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急性髓系白血病M2型CD33~+/CD34~-细胞aptamers的筛选及结构分析
【摘要】：
背景与目的：急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)的诊断和分型,目前主要依据细胞形态学(Morphology, M)、免疫学(Immunology, I)、细胞遗传学(Cytogenetics, C)和分子生物学(Mole-cular Biology, M)相结合的MICM方法。但该方法仍不尽如意,存在不足之处。其主要原因是因为对AML发生与发展的机制,尤其是对白血病细胞特异性分子标记尚不十分清楚。近年来,随着指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术的发展和改进,筛选与肿瘤细胞相结合的特异性核酸适体(aptamer),并将其作为肿瘤分子诊断的特异性分子标记物已日益受到重视。然而,有关白血病细胞特异性的aptamer仍所知甚少。为此,本研究采用细胞SELEX(cell-SELEX, C-SELEX)技术筛选特异性识别AML-M2型白血病CD33+/CD 34-细胞的aptamer,为AML分子诊断提供基础。
方法：首先,合成两端含有固定序列、中间为随机序列的单链DNA(single strand deoxyribonucleic acid, ssDNA)文库,然后,以AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞为靶细胞,正常人CD33+/CD34-细胞为反筛选细胞,采用C-SELEX技术,体外反复筛选ssDNA文库的aptamer,并用PCR技术将其扩增生成次级ssDNA文库。在此期间,采用荧光标记引物PCR扩增,流式细胞术分析次级文库ssDNA文库aptamer的富集度。最后,克隆最终轮次的次级ssDNA文库。测序后,分析各aptamer的一级及二级结构。
结果：每轮筛选扩增的次级ssDNA文库经琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示清晰的DNA条带。经过13轮筛选,次级ssDNA文库与靶细胞结合的荧光强度从2.14%增加到51.12%,至第13轮趋于饱和,达到稳定状态。克隆后,挑选30个克隆子进行序列测定。分析结果显示,在其一级结构中含有AAGTA、TATCT、AGATG和AAATT四个保守序列,但8个aptamer无此保守序列,二级结构分析获得四种茎环、凸环模拟结构。
结论：采用C-SELEX技术,本研究成功筛选到与AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞特异性结合的aptamer,为今后进一步深入研究aptamer的特性以及白血病分子诊断提供了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：中南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：R733.71【目录】：
中文摘要5-7
英文摘要7-10
缩略词10-11
第一章 材料与方法14-19
1.1 实验材料14-15
1.1.1 实验对象14
1.1.2 主要试剂及配制14
1.1.3 实验仪器14-15
1.1.4 单链脱氧寡核苷酸ssDNA随机文库及引物15
1.2 方法15-19
1.2.1 单个核细胞分离15
1.2.2 CD33~+/CD34~-细胞的分选15-16
1.2.3 CD33~+/CD34~-细胞纯度分析16
1.2.4 aptamer筛选16-17
1.2.5 aptamer富集度检测17-18
1.2.6 aptamer克隆与测序18
1.2.7 aptamer结构分析18-19
第二章 实验结果19-30
2.1 CD33~+/CD34~-细胞纯度及回收率19-20
2.2 aptamer筛选结果20
2.3 aptamer富集度20-24
2.4 aptamer克隆与测序结果24-28
2.5 aptamer一级结构28-29
2.6 aptamer二级结构29-30
第三章 讨论30-33
第四章 结论33-34
参考文献34-40
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在线咨询：
传真：010-
京公网安备74号急性髓系白血病M2型
时间： 22:09:40
健康咨询描述：
胸骨痛，38度。其他症状无2010年元旦发病，
曾经的治疗情况和效果：
血常规检查血小板低到11，骨穿结果判断急性髓系白血病M2型，两个疗程缓解，现在已经过了第三个疗程，近亲血缘配型没有成功，想知道该病必须做移植才能根治吗
想得到怎样的帮助：已经做了三个化疗疗程，现在已经缓解，必须做移植才能根治吗（感谢医生为我快速解答——该。）
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病情分析：
您好！白血病的治疗一般是化疗与骨髓移植两种方法。指导意见：病情分析：
您好！白血病的治疗一般是化疗与骨髓移植两种方法。指导意见：
一般来说如果要达到根治就要进行骨髓移植，移植后也同样会有其他的一些问题，可能有免疫排斥反应。
您好大夫，配型没有成功，病人现在血常规正常，化疗恐怕病人身体不行，若改服中药可以吗？需要多少个疗程？
16:53医生回答：
化疗是会有一定的副作用，若中药效果较好也可以采用，具体疗程要看病情的缓解情况而定。
（点击按钮咨询医生，已有 1161 名网友免费获得解答）
您好：骨髓移植只是治疗白血病的方法之一，不是唯一。　　首先不是所有的白血病患者都要做骨髓移植，治疗白血病的方案主要有下列几类：化学治疗、放射治疗、现代中药含量为16.2%以上的人参皂苷Rh2（护命素）治疗。部分高危险性病人，需要进行骨髓移植。近10年来，随着分子生物学、生物遗传学的进展，使白血病预后得到极大的改观。尤其是现代中药人参皂苷Rh2能在辅助西医治疗的同时，减轻西药毒性反应，增强病人抵抗力，诱导癌细胞向正常细胞转化。可以说，正规、系统地治疗可以使大多数白血病患者长期无病生存，甚至痊愈。　　
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急性髓系白血病m2型严重程度？治疗费用为多少？
状态：就诊前
&副主任医师
可以到我院门诊确诊。
大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！
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梁蓉大夫的信息
血液病，尤其是白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等恶性血液病以及造血干细胞移植
梁蓉，女，副主任医师，副教授，医学博士,研究生导师。全国和全军血液学分会青年委员，省抗癌协会白血病分会...
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副主任医师
江苏省人民医院
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河南大学附属医院
好大夫在线电话咨询服务急性髓系白血病M2有哪些症状？_百度知道
问:急性髓系白血病M2有哪些症状？
权威医生回答
来自北京武警三院（三级甲等）
巨核细胞增殖受抑导致③发热&nbsp。&白血病髓外浸润常见的临床表现：多由于血小板减少，如果高于38度多有感染④白细胞瘀滞;急性白血病M2叫做急性髓系白血病部分分化型。&白血病大量增殖造成的症状主要有：由红细胞增殖受抑制造成②出血：①肝脾肿大②骨骼和关节痛，但多为低热：①贫血;&nbsp、盗汗;&nbsp：是高白细胞所致，白血病的症状表现在每个患者身上不完全相同：白血病本身可以出现发热，常分为白血病细胞大量增殖导致的症状和白血病细胞浸润造成的症状
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