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大肠杆菌病
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定
中国人兽共患病杂志 1999年第3期第15卷 实验研究
作者：潘劲草　黄志成　余文炳　李学梅
单位：杭州市卫生防疫站（杭州，310006）
关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7；脂多糖；抗原
　　摘　要　目的　提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定，以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值。方法　应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原，并经超速离心纯化。提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性。LPS抗原致敏醛化鸡血球，IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清。对凝集阳性的抗血清，经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，确定抗血清与LPS的反应位置。结果　纯化后的O157 LPS抗原含多糖，具鲎试剂凝集活性，未检出核酸，蛋白含量＜0.5％。O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应，而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应，交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分，而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分。结论　热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强，可望应用于抗O157抗体的检测。O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性。
THE PREPARATION OF LIPOPOLYSACCHARIDE ANTIGEN OF
　　ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI O157∶H7 AND ITS IDENTIFICATION
Pan Jincao　Huang Zhicheng　Yu Wenbing　Li Xuemei
　　(Hangzhou sanitary and anti-epidemic station,Hangzhou,310006)
　　ABSTRACT　Aim The lipopolysaccharide(LPS) antigen of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC) O157∶H7 was prepared and identified to estimate the value of its application in detecting for anti-EHEC O157 antibody.Methods The LPS antigen was prepared from EHEC O157∶H7 strain 933 with hot phenol water method and purified by ultracentrifugation.The contents of polysaccharide,nucleic acid and protein in the extract and its activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate were detected.The antigen was used to detect EHEC O157∶H7 and other enteric pathogenic bacteria antisera by IHA.The reaction positions between LPS and the antisera having positive agglutinating reaction were identified by bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen inhibition test.Results The O157 LPS antigen contains polysaccharide and has activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate,in which nucleic acid has not been detected out and protein content is less than 0.5%(w/w).Anti-O157 polyclone and monoclone antibodies both react intensely to the O157 LPS antigen.There are no cross-reaction between the antigen and most antisera of other enteric bacteria,while cross-reactions are just found between the antigen and antisera of Salmonela O30,EIEC O144∶K?,ESISC Ⅳ.EHEC O157 and Salmonela O30 antisera react to polysaccharide of O157 LPS.EIEC O144∶K? and ESIECⅣ antisera react to lipid A of O157 LPS.Conclusion The O157 LPS antigen has high purity and reaction specificity.It could be used to detect anti-O157 antibody and reaction specificity may be raised further if lipid A is excluded from O157 LPS.
　　KEY WORDS　EHEC O157∶H7 LPS antigen
