骨骼肌的收缩过程分为潜伏期、收缩期和舒张期。骨骼肌在电刺激后，从兴奋到引起骨骼肌的收缩，至最终恢复到舒张状态，其间必然发生一系列的形态和功能的变化。骨骼肌肌纤维中，T-管、肌浆网（SR）以及Ca2+在兴奋收缩偶联发生过程中起着非常重要的作用，但是，其作用的机制是什么?也就是说在骨骼肌兴奋收缩偶联发生时，肌浆网内的Ca2+通过何种途径释放?怎样释放以及释放过程中有哪些形态结构和功能的变化?一直未能在形态学上得到证实。这也是细胞生物学、生理学以及生物物理学近年来研究的热点之一。骨骼肌兴奋-收缩偶联发生的时间历程极短（以毫秒计），而常规化学固定（固定时间以分钟计）无法保留其瞬间经历时的超微结构形态变化，由于这些研究方法及手段的限制，因此常规的细胞超微结构研究方法无法对其在毫秒级功能变化时的结构作同步研究，因而研究骨骼肌在收缩过程中的实时超微结构形态变化，仅仅处于起步研究阶段，还缺乏重大的、有影响的报道。然而，从功能形态学角度研究骨骼肌在收缩过程中各时间点的实时超微结构形态变化，阐明骨骼肌在各种明确功能状态下的超微结构，又是可能的。
对于骨骼肌的兴奋收缩偶联机制，国外学者从生理学实验提出了两个假说：直接接触信号传导（DCT）和钙诱导钙释放（CICR）。DCT认为：骨骼肌兴奋收缩偶联发生时，肌浆网膜去极化，肌浆网膜上的活性位差诱导电荷动作，并通过T-管膜上的dihydropyridine受体和肌浆网膜上含有ryanodine受体的连接突起组成的紧密连接链引起形态上的改变，打开钙离子释放通道，引起肌纤维的收缩。也就是说骨骼肌收缩时，肌浆网在钙离子释放的瞬间，偶联应引起肌浆网膜结构的变化，这条假说已经被许多实验所证实。CICR认为：在骨骼肌兴奋收缩偶联前期，即肌组织电刺激后2毫秒内，细胞外Ca2+通过T-管膜上的L-type通道（由DHP受体形成）的去极化诱导内流，使肌浆网外钙结合位点附近的Ca2+浓度升高，触发肌浆网膜上的ryanodine受体的Ca2+释放通道开放，肌浆网内的Ca2+以分级方式向肌浆网外释放。
八十年代末，国外学者提出了采用超低温快速冷冻固定、透射电子显微镜及电子探针X-射线能量色散谱微区分析（EPXMA）技术为研究工具，研究骨骼肌兴奋收缩偶联发生时，肌浆网内Ca2+释放机理，但难以解决如何在骨骼肌兴奋收缩偶联毫秒级功能变生物物理学《钙诱导触发骨骼肌内C扩+释放的形态一功能变化研究》化时，同步固定其骨骼肌组织，实时获得其瞬间经历的超微结构形态变化及Ca2+浓度、分布位点的变化。要解决这一难题，可以通过采用超低温快速冷冻固定计算机控制的毫秒级实时处理技术、冷冻置换技术、电子显微镜技术相结合的方法，对骨骼肌电刺激后的不同时间点（OmS一24ms范围内）进行固定后，观察骨骼肌肌膜、胞浆、肌浆网、T一管在收缩潜伏期和收缩期内超微结构的时相一形态变化，从细胞超微结构角度研究骨骼肌兴奋收缩偶联发生时，钙诱导刺激骨骼肌肌浆网内Caz+释放这瞬间生理活动时的结构形态及CaZ+浓度、分布位点的变化;结合激光共聚焦显微镜技术，从亚微结构实时观察C犷spark的整个发生过程，分析其发生机制，从而揭示骨骼肌兴奋收缩偶联时肌浆网内Cau’释放机理。为骨骼肌兴奋收缩偶联发生时，提供形态学上的证明，最终解决其肌浆网内C扩+的释放机制问题。
要明确通过钙诱导钙释放机制致使骨骼肌兴奋收缩偶联发生时的超微结构和形态功能的变化，可以通过控制肌膜上c扩十通道的方法来实现。Nefidipine是T一管膜上DHPR的阻断剂，用它能有效阻断细胞外c扩十内流。将实验分成两组，一组用Ringer’:浸泡骨骼肌，一组用含5%N efidiPine的Ringer’s浸泡骨骼肌。采用本室自研的计算机控制的红外探测毫秒级实时处理一超低温快速冷冻固定技术、冷冻置换技术和电镜技术，观察了骨骼肌在电刺激后潜伏期内的超微结构形态变化。获得了骨骼肌在电刺激后不同时间点的超微结构形态变化图象。电镜下观察各时间点的样品，在冷冻打击面50p。以内，各实验组各时间点样品中骨骼肌超微结构形态保存极佳，可以观察到肌原纤维排列整齐;其明、暗带，Z线、M线清晰;三联体、肌丝、糖元颗粒、线粒体、肌细胞核等结构清楚;横小管（即T一管）位于Z线水平，随切面不同而呈园形或椭圆形，肌浆网丰富。在未加拮抗剂NefidiPine的标本中，发现骨骼肌电刺激后潜伏期内（O一.1 Oms），肌膜向内凹陷形成陷穴小泡，随着时间的推移，胞浆内的小泡数量逐渐增多且几个互相融合成类似多聚体的结构，之后又逐渐消失，IOms时肌膜恢复到与静息期相似的平直状态;oms一Zms时间段内，可见肌浆网内物质均匀分布，肌浆网和T一管未见明显改变。电刺激后Zms一10ms时间段内，肌浆网内出现电子密度较深的物质，并且随着时间的推移，这些物质逐渐向肌浆网临近T一管位置的方向移动。Zms时，在肌浆网中央可见一圆形透亮区域（称为Core Cyl inder），肌浆网内出现电子密度较深的物质，均匀分布于除圆形透亮区域外的SR内;4.6ms时，沿肌浆网膜内外侧可见一一对应的电子密度深的物质，与此位置
