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【求助】免疫组化半定量分析方法
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这个帖子发布于5年零293天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位高手，免疫组化做好之后如何对结果进行定量分析？
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可以对结果进行统计，或者用面积比就可以做柱形图分析。
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谢谢，我看文献里报道有用MOD平均光密度值来做统计分析的，请问一下，这个具体怎么操作？谢谢
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染色结果半定量分析:以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分，组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞标志。染色强度以多数细胞呈现的染色特性（染色深浅需与背景着色相对比）计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野（每400×高倍视野计数100个此类细胞）的阳性细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，&75%为4分。每张切片随机取5个400倍视野,每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分,染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。
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非常感谢您的热心解答，谢谢
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【求助】半定量RT-PCR的试验原理、步骤及应该注意的问题！
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这个帖子发布于11年零146天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教半定量RT-PCR的试验原理、步骤及应该注意的问题！
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半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
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逆转录-聚合酶链反应中文实验方法逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1．
随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2．
Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．
特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。二、 试剂准备1．RMA提取试剂2．第一链cDNA合成试剂盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．Taq DNA聚合酶三、操作步骤1. 总RNA的提取：见相关内容。2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System
for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer
25mM MgCl2
10mM dNTPmix
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。（4）于70℃加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。3．PCR： （1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA
上游引物（10pM）
下游引物（10pM）
10×PCR buffer
Taq 酶（2u/μl）
1μl（２）
加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。（３）
设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（４）
电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（５）
密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
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