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烟酰水杨酸在体外生物体液中的稳定性研究
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阿司匹林酯酶活性及其与阿司匹林抗凝血作用的相关性研究
目的：阿司匹林问世已有一百余年。上世纪70年代发现，阿司匹林可以通过不可逆的抑制环氧化酶-1(COX-1)的活性，从而发挥抗血小板聚集的作用。但是，在长期随访中发现，应用阿司匹林治疗的相当一部分患者在服用阿司匹林后并不能充分地抑制血小板聚集，因此，近年来提出阿司匹林抵抗(aspirin msistauce，AR)的概念。阿司匹林在吸收过程中和吸收后会迅速的被存在于血浆、肝脏及胃粘膜中的阿司匹林酯酶水解为水杨酸，而在体内发挥抗血小板聚集作用的是阿司匹林的原型药物，被阿司匹林酯酶水解为水杨酸后失去此作用，因此服用阿司匹林后，在体内是否发挥抑制血小板聚集作用、作用强弱以及阿司匹林抵抗现象都可能与人体内阿司匹林酯酶活性相关。本研究的目的是证实这一相关性，探讨阿司匹林酯酶活性是否是影响阿司匹林抗凝疗效及导致阿司匹林抵抗的原因之一，来指导阿司匹林临床个体合理化给药。本课题建立同时测定血浆中阿司匹林和水杨酸浓度的高效液相色谱法，采用阿司匹林(ASA)与水杨酸(SA)比值SA/(ASA+SA)表示血浆阿司匹林酯酶的活性，并对阿司匹林酯酶体外培养条件进行优化，测定血浆阿司匹林酯酶活性可以为临床合理用药提供了科学依据。采用健康中国人的血浆为阿司匹林酯酶的酶源来研究该酯酶的动力学特性。测定100例健康中国人血浆中阿司匹林酯酶的活性，考察阿司匹林酯酶活性在中国人群中的分布情况。考察临床上经常与阿司匹林联合应用的药物对阿司匹林酯酶的影响，为临床合理化用药提供依据。由于阿司匹林酯酶在人体的肝脏、红细胞及胃粘膜中也有分布，但目前尚没有反映全身阿司匹林酯酶活性的指标，因此我们建立阿司匹林酯酶的体内活性指标，研究阿司匹林酯酶活性与阿司匹林抗凝血疗效的相关性，考察阿司匹林酯酶活性高低，即阿司匹林体内的水解速度是否是影响阿司匹林抗凝血疗效及导致阿司匹林抵抗的原因之一。
方法：实验采用Phenomenex C柱(4.6 mm×150 mm，5 μm．)；岛津Shim-pack C预柱(4.6ram×10mm，5μm)；流动相为乙腈-0.072mmol·L磷酸(22：78，v/v)；检测波长为228 nm；流速：1.0 mL·min；柱温：30℃：进样量20μL，建立了同时测定血浆中阿司匹林和水杨酸的浓度的方法。以阿司匹林与水杨酸的比值SA/(ASA+SA)表示阿司匹林酯酶的活性，并用正交试验设计分析法对其体外培养条件进行优化选择；通过选择不同的条件，对该酯酶的酶动力学特性进行研究：利用建立的阿司匹林酯酶活性的测定方法，测定100名健康中国人血浆中的阿司匹林酯酶活性，绘制概率分布直方图，观察该酯酶在中国人群中的分布；在培养体系中不加入和加入临床上经常与阿司匹林合并应用的其它药物(化合物)，测定阿司匹林酯酶的活性变化，考察临床上联合用药对阿司匹林酯酶的影响。通过利用气相色谱-质谱联用方法测定12例健康志愿者口服100mg拜阿斯匹灵后的血浆清除率，来考察某一特定时间点血浆SAJASA比率与阿司匹林清除率的相关性，来确定阿司匹林酯酶体内活性指标，并通过考察阿司匹林酯酶活性与临床阿司匹林疗效指标(TXB、6-keto-PGF)之间的相关性，确定血浆阿司匹林酯酶活性高低是否是影响阿司匹林抗凝血疗效及产生阿司匹林抵抗的原因之一。
结果:采用RP-HPLC法同时测定血浆中的阿司匹林和水杨酸的浓度，具有快捷有效的样品前处理，样品分析时间少，良好的分离度和可靠性的特点，并且可以克服提取及分析过程对测定的干扰，结果显示阿司匹林在0.08～5.12μg/mL范围内线性关系良好，水杨酸在0.05～4.00μg/mL，范围内线性关系良好。利用正交试验设计分析法对体外培养条件优化选择得出的最佳的培养条件是ABCD，即以1mmol·L阿司匹林，200μL血浆，在pH为7.6的培养液中培养20min。阿司匹林酯酶的米氏常数Km=429.67nmol·L和Vmax=2.56pmol·min．mL(血浆)，最适反应温度为37℃，培养缓冲液最适pn为7.4，该酶对pn的变化较敏感，对热极不稳定。