The course of skeletal muscular contraction includes latency, systole and period of relaxation. During the course, the skeletal muscle must have a series of structural and functional changes. In the skeletal muscular fiber, the T-tube, sarcoplasmic reticulum(SR) and Ca2+ ion play a key role during the excitation- contraction (e-c) coupling course, but it was still not clear what was the mechanism of Ca2+ releasing and what happened structurally and functionally during SR releasing Ca2+ ion. All these concern are very hot aspects in cell biology, physiology and biophysics. The time course of skeletal muscular e-c coupling is very short (measured at millisecond), but the conventional method of chemical fixation (measured at minute) can’t reserve the ultrastructure as functional changes quickly. Because of the restriction of these researching methods, conventional measure of studying on cellular ultrastructure can’t obtain the skeletal muscular structural changes in millisecond level. It is still at the beginning of studying the ultrastructural and morphological changes during the course of skeletal muscular contraction and there are no influential reports in these fields. However, it is possible to study the Real-time ultra structural changes on every time spots during the course.On the point of the mechanism of skeletal muscular e-c coupling, foreign scholar had put forward two hypotheses via physiological experiments: direct contact signal transduction (DCT for short) and calcium induced calcium release (CICR for short). DCT considers when the e-c coupling takes place, SR membrane depolarized and induced electricity action, so an allosteric signal is transmitted to the calcium release channels (RyR) in the membrane of SR and then the RyR opens, which makes the skeletal muscular fibers contract. That means e-c coupling should induce changes of SR membrane in the moment of Ca + released from SR when the skeletal muscle contracts. This hypothesis had been proved by some experiments. CICR considers it is within two milliseconds which is the prophase of e-c coupling after electric stimulation, the extracellular calcium are induced to flow in through depolarized L-type channels (DHPR) in the membrane of T-tube, resulting in the calcium concentration rising just out of the SR membrane, which cause the opening of the RyR, then the calcium release gradually from SR.At the end of 1980s, foreign scholars studied the mechanism of calcium releasing from SRduring the e-c coupling through ultra-hypothermy quick cryofixation, transmission electronic microscopy(TEM) and electronic probe X-radiation micro-analysis(EPXMA), but it was very difficult to fix the skeletal muscle at the millisecond level to obtain the functional changes of the skeletal muscular e-c coupling, so they didn’t