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胃肠道淋巴瘤TCRγ基因重排分析及其意义
摘　要：胃肠道淋巴瘤是最常见的结外淋巴瘤之一,其诊断较为复杂,误诊率高.诊断通常要根据临床症状、形态学、免疫组织化学和分子生物学等综合判断.由于T细胞受体γ(TCRγ)基因重排发生在T细胞分化的早期,并且在两种不同表型的T细胞(αβ和γδ)中都存在TCRγ基因重排,因此,TCRγ基因重排成为检测淋巴瘤T细胞单克隆基因重排常用的靶基因.我们选用TCRγ通用引物,采用PCR、琼脂糖凝胶电泳及单链构象多态性分析(SSCP),检测并分析了40例胃肠道淋巴瘤基因重排的情况,探索这些方法在胃肠道淋巴瘤诊断和研究中的意义.
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非霍奇金淋巴瘤患者血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排的检测及临床意义
摘　要：目的检测非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体γ（TcRγ）基因克隆性重排并探讨其临床意义。方法提取74例NHL患者血浆游离DNA并以Globin基因确定其存在，通过PCR方法检测IgH（FR3A／VLJH）和TcRγ（TVG／TJX）克隆性基因重排，并分别与外周血单个核细胞DNA、病理组织学检查进行比较。结果74例患者中有58例（35例B-NHL和23例T-NHL）初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功，另16例临床缓解患者未提取出血浆游离DNA。35例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性31例（88．6％），无一例出现TcRγ基因单克隆重排，23例确诊的T-NHL患者中TcRγ基因单克隆重排阳性8例（34．8％），其中2例同时出现IgH基因单克隆重排。在50例同时获得病理活检标本基因重排结果的病例中，30例B-NHL患者血浆DNA IgH基因重排阳性26例（86．7％），病理活检标本阳性24例（80．0％）（P〉0．05）；20例T-NHL患者血浆DNA TcRγ基因重排阳性7例（35％），病理活检标本阳性6例（30％）（P〉0．05）。结论NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA；NHL患者血浆游离DNA IgH、TcRγ基因重排的检测简单、方便、相对无创，与病理活检标本的检测具有相同的临床意义。
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T淋巴瘤TCR&Vβ核酸疫苗的构建和生物学活性的初步检测
来源：青年人()&更新时间： 18:27:27 &【字体： 】
摘　要　目的： 制备T淋巴瘤TCR Vβ核酸疫苗。方法： 利用RT-PCR方法扩增出人T淋巴瘤细胞Jurkat 的TCR Vβ基因片段，并将其重组入真核表达载体pcDNA3。用重组表达载体转染SP2/0细胞，在mRNA水平上检测其表达。再用pcDNA3和重组载体分别免疫BALB/c小鼠，收集抗血清，用免疫组化技术检测抗体产生情况。结果： 扩增出TCR Vβ的基因片段，测序结果证实其序列与已发表的一致。并构建出重组表达载体pcDNA3-TCR Vβ。该质粒转染到SP2/0细胞，可在mRNA水平上检测到其表达。在用pcDNA3-TCR Vβ免疫的小鼠抗血清中检测到抗Jurkat细胞TCR Vβ的抗体。免疫组化结果表明，该血清不与表达TCR γδ的人T淋巴瘤细胞发生反应，而与转染该基因的SP2/0细胞产生强阳性反应。正常小鼠血清与pcDNA3免疫的小鼠血清与Jurkat细胞不产生显色反应。结论： 所制备的T淋巴瘤TCR Vβ核酸疫苗能有效地诱导机体产生体液免疫反应。关键词　核酸疫苗; 人T淋巴瘤; TCR Vβ《中国图书资料分类法》分类号　R730.51； R73-36
Construction of TCR Vβ Nucleic Acid Vaccine and Testing on Its Biological Effects
Zhang Jianzhi,Xu Zuoliang，He Zhongxiao (The School of Oncologe, Beijing Medical Univercity， Beijing 100036)
Abstract　Objective: To construct TCR Vβ nucleic acid vaccine. Methods: A fragment of TCR Vβ gene was amplified by RT-PCR from a human T lymphoma cell line, Jurkat, and cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3 by gene recombination. After sequencing, the recombinant plasmid was transfected into SP2/0 cells and its expression was detected on mRNA level. BALB/c mice were immunized with pcDNA3 and the recombinant plasmid by intramuscular routes. Antiserum was collected and detected by immunocytochemistry method. Results: A fragment of TCR Vβ gene from Jurkat cells was obtained and proved to be identical