临床上经常与阿司匹林合用的药物中，硝苯地平、地尔硫卓、维拉帕米、双嘧达莫、卡托普利、美托洛尔、非那西汀、扑热息痛、川芎嗪等药物对阿司匹林酯酶活性具有较显著的抑制作用；而苯巴比妥、卡马西平、丙戊酸、丹参素钠、利多卡因等这些药物对阿司匹林酯酶具有较显著的诱导作用；辛伐他汀、氢氯噻嗪、咖啡因这些药物对阿司匹林酯酶的影响不明显。100名健康受试者的阿司匹林酯酶活性平均值为(0.3)；67名健康男性和33名健康女性的阿司匹林酯酶活性分别为(0.2)和(0.4)，两者之间无显著性统计学差异(P>0.05)。口服阿司匹林后，经过对血浆清除率和各个时间点的水杨酸(SA)和阿司匹林(ASA)的比值的进行相关性分析后发现，3.5小时的血浆中的水杨酸和阿司匹林的比值与阿司匹林的口服清除率显著相关性最好(r=0.882，P<0.01)，因此可反映阿司匹林酯酶的活性。由此确定的12名志愿者的阿司匹林酯酶活性和AUC与阿司匹林的抗凝血疗效指标TXB抑制百分率和TXB/6-keto-PGF的比值的变化存在着显著地相关性(分别为r=-0.9408，P<0.001；r=-0.8211，P<0.01和r=0.8037，P<0.01；r=0.7316，P<0.01)．这些相关性说明阿司匹林酯酶是阿司匹林的抗凝血疗效一个主要的决定因素。
结论：本研究建立的阿司匹林酯酶活性测定的高校液相法操作简便、灵敏、快速，可同时测定血浆中水杨酸和阿司匹林的浓度，适合于在体外测定血浆中的阿司匹林酯酶活性，为国内深入开展阿司匹林代谢酶研究开拓了一种新方法。通过对人血浆中的阿司匹林酯酶活性的分析可以发现阿司匹林酯酶活性对于pH的变化较敏感，而且对热极不稳定。临床上经常与阿司匹林合并使用的某些药物可对阿司匹林酯酶产生具有较显著的抑制或诱导作用，因此同时服用这些药物时应该谨慎。阿司匹林酯酶活性在中国人群中分布成正态性，且性别之间无显著性统计学差异。在阿司匹林酯酶活性，AUC，TXB抑制百分率和TXB/6-keto-PGF的比值变化之间的相关性说明阿司匹林酯酶活性，即阿司匹林水解成为水杨酸的速率是阿司匹林的抗凝血疗效一个主要的决定因素。
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具有起效快，体内迅速被酯酶水解，使得维持时间短的合成镇痛药物是
A、盐酸纳洛酮&
B、美沙酮&
C、盐酸曲马多&
D、盐酸布桂嗪&
E、盐酸哌替啶&
【正确答案】 E
【答案解析】
盐酸哌替啶给药后被血浆中的酯酶水解生成无镇痛活性的哌替啶酸也可以在肝脏中脱甲基，生成几无镇痛作用的去甲基哌替啶，进一步水解生成去甲基哌替啶酸。
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【求助】药物与血浆中的蛋白紧密结合，采用什么方法提取药物？
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这个帖子发布于10年零47天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做的药为苯环的羧酸酯类结构，采用沉蛋白，液液萃取，固相萃取都提取我的药物的回收率都很低，我该怎么办呢？我怀疑是我的药物和血浆中的蛋白可能通过共价键紧密地结合在一起，所以总也是提不出来，不知哪位老师遇到过相似的情况，给我些意见。我现在想是否可以加入某种蛋白水解酶，将蛋白水解掉，我的药物就能析出？
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一点个人意见，请参考。药物为苯环的羧酸酯类结构，因而很容易发生酯酶的水解反应，因此原型药物含量会低，而会有代谢产物出现。因此我怀疑是否有其它代谢物生成，而不是因为什么共价键结合。一般情况下，沉蛋白，液液萃取，固相萃取等方法至少有一种方法能获得良好结果，除非吸附和分子状态问题。
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可以试试家沉淀剂后超声
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我做的药也有楼主描述的这种情况,现在是采用衍生化的方法解决的,通过测定反应产物进行药动参数的测定,有文献报道与我的药结构类似的化合物能与蛋白共价结合.你现在还不确定的话,可以试试各种酶,如胃蛋白酶,胰蛋白酶,枯草杆菌酶,葡萄糖醛酸酶等.
