肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝脏对各种原因所致肝损伤的“创伤愈合”反应, 是组织发生修复反应时细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程, 它是各种肝病导致肝硬化的共同途径[,], 目前临床仍然缺乏治疗该疾病的合适药物。 我们在前期细胞实验中研究了羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的调控作用, 系统地探讨了HCPT对HSCs活化、增殖、凋亡、胶原合成的影响,发现HCPT具有抑制HSCs活化、增殖以及Ⅰ型胶原蛋白及基因表达的作用[,,]。本研究在前述研究基础上进行动物体内实验, 观察HCPT对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织Bax、Bcl-2基因和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达及纤维化的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级成年SD大鼠, 体质量200～220 g, 64只, 雌雄各半[实验动物许可证号:SCXK(赣)], HCPT粉针(黄石时珍药业集团), α-SMA兔多克隆抗体、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),DeadEnd TUNEL比色法检测系统(Promega公司),分析纯CCl4(天津第四化学试剂厂), RT-PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
大鼠肝纤维化模型的制备[]及处理 大鼠在实验室适应性饲养1 周, 随机分为5组: 正常组(13只)、模型组(13只)、低剂量HCPT治疗组(13只)、中剂量HCPT治疗组(13只)和高剂量HCPT治疗组(12只)。按0.2 mL/100 g给予大鼠腹腔注射40%CCl4花生油溶液(纯40 mL CCl4加花生油至100 mL配成40% CCl4 花生油溶液),
2次/周,共8周,诱导大鼠肝纤维化。正常组用等体积生理盐水腹腔注射, 3次/周; 模型组仅给予CCl4 诱导肝纤维化模型; 低、中、高剂量HCPT治疗组在造模同时分别给予HCPT 0.25、0.5、1.0 mg/kg腹腔注射, 均为3次/周,HCPT浓度均为0.1 mg/mL。实验结束时正常组、模型组及各HCPT治疗组均有10只大鼠存活。
实验方法 第8周末用戊巴比妥钠(5 mg/100 g)腹腔注射麻醉后处死大鼠, 切取肝脏, 拍照记录, 取肝脏相同部位用于石蜡切片, 分别进行H-E染色、Masson胶原染色,观察大鼠肝组织病理学改变;剪下肝脏左叶50～100 mg大小组织若干块置于冻存管中, 标号后立即置于液氮中保存, 用RT-PCR检测肝组织中Bax、Bcl-2 mRNA表达;其余标本立即置于冷10%中性甲醛中固定, 用免疫组化染色检测肝组织中α-SMA蛋白表达,用TUNEL染色观察细胞凋亡情况。
大鼠肝脏组织病理学观察
用10%甲醛溶液固定,石蜡包埋进行常规H-E染色及Masson染色。肝纤维化病理分期参考中华肝脏病学会肝纤维化学组《肝纤维化诊断及疗效评估共识》[] 。
RT-PCR检测大鼠肝脏组织中Bax、Bcl-2 mRNA表达 用TRIzol提取肝脏组织总RNA,按试剂盒说明书反转录成cDNA并进行PCR扩增,引物序列: Bax上游
5′-acg cat cca cca aga agc-3′, 下游
5′-gaa gtc cag agt cca gcc-3′,扩增片段长度为272 Bcl-2上游
5′-cct ggc atc ttc tcc ttc-3′, 下游
5′-tgc tga cct cac ttg tgg-3′,扩增片段长度为584β-actin上游
5′-tca ggt cat cac tat cgg caa t-3′, 下游
5′-aaa gaa agg gtg taa aac gca-3′,扩增片段长度为405 bp。反应条件: 预变性94℃ 4 min,变性 94℃ 30 s,退火 55℃ 30 s,延伸 72℃ 30 s,总延伸 72℃ 5 min,共30个循环。RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像系统照相并用
Bandscan 5.0软件计算基因相对表达量。实验均重复3次取平均值。目的基因相对表达量=(目的基因条带面积×条带强度)/
(β-actin基因条带面积×条带强度)。
免疫组化染色检测大鼠肝脏组织α-SMA蛋白表达
对石蜡切片进行常规烤片、脱蜡水化等处理后滴加α-SMA一抗(稀释为1?100)，4℃孵育过夜,滴加聚合HRP标记抗兔IgG,37℃孵育30 min,使用DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)显色。每张切片分别观察5个不同的显色较好的高倍镜视野, 分别记录染色强度和染色范围。 染色强度分为弱(+)、中()、强(),较强(), 染色范围占高倍视野<1/4时记录为(+)、1/4至2/4为()、>2/4至3/4为()、>3/4为()。 将染色强度和范围换算成染色指数, 即染色指数=染色强度×染色范围(+、、、分别记为1、2、3、4分), 最后以5个视野染色指数的平均值作为蛋白表达的最终染色指数[,]。
