蛋白酶抑制剂剂DAPT的使用说明?

γ-secretase抑制剂阻断Notch信号通道抗胶质瘤新生血管的作用研究--《第二军医大学》2011年博士论文
γ-secretase抑制剂阻断Notch信号通道抗胶质瘤新生血管的作用研究
【摘要】:第一部分:Delta-like ligand 4在胶质瘤中的表达及临床意义
目的:Delta-like ligand 4 (DLL4)为Notch受体的配体,表达于血管内皮细胞上,本研究旨在探讨DLL4在脑胶质瘤中的表达及与微血管密度(Microvessel density,MVD)的关系。
方法:收集脑胶质瘤标本40例,分三组(Ⅰ级12例,Ⅱ级13例,Ⅲ-Ⅳ级15例),分别使用DLL4单克隆抗体、抗人CD31多克隆抗体行免疫组织化学染色,Image-Pro Plus 6.0软件分析DLL4光密度(optical density, OD)半定量分析DLL4表达,统计微血管数。
结果:各组DLL4蛋白OD值为Ⅰ级514.71±179.56,Ⅱ级961.97±88.53,Ⅲ-Ⅳ级5.35,p0.01;MVD值Ⅰ级24.75±10.33,Ⅱ级57.62±12.45,Ⅲ~Ⅳ级114.60±25.28,p0.01。DLL4的OD值与MVD的相关系数为γ=0.68(p0.01)。
结论:DLL4表达随胶质瘤恶性程度的升高逐步增加,与微血管密度密切相关,对判断胶质瘤的恶性程度及血供有指导意义。由于阻断DLL4的方法均难以在临床上有效应用,而γ-secretase抑制剂可特异性阻断DLL4的特异性受体Notch受体,以下我们将对γ-secretase抑制剂在抗胶质瘤新生血管上的作用及其机制展开研究。
第二部分:γ-secretase抑制剂对血管内皮细胞的作用
目的:研究表明Notch信号通路在血管生成及功能发育中有重要的作用。本研究旨在探讨y-secretase抑制剂阻断Notch信号通路后对血管内皮细胞VEGFR及细胞增殖的影响。
方法:1×106小鼠微血管内皮细胞H5V置于含5μmol/Lγ-secretase抑制剂DAPT的培养液中培养6小时,设相同浓度的溶剂DMSO为对照组,6小时后收集蛋白以Western blotting测定NICD、Hes1、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3蛋白含量;收集RNA测定VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的mRNA含量;1×104 H5V细胞分别置于含DMSO, DMSO+VEGF-A164, DAPT,或DAPT+VEGF-A164的培养液中培养,DAPT及VEGF-A164终浓度为5μmol/L和10ng/ml,每24小时更换培养液,72小时后以细胞分析计数仪计数细胞数目。
结果:5μmol/L DAPT能有效抑制NICD、Hes1的蛋白表达,阻断Notch信号通路;DAPT组血管内皮细胞VEGFR1蛋白表达量下调,mRNA量是对照组的29%;VEGFR2蛋白表达上调,mRNA量为对照组的3.16倍;DAPT和DMSO组VEGFR3蛋白及mRNA表达无明显差别。DAPT与VEGF合用能促进H5V细胞增殖,细胞数较VEGF组及对照组明显增加,而单独应用则无促进作用。
结论:y-secretase抑制剂能有效阻断Notch信号通路;y-secretase抑制剂通过调节VEGF受体表达影响VEGF信号通路;y-secretase inhibitor增强VEGF对血管内皮细胞的增殖作用。
第三部分:y-secretase抑制剂影响血管功能发育抑制胶质瘤生长
目的:胶质瘤是颅内恶性程度极高的常见肿瘤,本课题旨在研究y-secretase抑制剂在胶质瘤抗血管治疗中的作用及机制。
方法:10×106胶质瘤U87MG细胞溶于200μl无血清DMEM中,皮下注射裸鼠背部皮下构建胶质瘤肿瘤模型,1周后DAPT(100mg/kg/day)皮下注射给药,以相同量DMSO皮下注射设为对照组,每5日测量肿瘤大小,25日后处死裸鼠,免疫组织化学染色测定肿瘤VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达量,CD31抗体染色测量肿瘤血管密度、血管大小;模型裸鼠尾静脉注射15mg/kg荧光染料Hoechst33342,1分钟后处死,荧光定量肿瘤灌注情况;模型裸鼠处死前1小时腹腔注射60mg/kg缺氧探针Hypoxyprobe-1,处死后取肿瘤以Monoclonal anti-Hypoxyprobe antibody免疫荧光测量肿瘤缺氧情况。以Image-Pro Plus 6.0 software作半定量数据分析。
结果:实验组VEGFR1表达量较对照组减低,VEGFR2较对照组升高,而VEGF表达量两组间无明显差别;实验组血管密度为对照组的2.45倍,而血管较细小,肿瘤灌注Hoechst 33342面积明显减少,缺氧面积明显增加,肿瘤大小较对照组明显下降,两组间统计学差异明显(P0.01)。实验组血管管腔中充填有增生的内皮细胞样异常细胞,而对照组则未发现此类异常细胞在管腔中存在。
结论:γ-secretase抑制剂促进肿瘤血管发生,却抑制肿瘤血管的功能发育,通过打破血管发生与功能发育的协调,抑制胶质瘤的生长。因此,γ-secretase抑制剂有望成为胶质瘤抗血管治疗的新药物。
【关键词】:
【学位授予单位】:第二军医大学【学位级别】:博士【学位授予年份】:2011【分类号】:R739.41【目录】:
中文摘要5-8
英文摘要8-11
缩略词表11-12
参考文献15-17
第一部分 Delta-like ligand 4在胶质瘤中的表达及临床意义17-31
材料与方法19-23
参考文献29-31
第二部分:γ-secretase抑制剂对血管内皮细胞的作用31-47
材料与方法32-37
参考文献44-47
第三部分:γ-secretase抑制剂影响血管功能发育抑制胶质瘤生长47-73
材料与方法48-57
参考文献70-73
全文总结73-74
综述一74-92
参考文献82-92
综述二92-104
参考文献97-104
在读期间发表论文104-105
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