　　肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7菌的特异性O抗原位于其细胞壁外膜脂多糖(Lipoploysaccharide,LPS)的多糖侧链上。该菌感染患者，可诱导机体产生特异性抗O157抗体〔1，2〕。国外已有应用LPS抗原检测抗O157抗体以诊断EHEC O157感染的报告〔3〕。国内尚未见此方面工作的报道。本文提取纯化了EHEC O157∶H7的LPS抗原，并对其进行了初步鉴定，以探讨其用于抗O157抗体检测的价值。
　　1 材料与方法
　　1.1　菌株　EHEC O157∶H7 S型933株购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。
　　 1.2　O157 LPS的制备
　　 1.2.1　菌粉制备　细菌于普通营养琼脂37℃培养24h后，生理盐水洗下，按常规制成丙酮菌粉。
　　 1.2.2　O157 LPS粗制　热酚水法提取LPS〔4〕，步骤如下：菌液加等量90％苯酚溶液于68℃水浴中搅拌30min，冷却后5 000r/min离心45min，取水相。余下部分再加等量水，按上法重复提2次，离心后取水相。水相溶液装于透析袋中，流水透析24h去酚，再蒸馏水透析48h，每天换水5次。浓缩后加6倍量无水乙醇，置4℃ 20min,5 000r/min离心15min，沉淀即为粗制LPS。
　　 1.2.3　O157 LPS纯化　适量蒸馏水溶解提取的LPS，100 000×g超速离心4h，去上清，沉淀再加蒸馏水悬浮，再离心1次，沉淀即为LPS纯化品。
　　 1.2.4　O157 LPS的水解去脂　LPS溶于醋酸溶液，100℃水解30min,1 000r/min离心10min沉淀类脂，取上清置透析袋4℃透析去酸后，即为去脂质多糖抗原。
　　 1.3　O157 LPS鉴定
　　 1.3.1　LPS多糖含量测定　蒽酮硫酸法测定，以葡聚糖制作浓度标准曲线。
　　 1.3.2　LPS核酸含量检测　紫外光谱吸收法检测。
　　 1.3.3　LPS蛋白含量测定　考马斯亮蓝染色法测定，以BSA制作浓度标准曲线。
　　 1.3.4　LPS鲎试剂凝集活性测定　采用试管法。鲎试剂为湛江中美生物有限公司产品，灵敏度为0.5EU/ml，批号960726；细菌内毒素工作标准品为中国药品生物制品检定所，批号9703。取0.1ml鲎试剂加等量不同稀释度的LPS,37℃水浴1h，试管倒置180°凝胶不变形为阳性。同时以无热原水和内毒素工作标准品分别作阴性和阳性对照。
　　 1.3.5　O157 LPS间接血凝试验(IHA)检测肠道病原菌抗血清　O157 LPS抗原以最适量致敏醛化鸡血球，IHA法按常规〔5〕，致敏血球工作浓度为1％，血凝反应板为90°V型板。EHEC O157、EHEC H7、EIEC OK多价Ⅰ—Ⅱ及单价抗血清为中国药品生物制品检定所产品；EPEC、ETEC、EIEC的OK多价和单价血清及沙门氏菌O30和O30(2)为卫生部成都生物制品研究所产品；ESIEC Ⅰ—Ⅵ群血清为中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所产品；沙门氏菌A-F多价、志贺氏菌各种多价及单价血清为卫生部兰州生物制品研究所产品；霍乱弧菌O1群多价和O139血清为浙江省卫生防疫站产品。多价血清如凝集，再做相应单价血清。凝集血清再与未致敏醛化血球反应，以排除非特异性反应。
　　 1.3.6　O157 LPS血清反应位置确定　O157 LPS IHA凝集阳性血清作O157菌体抗原吸收、O157 LPS抗原抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，并设盐水处理对照；以比盐水处理对照低二个滴度以上，判为具吸收或抑制作用。同时凝集血清对EHEC O157 933株培养菌落作玻片凝集试验。
　　2 结果
　　2.1　O157 LPS产率　10g 933株菌粉获LPS 45.2mg，产率为0.45%(w/w)。
　　 2.2　O157 LPS多糖含量　蒽酮硫酸法测定多糖含量为20%(w/w)。
　　 2.3　O157 LPS核酸含量　未经超速离心纯化的粗制LPS于260nm处有一高吸收峰，经超速离心后的纯化LPS于260nm处未见吸收峰。
　　 2.4　O157 LPS蛋白含量　考马斯亮蓝染色法测定，蛋白含量＜0.5%(w/w)。
　　 2.5　鲎试剂凝集活性　鲎试验阳性的最低LPS浓度为2.5ng/ml。
　　 2.6　O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清　结果见表1。凝集阳性血清均不凝集未致敏醛化鸡血球。
表1　O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清的结果
　　Table 1　The results of detecting antisera of enteric bacteria by O157 LPS IHA
　　antisera
　　agglutinating
　　antisera
　　agglutinating
霍乱弧菌O1多价+O139
EPEC OK多价1
沙门氏菌A-F多价
EPEC OK多价2
沙门氏菌O30
EPEC OK多价3
沙门氏菌O30(2)
ETEC OK多价4
志贺氏菌4种多价
ETEC OK多价5
痢疾志贺氏3-7型多价
EIEC OK多价6
痢疾志贺氏8-12型多价
EIEC OK多价7
鲍氏志贺氏1-6型多价
EIEC OK多价Ⅰ
鲍氏志贺氏7-11型多价
EIEC OK多价Ⅱ
鲍氏志贺氏12-15型多价
EIEC OK多价ⅡO136∶K78
EIEC OK多价ⅡO143∶K?
EIEC OK多价ⅡO144:K?
EIEC OK多价ⅡO152:K?
EIEC OK多价ⅡO164∶K?
EHEC O157（多抗）
EHEC O157（单抗）
　　2.7　O157 LPS血清反应位置确定　O157 LPS IHA凝集血清的O157菌体抗原吸收及O157 LPS抑制和去脂质多糖抗原抑制试验结果见表2。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清玻片凝集933株阳性，O144∶K?及ESIEC Ⅳ抗血清玻片凝集阴性。
表2　O157菌体抗原吸收、O157 LPS和去脂质多糖抗原抑制试验结果
　　Table 2 The results of O157 bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen suppression test
　　antisera
　　agglutinating value
菌体抗原吸收
　　bacteria somatic
　　antigen
　　absorption
O157 LPS抑制
　　O157 LPS
　　antigen
　　suppression
去脂质多糖
　　抗原抑制
　　polysaccharide
　　antige suppression
　　NS control
O157（多克隆）
沙门氏菌O30
EIEC O144∶K?