大鼠肝脏组织TUNEL染色
按照试剂盒说明书要求配置相关试剂并处理石蜡切片,用DAB试剂盒染色。染色结果判定:
凋亡阳性细胞细胞核染色为浅棕色。
统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行统计学分析, 所有计量资料以 ±s表示, 多样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 组间两两比较采用t检验,等级资料用非参数统计的秩和检验。检验水准(α)为0.05。
各组大鼠肝脏组织病理学改变
大鼠肝脏组织大体观察: 正常组肝脏色泽红润, 表面光滑, 边缘锐利, 质地柔软; 模型组肝脏明显缩小, 肝脏色泽灰暗, 表面凹凸不平, 边缘粗顿, 质地较硬; 各HCPT治疗组肝脏色泽灰黄, 表面欠光滑,有不同程度颗粒感, 边缘稍粗顿, 质地柔软。 H-E及Masson染色镜下观察:正常组肝脏小叶结构正常, 肝索排列规则有序, 未见有炎症细胞浸润, Masson染色未见异常纤维增生(图 1A、1F); 模型组肝脏小叶结构紊乱, 近汇管区有较多肝细胞脂肪变性, 小叶被纤维分割包绕, 可见假小叶形成, 小叶内大量炎症细胞浸润,Masson染色可见大量纤维增生(图 1B、1G); 各HCPT治疗组肝脏小叶结构紊乱, 有部分小叶纤维间隔形成, 无明显假小叶形成, Masson染色可见程度不等的纤维增生, 随给药剂量增大逐渐减少
(图 1C~1E、1H~1J)。 各组大鼠肝纤维化组织病理学分期比较见表 1, 模型组大鼠出现明显的肝纤维化,各HCPT治疗组的肝纤维化程度较模型组减轻,差异有统计学意义(P均<0.05), 提示HCPT可以减轻大鼠肝纤维化程度。
图1Fig. 1图 1 各组大鼠肝脏组织H-E染色(A-E)及Masson染色(F-J)
Fig 1 H-E staining (A-E) and Masson staining (F-J) of rat liver tissues in each group
C, H: Low-dose hydroxycamptothecin (HCPT)
D, I: Intermediate-dose HCPT
E, J: High-dose HCPT group.
Original magnification: ×100
表 1表 1(Table 1)表 1 各组大鼠肝纤维化组织病理学分期
Tab 1 Histopathological findings of rat hepatic fibrosis tissues
Group0ⅠⅡⅢⅣ
Normal control100000
Model00028
Low-dose HCPT00181
Intermediate-dose HCPT00730
High-dose HCPT01720
HCPT: Hydroxycamptothecin. Kruskal-Wallis test.
There was significant difference between the model group and the other groups (P<0.05)
表 1 各组大鼠肝纤维化组织病理学分期
Tab 1 Histopathological findings of rat hepatic fibrosis tissues
各组大鼠肝组织Bax、Bcl-2 mRNA表达及Bax/Bcl-2 mRNA比值
结果如图 2所示，
模型组Bax、Bcl-2 mRNA的表达与
其余各组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);
HCPT中剂量治疗组Bax、Bcl-2 mRNA的表达与高、低剂量组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组比较,其余各组Bax/Bcl-2 mRNA比值差异均有统计学意义(P均<0.05)；HCPT中剂量治疗组Bax/Bcl-2 mRNA比值与高、低剂量组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。 结果提示HCPT可以影响Bax、Bcl-2 mRNA的表达, 并调节Bax/Bcl-2 mRNA比值。
图2Fig. 2图 2 各组大鼠肝组织Bax、Bcl-2 mRNA表达
Fig 2 Expression of Bax and Bcl-2 mRNA in rat liver tissues of each group
2: Low-dose hydroxycamptothecin (HCPT)
3: Intermediate-dose HCPT
4: High-dose HCPT
5: Normal control group.
△P<0.05 vs intermediate-dose HCPT group.