to published sequence. A recombinant plasmid pcDNA3-TCR Vβ was constructed. Its expression was detectable on mRNA level after being transfected into SP2/0 cells. Antiserum from mice immunized with pcDNA3-TCR Vβ reacted strongly with Jurkat cells and SP2/0 cells transfected by pcDNA3-TCR Vβ, while shows no reaction on CEM cells expressing TCRγδ and SP2/0 cells. Antisera from normal mice and mice immunized with pcDNA3 were both negative on Jurkat cells. The results of immunocytochemistry indicated that BALB/c mice immunized with pcDNA3-TCR Vβ produced specific antibody to Jurkat TCR Vβ. Conclusion: The TCR Vβ nucleic acid vaccine we constructed can induce humoral immunity.Key words　nucleic acid vaccine； human T lymphoma； TCR Vβ
　　核酸免疫［1］是90年代发展起来的一种全新的免疫技术。它是将编码某一蛋白抗原的基因转移到动物体内，使其在机体内表达形成蛋白抗原，诱导机体产生特异的免疫应答。相应的疫苗称为核酸疫苗。核酸疫苗可在体内表达抗原，能更有效地诱导细胞免疫和体液免疫，尤其是细胞毒T细胞反应。利用核酸免疫在新的环境下表达肿瘤特异性抗原或相关抗原，可能是打破免疫耐受，诱导肿瘤特异性免疫反应的一种有效方法。T淋巴瘤是某种重排的T细胞恶性增殖形成优势克隆的结果［2］，这种恶性增殖T细胞上特异的TCR可以看作肿瘤特异性或相关抗原，进而可通过核酸免疫的方法，诱导机体产生针对恶性增殖的T细胞克隆的免疫反应，从而达到预防和治疗T淋巴瘤的效果。1　材料与方法1.1　主要试剂　　各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，G418购自GIBCO公司；AMV逆转录酶购自Promega公司；DyNAzymeTMⅡ购自Finnzyme OY公司；RNasin,dNTP,Random Primer购自华美公司；PCR引物由赛百盛公司合成；盐酸布比卡因购自上海禾丰制药有限公司；鼠SP 试剂盒购自中山公司。1.2　载体、细胞株和实验动物　　人 T淋巴瘤细胞Jurkat 由中国医科院肿瘤所张叔人教授惠赠。人T淋巴瘤细胞CEM由北大医院朱平教授惠赠。小鼠B淋巴瘤细胞SP2/0由本室冻存。真核表达载体pcDNA3购自In Vitrogen公司。BALB/c小鼠购自中国医科院实验动物中心。1.3　人T淋巴瘤细胞Jurkat TCR Vβ基因片段的扩增1.3.1　RNA提取和cDNA合成　　用含10%FCS的RPIM 1640培养基培养Jurkat 细胞至足量，用RNAzol提取总RNA。用AMV逆转录酶和随机引物进行cDNA合成。1.3.2　PCR扩增TCR Vβ的基因片段　　根据Jurkat 细胞TCR Vβ的基因序列设计引物，上游引物序列为：5′-ACTAGGTACCATGATGATGCGGG GACTGGAGTTG-3′，下游引物序列为： 5′-AGTTGGATCCTTAGGCCTTTTGGGTGTGGGAGAT-3′，含Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点；预期产物长度为330 bp。25 μl体系中，分别含逆转录反应产物2.5 μl，dNTP各0.2 mmol/L,上、下游引物各0.5 mmol/L，10×buffer 2.5 μl, DyNAzymeTMⅡ 1U。PCR扩增程序为：94℃变性2 min，然后，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖电泳鉴定。1.4　重组载体的构建　　PCR产物和pcDNA3经Kpn Ⅰ和BamHⅠ双酶切后，回收酶切片段。用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E. coli DH 5α,提取质粒，进行双酶切鉴定。1.5　测序　　大量提取双酶切鉴定为正确的重组载体，PEG法纯化后由赛百胜公司测序。1.6　重组载体转染SP2/0细胞及RT-PCR鉴定其表达　　用含10%FCS的DMEM培养基培养SP2/0 细胞至足量，用磷酸钙沉淀法将重组载体pcDNA3-TCR Vβ转染SP2/0细胞，24 h后加200 μg/ml G418筛选培养14 d，挑取阳性克隆扩大培养。收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR，选取1株RT-PCR鉴定为阳性的细胞SP2/0-2p65进行免疫组化检测。1.7　动物实验　　参照文献［3］，选用4～6周龄的BALB/c小鼠，雌性，随机分为3组，每组10只。0.25%盐酸布比卡因注射后肢肌肉，24 h后，相同位点分别注射PBS, pcDNA3，pcDNA3-TCR Vβ，100 μg/只/次，隔3周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后3 d取尾血，收集抗血清，用Jurkat,SP2/0-2p65，SP2/0 和CEM细胞涂片进行免疫组化检测。待测血清1∶48稀释。操作程序参照鼠SP 试剂盒使用说明书。2　结　果2.1　人T淋巴瘤细胞Jurkat TCR Vβ基因片段的扩增　　结果见图1，可看到330 bp目的条带，与预期结果相符合。