acquire real-time ultrastructural changes, calcium concentration and distribution situs changes. These problems could be resolved by two-way infrared detectors (developed in our lab) with a computer to control the signal of electric stimulation and ultra-hypothermy quick freezing fixation at millisecond level technique, freezing displacement and TEM. We could study the ultrastructural time-morphological changes of SR and T-tube of the skeletal muscle in latency and systole during the e-c coupling course when the skeletal muscle is fixed on different time spots (Oms to 24ms) after electrical stimulated, then we would acquire the morphological structure, calcium concentration and distribution situs changes at the moment of calcium releasing from SR when induced. Combination with confocal microscopy, the entireness of Ca2+spark could be observed on submicroscopic level, and its mechanism would be analyzed. Colligating the two methods, the mechanism of calcium releasing from SR would be proved in morphology when the e-c coupling takes place.To study the controlling of calcium channels in sarcolemma could make clear the ultrastructural and functional changes in e-c c
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作者：余沪荣&&年度：2012关键词：内皮细胞；雌激素；一氧化氮；一氧化氮合酶；钙
　　摘要：利用小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)作为模型, 观察17β-雌二醇(E2)对BAECs一氧化氮(NO)释放、一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达和细胞内钙(［Ca2+］i)的影响,以及雌激素受体(ER)拮抗剂tamoxifen和NOS抑制剂(L-NAME)的作用。结果显示, E2 (10－12～10－8 mol/L)呈浓度依赖性促进BAECs中NO的释放, 以10－8 mol/L浓度E2处理BAECs 48 h,可见eNOS mRNA表达明显增加, 这些作用均可被tamoxifen (10－7 mol/L)和L-NAME (10－6 mol/L)明显抑制; E2 (10－8 mol/L)处理48 h可使BAECs静息［Ca2+］i和ATP诱导的［Ca2+］i上升幅度均显著增加。提示E2能促进BAECs的NO释放和eNOS mRNA表达, 该作用至少部分通过ER介导, 并可能与细胞内钙动员有关。雌激素具有重要的心血管保护作用［1］,主要表现在降低血脂、 保护内皮、 抑制血管平滑肌细胞增殖迁移、血小板粘附聚集、 减少动脉粥样硬化斑块形成和促进斑块消退等方面。近几年的研究提示,雌激素的抗动脉粥样硬化作用可能与一氧化氮(nitric oxide, NO)有关［2］。NO存在于多种组织细胞中,包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs), 它不仅是调节血管张力的重要因子, 而且在抑制VSMCs增殖迁移等方面发挥了重要的生理作用。但目前由于雌激素心血管保护效应与NO的关系及其受体机制,以及细胞内信号传导途径还不十分清楚, 而且对其与细胞内钙的关系亦存在争议［3,4］。 本研究旨在培养的小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)上,观察17β-雌二醇(E2)对NO释放、 eNOS mRNA表达和细胞内钙(［Ca2+］i)的影响及雌激素受体(ER)在其中的作用,以进一步探讨雌激素对BAEC的作用与NO的关系。
　　1　材料和方法
　　1.1　BAECs的培养　　在无菌条件下取新生小牛(广州市奶牛研究所提供)的胸主动脉, 按Ishikawa等［5］的方法分离、培养BAECs,原代BAECs呈铺路石状, Ⅷ因子染色阳性。实验采用传代培养第3～5代的细胞, 培养液为含10%小牛血清的无酚红DMEM, 给药前24 h换用无血清而加入转铁蛋白等补充营养的无酚红DMEM。