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我做的药也有楼主描述的这种情况,现在是采用衍生化的方法解决的,通过测定反应产物进行药动参数的测定,有文献报道与我的药结构类似的化合物能与蛋白共价结合.你现在还不确定的话,可以试试各种酶,如胃蛋白酶,胰蛋白酶,枯草杆菌酶,葡萄糖醛酸酶等.
不好意思，发完帖子突然发现进入实验室别的同学注册名下发表的，还请见谅，现在是我的注册名了，楼主如果还有问题要讨论，请和我联系！
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huifang 提供点建议仅供参考:
我做的药也有楼主描述的这种情况,现在是采用衍生化的方法解决的,通过测定反应产物进行药动参数的测定,有文献报道与我的药结构类似的化合物能与蛋白共价结合.你现在还不确定的话,可以试试各种酶,如胃蛋白酶,胰蛋白酶,枯草杆菌酶,葡萄糖醛酸酶等.请教这位战友,你是进行体外衍生并测定产物的么?这种情况下测定的药代学参数应该与实际情况有一定的出入吧LZ所说的情况我觉得2楼说的比较符合,不过不排除共价键结合的可能 啊
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是用给药后的血样加上衍生化试剂反应之后测定反应产物的,标准曲线是用原形药加到血中然后衍生测定代谢产物得到的,是对应的,应该不会有太大出入吧!
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谢谢各位给我这么多珍贵的意见，文献报道与我的结构相似的化合物的蛋白结合率都很高，是否有共价结合目前还没有查到，现在手头上并没有蛋白水解酶，所以也没有尝试。文献报道与我的结构相似的化合物很多是会在加入血浆之后被血浆中的血浆酯酶部分或全部的水解掉，而来测定它的水解产物，我现在用2倍体积的乙腈：水（95：5）提取的回收率能达到50%，但是目前在这个基点上回收率就是提不上去了，我怀疑是否我的药物被部分水解，我能提出的50%已经是全部了，剩下的50%就是水解物啦？（目前手头上也并没有水解后酸型的对照品，我也没有办法验证）不知我的分析有道理吗？
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我的一点想法：
剩下未提取出的50%有可能含水解物，但不一定全是，有可能还有一小部分原型药和蛋白结合的。
根据FDA的生物样品分析方法的有关规定，现在对回收率没有严格要求，只要能满足你分析的要求，检测限，灵敏度等能达到要求就可以了。
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昨天做了预实验，静脉给药，提取方法还用的的2倍体积的的乙腈：盐酸溶液（95：5），（体外它的回收率能达到50%）结果却没有峰啊，我给药给了2mg呀，也不少啊，有可能代谢那么快吗？怎么一点也测不到啊？我以前也作过静脉给药的预试验，用的乙酸乙酯提取，（体外乙酸乙酯的提取回收率才只有20%），还能测到很小的峰呢？这是怎么回事啊？我的实验该怎么进行下去啊？给点意见吧？我真的是蒙了。
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用乙酸乙酯能测到，为什么要换成乙腈沉淀蛋白的方法呢？你预试验测回收率的浓度是多大？同位素标记你的原药进行试验才能证明你的药是否和蛋白共价结合。我用的衍生化的方法，测定的是原形药和衍生化试剂反应的产物。分析分析你的原药的结构，再考虑考虑能不能用别的方法，提高检测灵敏度，试试荧光，质谱检测，查查相关结构化合物体内检测的文献。
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昨天我将我预试验的血浆样品处理后进质谱，我的药确实发生了水解，而且它的水解物也是它的活性成分，我打算测定它的水解物，来做药动学。
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liuyangxixihah战友，再给你一点建议：通常象你正在进行的化合物来说，可同时测定药物及其活性代谢物，了解二者在体内的药动学规律，主要是药物降解成为活性代谢物的效率和速率，以确定起效的时间和强度。因此最好用一种分析方法同时测定药物和代谢物，以免发生重新补充试验的情况。关于提取率的问题，只要提取率稳定（RSD&15％），即使50％也是可以接受的。多考虑一下方法学确证，确保过关。
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回复autumnfeng
其实我倒也是想能同时测定药物和水解物，我体外原型药物的回收率能达到50%，但是体内预试根本检测不到原型药物。
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我测得是中药，血清中经过除蛋白步骤进质谱也检测不到什么东西，求楼主赐教
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