各组大鼠肝脏组织α-SMA蛋白表达免疫组化染色结果显示,正常组大鼠的肝组织未见有明显α-SMA蛋白表达(图 3A);
模型组大鼠肝组织有α-SMA蛋白大量表达, 主要集中于肝脏组织汇管区, 以纤维间隔中最为明显(图 3B); 各HCPT治疗组大鼠肝组织α-SMA蛋白有较少表达, 主要集中于肝脏组织汇管区, 以纤维间隔中为主(图 3C～3E)。
图3Fig. 3图 3 各组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达
Fig 3 Expression of α-SMA protein in rat liver tissues of each group
HCPT: Hydroxycamptothecin.
A-E: Immunohistochemical staining of α-SMA protein (original magnification: ×100);
F: Quantitative analysis of α-SMA protein expression.
△P<0.05 vs intermediate-dose HCPT group. n=10,
定量分析结果(图 3F)显示,除HCPT低剂量组外,模型组肝组织α-SMA蛋白表达与其余各组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。HCPT低、中剂量组间α-SMA蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),
而中、高剂量组间差异无统计学意义。
各组大鼠肝脏组织TUNEL染色
TUNEL染色结果(图 4)显示,正常组、模型组均未见明显阳性染色,各HCPT治疗组可见较多阳性染色;TUNEL阳性染色细胞主要集中于肝脏组织汇管区,以纤维间隔中最为明显(图 4A～4E);高倍镜下可见细胞核染色为浅棕色的凋亡细胞,形态主要为梭形(图 4F～4J)。
图4Fig. 4图 4 各组大鼠肝组织TUNEL染色
TUNEL staining of rat liver tissues in each group
C, H: Low-dose hydroxycamptothecin (HCPT)
D, I: Intermediate-dose HCPT
E, J: High-dose HCPT group.
Original magnification: ×100 (A-E); ×400 (F-J )
HCPT目前主要用于抗肿瘤的治疗, 近几年来关于HCPT除抗肿瘤外的应用研究取得了一些进展。 已有的研究表明HCPT具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、干扰细胞信号转导通路、抑制血管生成活性等作用[,,,,,,],
我们已经在前期的体外实验[ ,,]中发现HCPT可以影响HSCs的活化增殖及胶原合成,因而其可能在肝纤维化的防治研究中存在前景。 本研究采用经过改良的大鼠肝纤维化造模方法, 进行HCPT体内实验以进一步观察该药在动物实验中对肝纤维化的影响。
HSCs的活化是肝纤维化发生发展的核心环节[ ,,,,]，并且在肝损伤修复过程中也发挥作用[,], 抑制HSCs增殖、诱导其凋亡, 从而减少ECM生成是治疗肝纤维化的重点, 寻找能够以HSCs为作用靶点, 进而影响其生物学行为的药物可能成为治疗肝纤维化的新途径。
α-SMA蛋白主要存在于平滑肌细胞与肌成纤维细胞中, 肝脏组织中只有活化的HSCs才能表达,因此α-SMA蛋白的表达被视为HSCs活化的标记,通过观察α-SMA蛋白的表达可以评估HSCs活化增殖情况。 前期实验证实在体外环境下经HCPT干预后HSCs的α-SMA蛋白表达明显降低[], 本研究通过HCPT体内干预, 发现可以降低大鼠肝脏α-SMA蛋白的表达,与体外细胞实验结果相符, 说明HCPT在动物实验中仍然可以减少HSCs的活化增殖。
目前的研究证实细胞凋亡的调控主要依赖于两个保守的信号转导途径: 死亡受体通路和线粒体通路,Bcl-2家族蛋白则参与了后者的调节。 Bcl-2和Bax是该家族中最具代表性的抑制和促进凋亡基因。 Novo等[]认为活化的HSCs产生凋亡抗性的主要原因是Bcl-2的过度表达。
因此下调Bcl-2的表达、上调Bax的表达, 改变二者比值可以促进HSCs的凋亡[]。本研究发现HCPT可以升高Bax/Bcl-2 mRNA比值, 因此有理由认为HCPT可能通过改变Bcl-2家族成员间的动态平衡诱导HSCs凋亡, 并由此削弱HSCs自身所具有的正反馈环路效应[ ,],促进活化的HSCs凋亡。本研究还通过设置多个不同给药剂量进行观察,发现中剂量组(0.5 mg/kg)与高(1.0 mg/kg)、低剂量(0.25 mg/kg)组相比,Bax/Bcl-2 mRNA比值差异有统计学意义(P<0.05);但α-SMA蛋白表达在中、高剂量组间差异无统计学意义,因此HCPT给药剂量是否存在最佳剂量值尚难以定论。TUNEL染色在细胞凋亡的研究中应用较广,本研究对肝组织切片的TUNEL染色发现阳性着色细胞主要集中于肝脏组织汇管区,以纤维间隔中最为明显,其分布情况与α-SMA蛋白免疫组化染色区域一致。由此我们可以推断TUNEL染色阳性细胞多为凋亡的HSCs,同时我们还发现各HCPT治疗组中肝细胞未见明显染色,提示本研究中HCPT的剂量没有产生对肝细胞的直接影响。
本研究对各组大鼠肝脏病理的比较分析也验证了通过在肝纤维化过程中使用HCPT进行干预可以明显减轻大鼠肝纤维化的程度,这对应了前期体外细胞实验[,,]及上述分析的结果。 然而我们目前的研究尚十分浅显, HCPT对肝纤维化进程的影响还有待更加深入的研究。
4 利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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Fujiwara A, Sakaguchi K, Fujioka S, Iwasaki Y, Senoh T, Nishimura M, et al.Fibrosis progression rates between chronic hepatitis B and C patients with elevated alanine aminotransferase levels[J]..