　　1.2　NO释放的测定［6］　　采用Nitrit/Nitrat Farbtest试剂盒,用比色法测定培养液和细胞内的硝酸盐总量。以每培养瓶106个细胞的密度接种细胞, 分别收集细胞培养液和细胞裂解液(80℃恒温水浴裂解10 min, 12?000 r/min, 离心10 min, 取上清液)进行测定。500 μl样品中加入250 μl NADPH和200 μl硝酸还原酶,室温下孵育30 min, 加入对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺显色15 min, 以紫外分光光度计546 μm波长测定吸光度,再根据标准曲线换算成硝酸盐浓度。细胞培养液和细胞裂解液中硝酸盐浓度之和即为BAECs释放出的硝酸盐总量。
　　1.3　eNOS mRNA的表达检测　　用TRIzol试剂盒提取细胞RNA, 提取后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。根据Nadaud等［7］报道的序列合成BAECs的eNOS寡核苷酸引物,其序列为: 上游5′-AAC ATG TGT CCT TGC TCG AGG CA-3′,下游5′-TTC CGG CGTCCA CCT GAT CCT aA-3′。利用该对引物可扩增出443 bp的eNOS cDNA片段。内标GAPDH的寡核苷酸引物是根据Fort等［8］报道的序列合成:上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游 5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′。取样品总RNA2 μg, 加入0.4 μmol/L 特异性eNOS mRNA引物, 采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应(RT-RCR),总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl, 加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳条件为68 V,45 min。以GDS凝胶成像系统拍摄电泳图谱, 并进行分析。
　　1.4　BAECs内游离钙浓度测定［3］　　采用荧光法测定BAECs内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)。BAECs悬液内加入终浓度为2　μmol/L的Fura-2/AM,37℃下孵育50 min, 用2 g/L牛血清白蛋白K-H液洗3次。将负载Fura-2/AM的细胞悬液2.5 ml,置于RF-5000双波长荧光分光光度计上进行测定。固定发射波波长(Em)505 nm, 固定激发波长(Ex)在380和340 nm采样间隔为1 s,测定340与380 nm的荧光强度比值。在λex=340 nm,λem=505 nm条件下, 测得BAECs悬液的基础荧光值F, 加入0.1% Triton x-100破膜, 使细胞内过剩的Fura-2与细胞外Ca2+结合, 测出最大荧光值Fmax; 再加入5 mmol/L eGTA络合Ca2+, 使Fura-2游离, 测定最小荧光值Fmin。记录给药前后的荧光比值,按公式计算胞浆内钙离子浓度: ［Ca2+］i=Kd［(F－Fmin/(Fmax－F)］(nmol/L)。输入测得的数据Fmax、Fmin、F及Kd=224 nm, 由RF-5000钙测定系统软件求出BAECs的［Ca2+］i。
　　1.5　试剂　　Nitrit/Nitrat, Farbtest试剂和TitanTM one Tube RT-PCR Kit均由Boehringer mannheim公司提供, TRIzol试剂、 DMEM为Gibco产品, 17β-雌二醇(17β-estraoliol,E2)、 tamoxifen、 琼脂糖(Agrose), Fura-2/AM均为Sigma产品, eNOS引物序列和GAPDH引物序列由上海生工生物工程公司合成。
　　1.6　实验分组　　(1)对照组; (2)E2组; (3)Tamoxifen+E2组; (4)L-NAME+E2组;(5)Tamoxifen组; (6)L-NAME组。
　　1.7　统计处理　　结果用x±s表示, 作方差分析、 组间t检验处理, P＜0.05被认为有统计学差异。
　　2　结果
　　2.1　E2对NO释放的影响NO释放量用培养液和细胞内硝酸盐总量之和表示。与对照组比较,分别以10－12 、10－10及10－8 mol/L的E2处理BAECs48 h, 可使培养液和细胞内硝酸盐总量分别增加(12.2±5)%, (62.1±13)%和(97.38±8)% (n=4, p＜0.05)。分别以雌激素受体拮抗剂tamoxifen(10－7 mol/L)或NOS抑制剂L-NAME (10－6 mol/L)预处理BAECs 1 h后, 再加E2 (10－8 mol/L)处理48 h, BAECs产生的硝酸盐总量与单纯E2(10－8 mol/L)处理组相比分别减少(44.2±4)%及(48.7±4)%(n=4,P＜0.001),而单纯的tamo～xi～fen或 L-NAME 处理组的 bAECs 48 h产生的硝酸盐总量与对照组相比无明显差异(P＞0.05, 图1)。
　　图　1.　不同浓度17β-雌二醇对BAECs硝酸盐产量及L-NAME和tamoxifen对17β-雌二醇作用的影响
　　fig. 1.　Effect of 17β-estradiol (10－12,10－10, 10－8 mol/L) on the nitrate production in BAECs and effect of L-NAME and tamoxifen on the effect of 17β-estradiol.
