吹打一下，贴壁，然后去除单细胞和血细胞，1-2小时换液，细胞团会爆炸性贴壁，这些细胞才是MSC，不会长成单个的。
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那种亮亮的圆的细胞有可能是凋亡的细胞，或者是血细胞。换液就能去除了。MSC形状长的本来就挺像成纤维细胞的。但是不会形成成纤维细胞漩涡样的结构。
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Powered by大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定--《重庆医学》2010年04期
大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定
【摘要】：目的建立心肌微血管内皮细胞培养模型。方法以1%～2%鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用胶原酶和胰蛋白酶两次消化法从SD大鼠心肌分离培养微血管内皮细胞。结果通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度大鼠心肌微血管内皮细胞。结论以鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用蛋白酶消化及机械剪切、过滤的方法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,纯度和获得率均较高。
【作者单位】：
【分类号】：R541
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