邓 群, 张 一, 胡国信, 袁 铿, 袁 芳, 黄艳琴.羟基喜树碱对大鼠肝星状细胞增殖抑制的最佳浓度[J]..
张 一, 邓 群, 胡国信, 袁 铿, 袁 芳, 黄艳琴.羟基喜树碱对HSC-T6细胞增殖与凋亡的影响[J].中华肝脏病杂志, -234.
胡国信, 万赞燕, 邵佳亮, 张 一, 张伦理, 龚作炯.羟基喜树碱对大鼠肝星状细胞转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原表达的影响[J].中华肝脏病杂志, -457.
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张 敏, 吴万春.肝组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统与肝纤维化的关系[J]..&【产品中文名称】
&TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(石蜡切片）
【产品产地】
&【English Name】
&Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit
【产品货号】
&【产品 价格/规格】
&1500元/20次，2600元/50次，4200元/100次
更新时间：&
&【产品详细说明】
一、产品简介&&& TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3&-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3&-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Termina lDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。本试剂盒适用于组织样本（石蜡切片）的凋亡原位检测。本试剂盒有如下优点：1、高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。2、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。3、快速：仅需约3小时即可完成。4、操作简单：使用Ready-to-Use型试剂，并配有蛋白酶K 和DAB。5、方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果，亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。
二、试剂盒组份
三、试剂盒以外自备仪器和试剂&&& 二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、荧光显微镜、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：&&& -20℃保存，荧光标记液需避光保存。
五、注意事项：1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。6、TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20&DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程A、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。1、对于石蜡切片a、按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合&（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））b、把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。c、把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。（蛋白酶K工作液的配制：2&L 50&蛋白酶 K＋98&L PBS）d、把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。e、把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）f、把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。g、然后转入B步骤标记和显色反应。&&& 注意事项：a、蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400&g/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50&Proteinase K浓度为1mg/mL）。b、其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：&将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl& PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）替代方法3: &将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。c、使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。2、对于难处理的切片a、按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合&（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））b、把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。c、把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 mind、迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温， 将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。e、把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。&（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）f、把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。g、然后转入B步骤标记反应。5、 阳性对照及阴性对照的准备TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。a、 阳性对照样本的准备&&& 组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100&L DNase I反应液（用户自备）室温～37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）b、 阴性对照样本的准备在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。B、标记和显色反应：1、预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。2、配制TdT酶反应液：& 参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
3、每个样本滴加50&L TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）4、把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。5、荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。可进一步用DAB进行染色观察6、anti-fluorescein antibody及DAB工作液的配制： &anti-fluorescein antibody工作液的配制：参考下表配制适量的anti-fluorescein antibody工作液，需充分混匀。注意：配制好的anti-fluorescein antibody工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
DAB工作液的配制：a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20&DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
b、DAB工作液的配制：参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
7、将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50&L anti-fluorescein antibody工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。8、把第7步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。9、将第8步处理好的样本滴加50&L-100&L DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。10、把第9步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。11、选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。操作注意事项：1、PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。2、在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。3、TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。4、如果20&DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。5、苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5min。用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
七、常见问题的原因及推荐解决方案
*TdT dilution buffer60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol
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