　　2.2　E2对eNOS mRMA表达的影响
　　与对照组比较, 用E2 (10－8 mol/L)处理BAECs 1 h后即可见其eNOS mRNA表达丰度有所增加, 16 h后明显增加, 以48 h后表达丰度最强。用tamoxifen (10－7 mol/L)或L-NAME(10－6 mol/L)预处理BAECs 1 h后再以E2 (10－8 mol/L)处理48 h, eNOS mRNA表达低于单纯E2 (10－8 mol/L)处理组(图2、3)。
　　图　2.　17β-雌二醇对BAECs eNOS mRMA表达的影响
　　fig. 2.　Effect of 17β-estradiol (10－8 mol/L) on the expression of eNOS mRNA in cultured BAECs. RT-PCR for eNOS was per～formed in con～trol and17β-estradiol(E2)-treated cells. ENOS cDNA was evident at 443 bp. lane 1, lane 2, E2 10－8 mol/L, 1 lane 3, E210－8 mol/L, 16 lane 4, E2 10－8 mol/L, 48 lane 5, GAPDH; lane 6, marker.
　　图　3.　L-NAME及tamoxifen对17β-雌二醇诱导的BAECs eNOS mRMA表达的影响
　　fig. 3.　Effects of L-NAME (10－6 mol/L) and tamoxifen (10－7 mol/L) on the expression of eNOS mRNA induced by E2 (10－8 mol/L) in BAECs. Lane 1, lane 2, E2 10－8 mol/L,48 lane 3, tamoxifen 10－7 mol/L+E2 10－8 mol/L; lane 4, L-NAME 10－6 mol/L+E2 10－8 mol/L; lane 5, GAPDH; lane 6, marker.
　　2.3　E2对［Ca2+］i的影响
　　以10－8 mol/L的 E2处理BAECs, 不能迅速引起［Ca2+］i水平变化,增大浓度也无明显影响。E2 (10－8 mol/L)处理BAECs 48 h, 与对照相比, 其静息［Ca2+］i增加了70.3±21.5 nmol/l(n=4, P＜0.01),由ATP (10－4 mol/L)诱导的［Ca2+］i峰值增加了240.2±68.2 nmol/L (n=4, P＜0.001), ATP诱导的［Ca2+］i增加值(峰值与静息值之差)增加了170.5±48.9 nmol/L (n=4, P＜0.01, 图4)。
　　图　4.　　17β-雌二醇孵育48 h对BAECs静息钙浓度及ATP诱导的细胞内钙浓度增加值的影响
　　fig. 4.　Effect of 17β-estradiol on resting ［Ca2+］i and in～crease of ［Ca2+］i induced by ATP in BAECs after 48 h pretreatment.