　　3 讨论　　热酚水法是目前用于革兰氏阴性菌S型LPS提取的最常用方法。S型LPS是由脂质A、核心寡聚糖及特异多糖侧链组成，该分子为一两性分子，脂质A疏水，而多糖侧链具亲水性，故LPS和其它可溶于水的核酸、多糖等溶于水相，而大部分蛋白质则溶于酚相而被除去。随后超速离心可使LPS沉淀，与溶液中的核酸和多糖分开，从而得到较为纯净的LPS。本文应用此法提纯的EHEC O157 S型933株提取物含多糖，具鲎试剂凝集活性，为典型的革兰氏阴性菌LPS，紫外光谱吸收法未检出核酸，蛋白含量＜0.5％，纯度较高。
　　LPS的特异多糖侧链的糖残基种类和排列决定菌株O抗原的特异性。EHEC O157∶H7的O抗原即位于其LPS的多糖侧链上。O157 LPS IHA检测多种肠道病原菌抗血清，结果表明（表1），O157 LPS 与抗O157血清反应强烈，而与绝大多数其它肠道病原菌抗血清无交叉反应，仅与沙门氏菌O30、ESIECⅣ、EIEC O144∶K?抗血清有较强反应，与ESIECⅥ抗血清反应较弱。有资料表明〔6〕，EHEC O157与沙门氏菌O30抗原交叉，本文结果与此相符。EIEC OK多价6含O144∶K+抗血清，然而该OK多价6和其O144∶K+单价抗血清均未见与O157 LPS反应，表明二家单位生产的EIEC O144抗血清存在一定的差异。
　　玻片凝集试验表明，并非所有与O157 LPS反应的血清能使O157菌株凝集，提示LPS的提取可能使原先不在菌体表面表达的某些抗原决定簇得以暴露。为此我们通过弱酸水解，破坏LPS中多糖与脂质A间的糖苷链，离心除去不溶于水的脂质A，获取去脂质多糖抗原，并用该抗原与O157 LPS抗原同时进行凝集抑制试验以及用菌体抗原做吸收试验。结果表明（表2），菌体抗原吸收、去脂质多糖抗原及LPS抗原抑制均可使EHEC O157、沙门氏菌O30抗血清凝集效价降低，提示此二种抗血清含与O157 LPS多糖部分反应的抗体；而对ESIECⅣ及EIEC O144∶K?抗血清仅LPS具抑制作用，菌体抗原吸收和去脂质多糖抗原抑制则未能使其凝集效价降低，提示ESIECⅣ和EIEC O144∶K?抗血清与O157 LPS 反应位置为脂质A部分。此结果亦解释，二家单位EIEC O144抗血清对O157 LPS反应的不同是由于EIEC OK多价Ⅱ及其单价O144∶K?抗血清中未除去抗脂质A抗体所致。
　　本文结果表明，O157 LPS抗原可与特异性抗O157抗体发生反应，与其它肠道病原菌交叉反应较少，有望应有于IHA、ELISA等用以检测抗O157抗体。如使用去脂质多糖抗原，则可进一步提高反应特异性。
　　4 参考文献
　　1.Bitzan M,et al.High incidence of serum antibodies to Escherichia coli O157 lipopolysaccharide in children with haemolytic uraemic syndrome.J Pediatr,.
　　2.Chart H,et al.Serological identification of Escherichia coli O157∶H7 infection in haemolytic uraemic syndrome.Lancet,.
　　3.Bitzan M and Karch H.Indirect hemagglutination assay for diagnosis of Escherichia coli O157 infection in patients with hemolytic uremic syndrome.J Clin Microbiol,4-1178.
　　4.焦炳华主编.分子内毒素学.上海：上海科学技术文献出版社,.
　　5.韩澄源编著.间接血凝技术.北京：科学技术出版社,1979.89.
　　6.中国预防医学院流行病学微生物学研究所,O157∶H7大肠杆菌检验技术学习班讲义.北京,1996.25.
收稿日期：日　修回日期：日
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酱卫生标准 GB
大肠菌群，MPN/100mL ≤
致病菌（系指肠道致病菌）
不得检出 仅供参考
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食品就不太清楚了。
相关网站: 大肠杆菌O157: H7实验 诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现 出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。 血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。 大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经 大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。 在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。 大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题 我国情况也不容乐观 一、细菌培养与鉴定 1．分离培养 早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。 培养基： 山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂 改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC） 添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC） “科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基 四溴荧光亚甲基兰琼脂 H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液： 含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液 含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤 新生霉素MEC肉汤 月桂基胰蛋白胨肉汤 加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性 头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L 2．免疫磁珠分离法 免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。 方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠203.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。 Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。 Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。 Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。 目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。 典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下： 动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－） 与O157有鉴别意义的生化反应见表1。 MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测 1．玻片凝集试验 2. 胶体金免疫技术 3. ELISA 4．免疫荧光技术 5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA) 7. 全自动抗原抗体检测系统 8. 免疫印记法 1．玻片凝集试验 玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。 2. 胶体金免疫技术 胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。 胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。 胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。 中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。 3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。 Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。 Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。 4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析 此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。 直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间&2h。 5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA) 该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（&3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。 7. 全自动抗原抗体检测系统 VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。 基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法 目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。 特点是具有比较高的特异性和敏感性 。 免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。 1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照； 2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟； 3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时； 4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ； 6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相； 7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。 二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针 探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。 探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。 标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。 杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。 杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。 2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。 PCR技术扩增体系的基本成分 引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。 TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。 模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。 缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数 PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。 循环参数 1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。 循环参数 2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数 3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数 扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp 94℃变性时间（秒） 30 30 60 60 55℃复性时间（秒） 30 30 60 60 72℃延伸时间（秒） 30 38 120 180 一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。 PCR扩增产物的检测方法 PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。 PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术 增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术 PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用 (1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。 Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物： 正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。 徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。 PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用 （2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。 PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用 （3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。 4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用 传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。 23SrRNA基因特征： 原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。 应用： 检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。 鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。 在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。 除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂 G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ； 2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因； 3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高； 4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体． 小结 自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色
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