图1　RT-PCR产物的电泳图谱Fig.1　RT-PCR products of Jurkat cells1： DNA marker (pBR322/Msp Ⅰ)； 2： Jurkat RT-PCR；3： Jurkat RT-PCR; 4： Negative control
2.2　重组载体的构建2.2.1　pcDNA3- TCR Vβ的构建过程，见图2。
图2　pcDNA3-TCR Vβ构建示意图Fig. 2　The construction of pcDNA3-TCR Vβ
2.2.2重组质粒的酶切鉴定。　　重组质粒pcDNA3-TCR Vβ用KpnⅠ 和SmaⅠ双酶切割，可得到4.2 kb和1.5 kb两个片段。而同样处理的载体pcDNA3，可得到4.2 kb和1.2 kb两个片段。1.5 kb条带和1.2 kb条带相差0.3 kb,这正是由于所克隆的TCR Vβ用基因片段插入造成的(见图3)。2.2.3　序列分析　　经测序证实，pcDNA3-TCR Vβ基因片段的序列与已发表［4］的一致。2.3　重组载体转染SP2/0细胞及RT-PCR鉴定其表达　　随机挑选3个克隆扩增培养后提取总RNA，RT-PCR均扩增出330 bp的条带。证明可从RNA水平上检测到TCR Vβ的表达(见图4)。
图3　pcDNA3-TCR Vβ酶切鉴定图谱Fig. 3　Restriction enzyme map of pcDNA3-TCR Vβ1： DNA marker (λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ)；2: pcDNA3/KpnⅠ+SmaⅠ；3： pcDNA3-TCR Vβ/Kpn Ⅰ+Sma Ⅰ
图4　RT-PCR法鉴定转染后SP2/0细胞TCR Vβ的表达Fig. 4　The expression of TCR Vβ in transfected SP2/0 cellsdeterminated by RT-PCR1： SP2/0； 2： SP2/0-2p65； 3： SP2/0-2p624： SP2/0-2p45; 5: DNA maker (pBR322/Msp Ⅰ)
2.4　动物实验　　结果如图5所示，只有用pcDNA3-TCR Vβ免疫的小鼠血清含有特异性抗TCR Vβ 抗体，在Jurkat细胞上呈阳性，pcDNA3和PBS对照组免疫血清在Jurkat细胞上呈阴性。pcDNA3-TCR Vβ免疫的小鼠血清在SP2/0细胞上呈阴性，在SP2/0-2p65细胞上呈阳性，在TCR为γδTCR的 CEM细胞上呈阴性。3　讨　论　　在本实验中，我们成功地构建了pcDNA3-TCR Vβ 真核表达质粒，体外转染证明，该重组质粒可在SP2/0细胞中表达，经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠，诱导机体产生了特异的抗TCR Vβ的抗体。体液免疫的产生足以证明我们构建的质粒确实能在动物体内表达TCR Vβ基因片段，并能诱发动物特异性免疫反应。
图5　免疫小鼠血清的免疫组化染色结果Fig. 5　Results of serum tested by immunocytochemical1： Se 2: Serum from mice immunized by pcDNA3;3～6： Serum from mice immunized by pcDNA3-TCR Vβ
　　核酸免疫能有效诱导细胞毒T反应和体液免疫，必然会在肿瘤的免疫治疗中发挥独特作用。淋巴瘤/白血病患者身体中病原性T，B细胞恶性增殖，这种恶性增殖的T，B细胞克隆可持续不断地表达独特型抗原。独特型抗原位于Ig和TCR的V区，与互补决定区和高变区密切相关。Jurkat细胞的TCR是αβTCR，β链V区属于Vβ8，我们分析了其基因序列，及Carcia KC［5］揭示的CDRs在肽链上的位置，选取第39～143位氨基酸的基因片段，构建成核酸疫苗，在小鼠体内能引起免疫反应，也证实了这段多肽具有免疫原性。利用核酸免疫方法制备的抗TCR Vβ8的抗血清还可用于人T淋巴细胞不同TCR Vβ的分类。据统计，淋巴瘤在肿瘤发生率中位居第八，且我国T淋巴瘤发病率也较欧洲高，利用核酸免疫方法研制出有效的治疗T淋巴瘤的核酸疫苗和诊断用抗体，将具有良好的临床应用前景。
张建芝（北京医科大学临床肿瘤学院　北京市肿瘤防治研究所　北京　100036）许佐良（北京医科大学临床肿瘤学院　北京市肿瘤防治研究所　北京　100036）何忠效（北京医科大学临床肿瘤学院　北京市肿瘤防治研究所　北京　100036）
参 考 文 献1，卢 山. 基因免疫. 上海免疫学杂志， 1997， 17(3): 1322，朱 平. 淋巴细胞的分子生物学研究与实践. 北京： 中国医药科技出版社， 1992. 933，Bin W, Ulgen KE, Sorikantan V, et al. Immunization of direct DNA inocullation induces rejection of tumor cell challenge. Hum Gene Ther, 74，Kabat EA, Wu TT, Perry HM， et al. Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed. USA: NIH Publication, 5，Garcia KC, Degano M, Stanfield RL， et al, An αβ T cell receptor structure at 2.5 A and its orientation in the TCR-MHC complex. Science, 1996， 274: 209
(收稿； 修回)
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