　　3　讨论
　　近年来,许多研究认为雌激素的心血管保护作用可能与NO有关, 但其作用机制尚未完全阐明。本研究结果显示, E2在生理浓度范围内(10－12～10－8 mol/L)能浓度依赖性地增加BAECs的NO释放, 这与Hayashi等人报道的雌兔血管环的基础NO-依赖性舒张明显强于雄兔是一致的［9］,表明雌激素诱导血管内皮细胞释放NO是调节血管张力、保护血管内皮的一个重要机制。本实验观察到E2促进NO释放的作用能被NOS抑制剂L-NAME(10－6 mol/L)显著抑制, 提示NOS的激活是雌激素诱导BAECs释放NO的一个重要环节。NO在体内由L-精氨酸和分子氧在NOS的催化下产生,血管内皮细胞主要存在eNOS、iNOS两种异型体。17β-雌二醇可能通过eNOS及iNOS两种途径诱导NO释放［10］。但iNOS为诱导型NOS,其活性主要受CaM合成的调节, 细胞内钙对其影响不大［11］, 故本文未进行观察。而eNOS属构成型NOS, 其活性主要受细胞内Ca2+调节［2］。另外,17β-雌二醇诱导eNOS还是iNOS表达还与其浓度有密切关系。 如Michael等报道［13］, 17β-雌二醇低浓度主要诱导eNOS表达,高浓度则主要诱导iNOS表达。 本文所用17β-雌二醇浓度较低,主要是为了探讨近似生理浓度17β-雌二醇诱导血管内皮细胞一氧化氮释放的作用及其与细胞内钙的关系, 所以着重研究了eNOS的作用。目前关于雌激素对eNOS的影响报道不一,如Amy 等［13］已报道雌激素能促进胎牛肺动脉内皮eNOS mRNA转录和蛋白表达, Hayashi等发现在人脐静脉内皮细胞上,雌激素亦有类似作用［6］, 但Arnal等却未能证实雌激素可诱导BAECs eNOS表达［14］。本实验则进一步证明了E2(10－8 mol/L)可明显增加BAECs的eNOS mRNA的表达丰度, 以处理48 h最明显, 并可被L-NAME (10－6 mol/L)明显抑制, 这与本实验观察到的NO释放情况相符合, 提示雌激素可能促进BAECs中eNOS表达, 从而诱导NO合成及释放。
　　我们观察到, ER拮抗剂tamoxifen (10－7 mol/L)能明显抑制E2 (10－8 mol/L)诱导的BAECs中的NO释放［抑制率(44.2±4)%］和eNOS mRNA表达, 提示雌激素的这种作用至少是部分通过ER介导的。另外,细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)的变化与细胞的多种功能有关。许多研究提示, ［Ca2+］i升高是多种胞外刺激介导细胞核反应的中心环节。本实验采用荧光探针技术,观察到E2对BAECs ［Ca2+］i无即时效应, 但处理48 h后能明显增加静息［Ca2+］i和ATP诱导的［Ca2+］i升高,提示雌激素诱导BAECs释放NO可能与内钙动员有关。ATP参与许多细胞活动的调节, 特别是近年来发现内源性ATP是调控细胞内钙活动的重要物质［16］,目前研究认为, ATP介导的内皮细胞内钙浓度增加是介导NO合成及释放的重要环节［17］。本文主要探讨17β-雌二醇诱导血管内皮细胞一氧化氮释放及其与细胞内钙的关系,故选用ATP为钙释放的诱导剂。本研究表明, 雌激素可通过其受体介导BAECs［Ca2+］i增加, 这可能是其诱导eNOS表达及NO释放的重要机制。以往认为ER为核内受体,目前发现ER也有部分为膜受体, 雌激素究竟是直接作用于核内受体从而影响核内eNOS基因转录, 还是先作用于膜受体, 通过胞浆内一系列信号传导途径再影响eNOS的活性和表达,在本实验中还不能得出明确结论, 是我们将进一步研究的问题。
　　Project surpported by Government Grant for the Ministry of Health (No.)
　　王庭槐,潘敬运,Corresponding author. Tel: 020-; E-mail:王庭槐(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　杨丹(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　刘培庆(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　龚素珍(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　鲁伟(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　潘敬运(中山医科大学生理教研室, 广州 510089)
　　参　考　文　献
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